CN116098914B - 一种组合物及防治嗜麦芽窄食单胞菌的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组合物及防治嗜麦芽窄食单胞菌的药物，属于有害菌防治技术领域。本发明的组合物含有黄芩苷和β‑内酰胺类抗生素，组合物中黄芩苷和β‑内酰胺类抗生素的质量比为64:1。该组合物对嗜麦芽窄食单胞菌具有较好的抑菌效果，能够显著降低单一药剂的使用量，具有协同增效作用。因而，在耐药性嗜麦芽窄食单胞菌防治方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于有害菌防治技术领域，具体涉及一种组合物及防治嗜麦芽窄食单胞菌的药物。
背景技术
嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)是一种需氧非发酵型革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界及医院环境中，也可定植于人体呼吸道、消化道、泌尿道等部位。最为常见的疾病如嗜麦芽窄食单胞菌性肺炎，还可引起尿道感染、伤口感染或脑膜炎、菌血症、医源性败血症、心内膜炎等。临床治疗S.maltophilia的手段是使用各种抗生素，但S.maltophilia对多种抗生素均呈现耐药性且耐药性强，例如β-内酰胺类抗生素，这种多重耐药性会引起严重的疾病，如外科伤口感等，这已经成为困扰临床的重要问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种组合物及防治嗜麦芽窄食单胞菌的药物。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
黄芩苷在制备防治嗜麦芽窄食单胞菌的药物中的应用。
黄芩苷在制备防治由嗜麦芽窄食单胞菌引起的疾病的药物中的应用。
一种组合物，含有黄芩苷和β-内酰胺类抗生素。
在一个具体的实施例中，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄青霉素。
在一个具体的实施例中，所述的组合物中黄芩苷和β-内酰胺类抗生素的质量比为64:1。
上述的组合物在制备防治嗜麦芽窄食单胞菌和/或由嗜麦芽窄食单胞菌引起的疾病的药物中的应用。
一种用于防治嗜麦芽窄食单胞菌和/或由嗜麦芽窄食单胞菌引起的疾病的药物，含有上述的组合物；所述药物还包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质，所述药物的剂型选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
本发明技术方案的优点：
本发明中黄芩苷能够显著降低嗜麦芽窄食单胞菌对β-内酰胺类抗生素(尤其是氨苄青霉素)的耐药性，且黄芩苷与氨苄青霉素联用对嗜麦芽窄食单胞菌具有较好的抑菌效果，能够显著降低单一药剂的使用量，具有协同增效作用。因而，黄芩苷与氨苄青霉素联用在耐药性嗜麦芽窄食单胞菌防治方面具有重要意义。
附图说明
图1黄芩苷抑制嗜麦芽窄食单胞菌平板结果；
图2黄芩苷抑制嗜麦芽窄食单胞菌的菌落个数；
图3黄芩苷(6mg/mL)处理S.maltophilia核酸泄漏；
图4黄芩苷(6mg/mL)处理S.maltophilia K+泄漏(A：K+工作浓度标曲，B：OD766.5nm细菌吸光度值，C：黄芩苷处理30min细菌K+浓度)；
图5黄芩苷对S.maltophilia氧化应激损伤；
图6黄芩苷对S.maltophilia作用的显微结构观察；
图7黄芩苷对S.maltophilia细胞膜通透性影响；
图8黄芩苷对S.maltophilia生物膜的影响。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)购自美国ATCC公司，菌种号ATCC17666。
实施例1
一种用于防治嗜麦芽窄食单胞菌和/或由嗜麦芽窄食单胞菌引起的疾病的组合物，包含黄芩苷和β-内酰胺类抗生素，所述的β-内酰胺类抗生素为氨苄青霉素；所述的组合物中黄芩苷和β-内酰胺类抗生素的质量比为64:1。
实施例2
黄芩苷对嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)的抑制作用
1、抑菌试验(平板计数法)
