CN114507704B - 微生物药物敏感性的快速检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物药物敏感性的快速检测方法及检测试剂盒。检测试剂盒包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；细菌富集器包括纤维分离膜和易拆卸滤头。检测方法包括：将待检微生物样品和各种抗菌剂混合后加入无菌培养基，并置于35‑37℃恒温震荡培养2‑4h；使用细菌富集器分离富集液体培养基内的细菌；取出细菌富集器内的纤维分离膜，并将富集有微生物的分离膜置于空白无菌反应器中；向反应容器中加入细菌显色剂进行显色反应，然后检测液体的吸光度值，通过吸光度值高低评价微生物的药物敏感性。本发明通过对纤维分离膜的改进，显著提高了细菌分离富集效率和截留率，从而提高药物敏感性检测速度和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种微生物药物敏感性的快速检测方法及检测试剂盒。
背景技术
细菌感染是临床中普遍存在的问题，细菌感染后给予抗生素治疗是临床治疗中最常见的方法。某种抗生素并不会对所有细菌有效，只能对某一菌种或者某类菌种有效。因此，微生物药物敏感性的检测对于合理使用抗生素，有着极为重要的积极意义。
现有的细菌敏感性检测一般依赖于传统的平板培养法，虽然检测结果准确度高，但是耗时长，单次检测结果一般需要3-5天，甚至长达7天。冗长的检测时间使其对临床治疗的指导意义大打折扣。在药敏检测结果确定前，药物治疗方案缺乏针对性。为尽快控制患者病情，往往多种抗生素联用。这加重了细菌耐药性的产生，也给患者带来了更多的药物副作用。通过细菌富集和发光试剂检测是一种快速有效的方法，该方法是通过富集膜先将细菌富集收集，然后统一检测，能够提高单位体积内的细菌含量，从而提高检测灵敏度。但是该方法的检测准确度与富集膜上富集的细菌含量密切相关，如果富集膜富集的细菌含量与原始细菌含量相差较大，则测出的细菌浓度也将与理论浓度产生较大偏差，导致测试真实性降低。现有技术中的细菌富集膜还存在富集效果不佳、显色反应速度慢、灵敏度低等问题，进而导致富集检测效果不佳。
有鉴于此，有必要设计一种改进的微生物药物敏感性的快速检测方法及检测试剂盒，以解决上述问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物药物敏感性的快速检测方法及检测试剂盒。本发明通过将耐药性培养后的细菌富集在分离膜上，同时破坏细菌细胞结构，以使细胞内的脱氢酶释放，然后利用CCK-8检测试剂与脱氢酶的快速显色反应，判断细菌含量，进而判断细菌药物敏感性，分离膜的分离富集效率高，显色反应速度快，因此检测速度快，灵敏度高。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种微生物药物敏感性的快速检测方法，包括如下步骤：
S1.将待检微生物样品在含有抗菌剂的培养基中恒温培养2-4h，得到菌液；
S2.用纤维分离膜对步骤S1中得到的所述菌液进行过滤富集，将富集了所述待检测微生物的纤维分离膜置于空白的无菌反应器中，然后加入CCK-8显色剂进行显色反应，反应完成后测试吸光度值；所述纤维分离膜为阳离子改性纤维分离膜，由上至下包括孔径为1um-2um和200nm-450nm的纤维膜；
S3.根据吸光度值的大小得到所述菌液中微生物含量的大小，进而得出所述待检微生物样品对所述抗菌剂的药物敏感性。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述阳离子改性纤维分离膜的表面改性分子为以下结构式中的一种或多种：
作为本发明的进一步改进，所述表面改性分子为：