将菌种保藏盒中嗜麦芽窄食单胞菌接种到SCDLP肉汤中，在30℃，150rpm的恒温水浴箱中震荡培养48h。取一定量的菌液在4℃条件下离心10min，保留沉淀物，用PBS(0.01mol/LPH 7.4)清洗，相同条件下离心，弃上清，重复三次。PBS复溶得菌悬液，稀释浓度至1×104CFU/mL。
将SCDLP液体培养基与琼脂粉(12％)按比例混合得到SCDLP固体培养基，使用前加热使之融化，加入黄芩苷粉末混合，使黄芩苷终浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL，随后混合溶液倒入一次性平板中，不添加黄芩苷的培养基中加入DMSO作为阴性对照组，每平板倾倒30mL，各浓度实验设置三平行，待平板凝固后，分别滴入100μL浓度为1×104CFU/mL的嗜麦芽窄食单胞菌菌悬液涂布，30℃条件下培养48h。
不同浓度黄芩苷对S.maltophilia的抑菌结果如图1和图2所示。图1第一排从左到右依次是含有DMSO、2mg/mL、4mg/mL黄芩苷的涂布平板图片，第二排从左到右依次是含有6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL黄芩苷的涂布平板图片，由图1可以看出，与DMSO组相比，含有黄芩苷的固体平板上的菌落总数要少，并且随着黄芩苷浓度的增加，菌落数不断减少，证明黄芩苷可以显著抑制S.maltophilia的生长。图2黄芩苷抑制嗜麦芽窄食单胞菌的菌落个数，也可以看出黄芩苷浓度不断增大，菌落数量随之减少，说明黄芩苷对S.maltophilia的抑菌作用存在浓度依赖性。
2、细胞膜完整性破坏——核酸泄漏
将已活化好的嗜麦芽窄食单胞菌在4℃，8000r条件下离心10min，PBS洗三次后复溶，用PBS稀释得到浓度为1×108CFU/mL的菌悬液，吸取4.5mL菌悬液加入15mL离心管中，然后加入0.5mL 60mg/mL黄芩苷，使黄芩苷终浓度为6mg/mL，阴性对照组为加入0.5mL DMSO，各浓度设置三平行，在30℃条件下水浴震荡反应30min。
反应结束后，得到的溶液过0.22μm水系滤膜，用PBS调零，测试OD260的吸光度值，研究黄芩苷处理对嗜麦芽窄食单胞菌核酸泄漏的情况。
细菌细胞膜的完整性是细胞生长的必要条件，可以通过研究细菌核酸和K+的泄漏情况来判断细菌细胞膜的完整性。黄芩苷处理后S.maltophilia的核酸泄漏情况如图3所示，核酸在OD260处有最大吸光值，可以看出，对照组中细菌核酸几乎不会泄露，而黄芩苷处理后，细菌在260nm处吸光度值显著升高，说明细菌细胞发生了不可逆损伤，核酸泄漏到胞外液体中，细菌的完整性受到破坏。
3、细胞膜完整性破坏——K+泄漏
将已活化的嗜麦芽窄食单胞菌在4℃，8000r条件下离心10min，PBS洗三次后复溶，用PBS稀释得到浓度为1×108CFU/mL的菌悬液。吸取4.5mL菌悬液加入15mL离心管中，加入0.5mL 60mg/mL黄芩苷，使其终浓度为6mg/mL，同样加入0.5mLDMSO作为阴性对照，各浓度设置三平行。在30℃条件下水浴震荡处理30min，反应结束后，用0.22μm水系滤膜进行过滤，得到无菌悬液。用1mol/mL稀硝酸将K+标准液稀释成0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL，各浓度各10mL加入15mL离心管中。使用原子吸收分光光度计测量各个浓度在OD766.5处的吸光度值，用以绘制标准曲线。随后测定阴性对照组及黄芩苷处理组的吸光度值，运用标曲求出细菌胞外K+浓度。
通过原子吸收分光光度计测定黄芩苷处理后细菌K+泄漏的情况。结果如图4所示，766.5nm处为K+的特征谱线，由图4中B可以看出，与对照组相比，黄芩苷处理后细菌在766.nm处吸光度值显著升高(P<0.05)，图4中A为K+标准液制得标准曲线，计算得出S.maltophilia胞外K+浓度显著升高(P<0.05)，K+泄漏，细胞发生损伤，细胞完整性被破坏。
4、氧化应激
使用ROS活性氧检测试剂盒检测细菌ROS含量变化。已活化的嗜麦芽窄食单胞菌在4℃，8000r条件下离心10min，PBS清洗三次，调整菌浓度为1×108CFU/mL。探针装载前，按照1:1000用PBS稀释探针，使其终浓度为10μM，且每1mL菌悬液中加入500μL探针。首先吸取0.9mL菌悬液加入到5mL离心管中，再加入0.1mL黄芩苷(60mg/mL)，使其终浓度为6mg/mL，同样的，设置加入0.1mLDMSO作为阴性对照组，每个浓度设置三平行。30℃，150rpm水浴振荡30min，反应结束后装载探针，各加入500μL探针，避光反应1h。随后在4℃，8000r条件下，PBS离心清洗掉多余探针，使用荧光酶标仪测定OD488下的荧光强度。