式中，n为4-8的正整数，且所述纤维分离膜由上至下的表面改性分子的n值逐渐减少。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述纤维分离膜由上至下依次由孔径为1.5um-2um、1um-1.5um、350nm-450nm、250nm-350nm、和200nm-250nm的五层纤维膜热压而成。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述显色反应的时间为1-4h，温度为30-40℃。
作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述培养基为酵母膏胨葡萄糖培养基。
作为本发明的进一步改进，所述酵母膏胨葡萄糖培养基包括：将酵母膏和蛋白胨溶于去离子水中，高压和121℃下处理20分钟，然后加入葡萄糖溶液；其中，所述酵母膏的含量为(0.5-1.5)wt％，所述蛋白胨的含量为(1.5-2.5)wt％，所述葡萄糖的含量为(1.5-2.5)wt％。
作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述待检微生物样品与所述培养基的体积比为1:(50-150)。
一种微生物药物敏感性的快速检测试剂盒，包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；所述细菌富集器包含以上任一项所述的纤维分离膜和可拆卸滤头。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的微生物药物敏感性的快速检测方法，采用改进的纤维分离膜对进行耐药培养后的菌液进行过滤富集，然后通过CCK-8进行快速显色反应检测细菌浓度，进而根据细菌耐药培养的生长情况判断出细菌对相应抗菌剂的药物敏感性。如此操作，直接通过CCK-8检测试剂即可快速获得检测结果，药敏检测时间缩短至4-7h，检测的过程简便快捷，耗时短，省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差，对临床治疗用药可以给予良好的指导作用。
2.本发明对纤维分离膜的孔径进行梯度设计，由上至下的孔径逐渐降低，同时对纤维膜进行阳离子类抗菌剂改性。如此设置，一方面微生物表面带负电荷，阳离子改性后的纳米纤维膜可以通过正负电荷相互作用，主动捕获吸附微生物；另一方面，梯度降低的纤维孔径能够对不同直径的细菌进行高效梯度吸附拦截，减少细菌堵塞纤维孔的可能性，降低富集细菌的阻力，减少纤维膜出现“破点”导致检测失败的可能性；最后，最底层的小孔径还能保证细菌的绝对截留，无细菌漏过，影响检测准确度。
3.本发明对纤维分离膜的孔径以及阳离子类抗菌剂的烷基链长度同时进行梯度设计，将多孔结构的拦截效果与阳离子类抗菌剂对细菌的吸附和杀灭作用进行良好结合，能够显著提高细菌拦截率，并加快脱氢酶的溶出速率，从而提高检测速率和准确度。
附图说明
图1为本发明微生物药物敏感性的快速检测方法流程示意图。
图2为细菌富集器的结构示意图。
图3为实施例1中纤维分离膜的结构示意图。
图4为纤维分离膜的纤维分布横截面结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在具体实施例中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
请参阅图1-3所示，本发明提供的一种微生物药物敏感性的快速检测方法，包括如下步骤：
S1.将待检微生物样品在含有抗菌剂的培养基中恒温培养2-4h，得到菌液；
在步骤S1中，培养基为酵母膏胨葡萄糖培养基。待检微生物样品为细菌或真菌样品，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌等。