氧化应激实验结果如图5，由图可知，经6mg/mL黄芩苷处理后细菌在488nm处的荧光强度显著上升，证明细菌受到刺激，环境内ROS含量与对照组相比显著升高(P<0.05)，说明黄芩苷对S.maltophilia造成氧化损伤，产生大量ROS，细菌受到破坏。
5、显微结构观察
取4.5mL S.maltophilia的PBS菌悬液到15mL离心管中，加入0.5mL 60mg/mL黄芩苷溶液，使其终浓度为6mg/mL，另一组加入0.5mL DMSO作为阴性对照组。在30℃，150rpm的恒温水浴箱中震荡反应30min，4℃，6000rpm离心10min，弃上清，再用PBS缓冲液清洗三次，得到菌沉淀，用移液枪吸取2.5％戊二醛溶液，轻吹打均匀，4℃避光固定24h。取出离心管，4℃，6000rpm离心10min，弃上清；依次用30％，40％，50％，70％，80％，90％，95％和100％的乙醇各梯度脱水5min。50％乙醇:叔丁醇以1:1比例混合，再分别用混合溶液和100％叔丁醇对菌液进行10min置换，冷冻干燥，喷金，通过JSM-7500F扫描电镜观察。透射电镜部分前处理步骤同扫描电镜，自乙醇梯度吸水开始步骤不同于扫描电镜，离心处理后的样品经常规的渗透、包埋、聚合、切片和染色等操作，最后通过HT7700透射电镜观察。
黄芩苷对S.maltophilia作用的显微结构观察结果如图6所示。其中，扫描电镜结果如图图6中的A和B所示，A为阴性对照组，B为黄芩苷处理组。从图中可以看出，在阴性对照组中，正常S.maltophilia为典型的球状结构，表面光滑。黄芩苷处理后，细菌的形状变得不规则、褶皱、细菌表面变得粗糙。此外，还有一些细菌发生破裂，证明细菌完整性被破坏。
黄芩苷对S.maltophilia作用的投射电镜结果如图6中的C和D所示，从图中可以看出，在阴性对照组(图6中C)中，正常S.maltophilia细菌呈球状结构，细胞是完整无损。黄芩苷处理后(图6中D)，细菌细胞壁局部消失，细菌内容物流出，细菌内部结构被完全破坏，细菌完整性被破坏。
6、黄芩苷对S.maltophilia作用后细菌细胞膜通透性分析
PI和SYTO-9是两种核酸染料。当单独使用PI时，它只能穿透细胞膜破裂的细菌并显示红色荧光，而当单独使用SYTO-9时，细胞膜完整或受损的细菌都被绿色荧光染色。然而，当它们组合使用时，PI的红色荧光可以掩盖SYTO-9的绿色荧光。因此，具有红色荧光的细菌越多，细菌的膜渗透性越高。基于此，对黄芩苷处理的S.maltophilia进行染色，以水处理为对照，来分析细菌细胞膜通透性。
结果如图7所示。图7分别列出了SYTO-9下的荧光通路，PI下的荧光通路及SYTO-9/PI两种染料共同作用下的荧光通路，验证6mg/mL黄芩苷对S.maltophilia不同处理时间下细菌细胞膜通透性的影响。从图看出，对照组中的细菌几乎全部呈现绿色荧光，而黄芩苷处理后产生了红色荧光，说明黄芩苷能够导致S.maltophilia细胞膜通透性的增加，细菌发生损伤，并且随着黄芩苷处理时间的延长，能够观察到更多细菌显示红色荧光，可以证明黄芩苷对S.maltophilia细胞膜的破坏程度和对细胞膜通透性的增加是时间依赖性的。
7、生物膜敏感性实验
(1)黄芩苷对S.maltophilia形成生物膜影响
在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(Corning)中加200μL培养在新鲜SCDLP肉汤中的细菌悬浮液，细菌浓度为106CFU/mL，并在30℃条件下静态孵育24小时，以确保生物膜完全粘附到板底部，其他孔加入无菌接种的SCDLP肉汤作为对照。然后，用PBS冲洗生物膜三次，并在30℃下分别用200μLDMSO和1、2、4、6、8和10mg/mL黄芩苷处理30分钟，轻微摇动。随后，使用无菌水冲洗板，用甲醇固定20分钟，并用0.1％(w/v)结晶紫染色10分钟。最后，每个孔加入200μL95％乙醇溶解，并在孵育30分钟后使用Multiscan FC Microplate Reader(Thermo Fisher Scientific，USA)在595nm处测量吸光度值，减去未接种培养基的吸光度值，以得到生物膜的量，试验设置三平行。