所述酵母膏胨葡萄糖培养基包括：将酵母膏和蛋白胨溶于去离子水中，高压和121℃下处理20分钟，然后加入葡萄糖溶液；其中，所述酵母膏的含量为(0.5-1.5)wt％，优选为1wt％；所述蛋白胨的含量为(1.5-2.5)wt％，优选为2wt％；所述葡萄糖的含量为(1.5-2.5)wt％，优选为2wt％。抗菌剂的含量为0.5％-5％。
具体地，可先用细胞计数仪检测待检微生物样品的初始细菌浓度，然后用PBS以1:10的比例稀释为不同浓度。PBS的制备包括：0.2gKCl，0.2gkH2PO4，8gNaCl，2.88gNa2HPO4.12H2O，加入1升去离子水溶解。
所述待检微生物样品与所述培养基的体积比为1:(50-150)，优选为1:100。
此步骤的目的是将待检微生物样品(液体样品)在含有抗菌剂的培养基中培养，测定该抗菌剂对细菌的抗菌活性，如果细菌对该抗菌剂产生了耐药性，则细菌生长状况良好，反之细菌生长会受到抑制。抗菌剂选自青霉素类抗生素或者季铵盐类抗菌剂，如6-氨基青霉烷酸等院内感染治疗常用抗菌药物。
S2.用纤维分离膜对步骤S1中得到的所述菌液进行过滤富集，将富集了所述待检测微生物的纤维分离膜置于空白的无菌反应器中，然后加入CCK-8显色剂(细胞计数试剂，含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量)进行显色反应1-4h，温度为30-40℃，反应完成后测试波长为450nm处的吸光度值；纤维分离膜为阳离子改性纤维分离膜，由上至下包括孔径为1um-2um和200nm-450nm的纤维膜；纤维分离膜的孔隙率为40％-80％。此范围段的纳米纤维膜最有利于细菌的富集，当孔径小于200nm时，孔隙率低于40％，过滤细菌时阻力太大，不利于高效富集细菌；当孔径大于450nm时，因为孔隙率高于80％，细菌截留率降低，不适用于富集浓度较低的细菌，所以适用范围太小，因此，最佳的孔径范围为200nm-450nm。
优选地，如图3和4所示，纤维分离膜由上至下依次由孔径为1.5um-2um、1um-1.5um、350nm-450nm、250nm-350nm、和200nm-250nm的五层纤维膜热压而成。如此设置，在富集细菌时可以实现高拦截、低阻力的目标。因为加厚的富集膜可以保证细菌的流通通道变长，在阳离子改性基础上，梯度降低的纤维孔径能够对不同直径的细菌进行高效梯度吸附拦截，减少细菌堵塞纤维孔的可能性，降低富集细菌的阻力，减少纤维膜出现“破点”导致检测失败的可能性；最后，最底层的小孔径还能保证细菌的绝对截留，无细菌漏过，不会影响检测准确度；与此同时，能够拦截细菌破碎后碎片以及释出的脱氢酶，防止脱氢酶流出，如此保证了细菌的高效拦截，并促使细菌细胞破裂，提高后续显色反应的速度和准确度。
在步骤S2中，阳离子改性纤维分离膜的表面改性分子优选为季铵盐或季磷盐，如以下结构式中的一种或多种：
季铵盐、季磷盐的作用原理主要是阳离子通过静电力、以及季铵盐、季磷盐表面的烷基链与蛋白质分子间的疏水结合等作用，吸附带负电的细菌体，聚集在细胞壁上，产生室阻效应，导致细菌生长受抑制而死亡；同时其憎水烷基还能嵌入细菌的膜壁结构内，改变膜的通透性，继而发生溶胞作用，破坏细胞结构，有利于细胞内脱氢酶的释放，从而有助于加快后续脱氢酶与显色剂的反应，从而缩短检测时间。表面改性分子可利用改性分子上羟基的活性，根据纤维膜基材的结构特点，通过酯化反应、取代反应等成熟的化学改性方法实现对纤维细菌富集膜的改性。
更优选地，所述表面改性分子为：
式中，n为4-8的正整数，且所述纤维分离膜由上至下的表面改性分子的n值逐渐减少。如此设置：n逐渐降低，其改性的纤维膜亲水性会增加；至上而下膜的亲水性逐渐增加，有利于加速水相液体的透过。本发明烷基链的长度对富集效果影响显著，烷基链太短，与细菌的反应不够充分；烷基链太长，不利于快速检测，因此，最佳烷基链长度为4-8。
阳离子改性纤维分离膜可以通过将表面改性分子化学接枝改性，或者浸渍吸附或涂覆改性。
S3.根据吸光度值的大小得到所述菌液中微生物含量的大小，进而得出所述待检微生物样品对所述抗菌剂的药物敏感性。细菌含量越大，说明对步骤S1中的耐药性越强，因此生长不受抑制。
通过采用上述技术方案，本发明的细菌分离富集速率快、富集效果好，显色反应也仅需2h左右，整个药物敏感性检测时间在8h以内，检测速率快，相比传统的平板培养法，显著缩短了药物敏感性检测时间，对临床治疗用药可以给予良好的指导作用。
一种微生物药物敏感性的快速检测试剂盒，包括无菌液体培养基、细菌富集器(如图2所示)、细菌显色剂和检测反应空白容器；所述细菌富集器包含以上任一项所述的纤维分离膜和可拆卸滤头。其易于拆卸的滤头结构设置有拉环，可直接拉开。该快速检测试剂盒的检测过程为：1)使用细菌富集器分离富集待测样品；2)破除分离器外壳；3)将富集有细菌的分离膜置于空白无菌反应容器中；4)向反应容器中加入细菌显色剂并继续培养2h；5)检测步骤4中液体的吸光度，通过吸光度高低评价细菌的药物敏感性。
实施例1
一种微生物药物敏感性的决速检测方法，包括细菌培养和细菌检测，具体包括如下步骤：
(1)配置酵母膏胨葡萄糖培养基：将10g酵母膏和20g蛋白胨溶于900mL的去离子水中，高压121℃处理20分钟，然后加入100mL 20g葡萄糖(葡萄糖溶液灭菌后加入)。
(2)PBS的制备：0.2gKCl，0.2gKH2PO4，8gNaCl，2.88gNa2HPO4·12H2O，加入1升去离子水溶解。
(3)在250mL的锥形瓶中加入100mL培养基和1mL金黄色葡萄球菌，加入待检测敏感性的季铵盐类抗菌剂混合培养3h，用细胞计数仪检测菌液的初始浓度，然后用PBS以1:10的比例稀释为105、104、103和102。
(4)用纤维分离膜(直径为2.5cm)过滤经步骤(3)培养后的10mL菌液，然后取出富集了所述待检测微生物的纤维分离膜，放入一个离心管中，同一浓度平行做三组，加入4mL(保证滤膜完全浸入溶液中)CCK-8溶液(用PBS以1:3的比例稀释)，在35.5℃恒温培养箱中反应2h，然后测450nm处的吸光度值。通过吸光度值判断出耐药培养后的细菌浓度，然后与初始浓度比较，从而得出细菌在抗菌剂中的生长情况，进而确定细菌是否对该抗菌剂具有耐药性。
其中，实施例1采用的纤维分离膜为由上至下依次由平均孔径为1.5um、1um、400nm和300nm的三层纤维膜热压而成，每一层纤维膜均经过下式所述结构的双季铵盐改性：
其中，n为6。
实施例2
一种微生物药物敏感性的决速检测方法，与实施例1相比，不同之处在于，纤维分离膜为由上至下依次由平均孔径为1.5um、1um、400nm、300nm和220nm的五层纤维膜热压而成。其他与实施例1大致相同，在此不再赘述。
实施例3
一种微生物药物敏感性的决速检测方法，与实施例2相比，不同之处在于，纤维分离膜为由上至下的双季铵盐中n依次为8、7、6、5、4。其他与实施例2大致相同，在此不再赘述。
实施例4
一种微生物药物敏感性的决速检测方法，与实施例2相比，不同之处在于，纤维分离膜为由上至下依次由平均孔径为400nm、300nm和220nm的三层纤维膜热压而成。其他与实施例2大致相同，在此不再赘述。
测试菌液通过纤维分离膜的有效滤除体积(即允许滤过的最大菌液体积)以及细菌截留率(通过测试菌液过滤前后的浓度得出)，将本发明通过膜富集然后CCK-8显色反应测定的细菌浓度与直接通过细胞计数仪检测检测耐药培养后的菌液浓度进行比较，得到细菌浓度检测偏差率，从而判断本发明富集测试的准确度。测试结果如表1所示。
表1实施例1-4的测试结果
从表1可以看出，至上而下孔径逐渐降低的多层膜物理结构设计，和不同层间不同的化学结构改性设计，有利于提高对待测样品细菌的有效富集，提高检测的准确率。
实施例1中纤维分离膜仅包括3层孔径梯度降低的纤维膜时，有效滤除体积较大，说明孔不易被堵塞，但对滤过的28mL菌液中的细菌截留率偏低，导致细菌浓度检测误差增大。
实施例2中纤维分离膜增至5层，有效滤除体积略有减小，这是因为层数增加，阻力增大，因此滤过26mL菌液后，菌液即无法再通过纤维膜，但实施例2的细菌截留率高达100％，说明基本能够对滤过的26mL菌液中的细菌进行完全截留，从而显著提高检测准确率。
实施例3进一步对双季铵盐中的烷基数进行梯度设计，使得有效滤除体积显著增大，说明此种设计能够减小孔堵塞速率；在细菌截留率也高达100％的情况下，有效滤除体积的增大，使得纤维分离膜上富集的细菌量增大，从而进一步提高细菌检测准确度。
实施例4中，去除上层微米级纤维分离膜，法限有效滤除体积显著降低，最终导致检测误差显著增大。说明上层设计的微米级纤维分离膜能够先富集一部分细菌，减小纳米级纤维分离膜的富集负担，从而降低其堵塞速率，最终使得有效滤除体积和截留率均得到提高。
综上所述，本发明采用改进的纤维分离膜对进行耐药培养后的菌液进行过滤富集，然后通过CCK-8进行快速显色反应检测细菌浓度，进而根据细菌耐药培养的生长情况判断出细菌对相应抗菌剂的药物敏感性。如此操作，直接通过CCK-8检测试剂即可快速获得检测结果，药敏检测时间缩短至4-7h，检测的过程简便快捷，耗时短，省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差，对临床治疗用药可以给予良好的指导作用。对纤维分离膜的孔径以及阳离子类抗菌剂的烷基链长度同时进行梯度设计，将多孔结构的拦截效果与阳离子类抗菌剂对细菌的吸附和杀灭作用进行良好结合，能够显著提高细菌拦截率，并加快脱氢酶的溶出速率，从而提高检测速率和准确度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种非疾病诊断及治疗目的的微生物药物敏感性的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将待检微生物样品在含有抗菌剂的培养基中恒温培养2-4h，得到菌液；
S2.用纤维分离膜对步骤S1中得到的所述菌液进行过滤富集，将富集了所述待检测微生物的纤维分离膜置于空白的无菌反应器中，然后加入CCK-8显色剂进行显色反应，反应完成后测试吸光度值；所述纤维分离膜为阳离子改性纤维分离膜；所述纤维分离膜由上至下依次由孔径为1.5um-2um、1um-1.5um、350nm-450nm、250nm-350nm和200nm-250nm的五层纤维膜热压而成；
S3.根据吸光度值的高低得到所述菌液中微生物浓度的高低，进而得出所述待检微生物样品对所述抗菌剂的药物敏感性；
在步骤S2中，所述阳离子改性纤维分离膜的表面改性分子的结构式为：
；
式中，n为4-8的正整数，且所述纤维分离膜由上至下的表面改性分子的n值逐渐减少。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断及治疗目的的微生物药物敏感性的快速检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述显色反应的时间为1-4h，温度为30-40℃。
3.根据权利要求1所述的非疾病诊断及治疗目的的微生物药物敏感性的快速检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述培养基为酵母膏胨葡萄糖培养基。
4.根据权利要求1所述的非疾病诊断及治疗目的的微生物药物敏感性的快速检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述待检微生物样品与所述培养基的体积比为1:(50-150)。
5.一种微生物药物敏感性的快速检测试剂盒，其特征在于，包括无菌液体培养基、细菌富集器、细菌显色剂和检测反应空白容器；所述细菌富集器包含权利要求1至4中任一项所述的纤维分离膜和可拆卸滤头。
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