黄芩苷对S.maltophilia生物膜的影响结果如图8中的A所示，从图8中的A可以看出，与水处理组相比，10、8、6、4、2、1mg/mL黄芩苷均对S.maltophilia生物膜形成都有显著影响(P<0.05)，其中6mg/mL黄芩苷抑制率可以达到95.2％。
(2)黄芩苷对S.maltophilia已形成生物膜影响
在96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(Corning)中加100μL培养在新鲜SCDLP肉汤中的细菌悬浮液，随后再加入100μLDMSO和1、2、4、6、8和10mg/mL黄芩苷并确保菌液浓度为108CFU/mL，并在30℃条件下静态孵育24小时，以确保生物膜完全粘附到板底部，其他孔加入200μL无菌接种的SCDLP肉汤作为对照。然后，用PBS冲洗生物膜三次，用甲醇固定20分钟，并用0.1％(w/v)结晶紫染色10分钟。最后，每个孔加入200μL 95％乙醇溶解，并在孵育30分钟后使用Multiscan FC Microplate Reader(Thermo Fisher Scientific，USA)在595nm处测量吸光度值，减去未接种培养基的吸光度值，以得到生物膜的量，试验设置三平行。
黄芩苷对S.maltophilia已经形成的生物膜影响结果如图8中的B所示，从图8中B可以看出，黄芩苷能够显著减少S.maltophilia已经形成的生物膜的量(P<0.05)，其中6mg/mL黄芩苷抑制率达到19.1％。
实施例3
黄芩苷与氨苄青霉素联合应用降低S.maltophilia耐药性
将已活化的嗜麦芽窄食单胞菌在4℃，8000r条件下离心10min，PBS清洗三次，调整菌浓度为1×105CFU/mL。首先配制浓度为32768μg/mL的黄芩苷水溶液，用LB培养基按2倍梯度稀释成16384、8192、4096、2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL浓度的溶液。配制浓度为2048μg/mL的氨苄青霉素水溶液，随后用LB培养基按2倍梯度稀释成1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL浓度的溶液。
1、黄芩苷和氨苄青霉素单独使用对S.maltophilia的真菌生长抑制百分数(抑制率)
用移液枪吸取100μL浓度为1×105CFU/mL的嗜麦芽窄食单胞菌菌悬液加入96孔板中，再向孔中分别加入100μL浓度为16384、8192、4096、2048、1024、512、256、128、64、32、16、8μg/mL的黄芩苷溶液，使黄芩苷终浓度为8192、4096、2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4μg/mL。同样的，用移液枪吸取100μL浓度为1×105CFU/mL的嗜麦芽窄食单胞菌菌悬液加入另一96孔板中，再向孔中分别加入100μL浓度为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL的氨苄青霉素溶液，使氨苄青霉素终浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/mL。随后用移液枪吸取100μL菌悬液与100μLLB培养基混合加入96孔板中作为生长对照组，移液枪吸取200μL LB培养基加入96孔板中作为空白对照组，每个浓度设置三平行。37℃培养24h，培养完成后使用酶标仪测定OD600nm吸光度值，用酶标仪在波长600nm处读取96孔板中各孔的OD值。
以如下公式计算：
真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/(生长对照孔OD值-空白对照孔OD值)×100％。
真菌生长抑制百分数＝1-真菌生长百分数。
测试结果显示，当黄芩苷浓度≥8192μg/mL，S.maltophilia的抑制率可达90％以上；当氨苄青霉素浓度≥128μg/mL时，S.maltophilia的抑制率可达90％以上。即，黄芩苷单用时的MIC值为8192μg/mL，记为MIC黄芩苷(单独)；氨苄青霉素单用时的MIC值为128μg/mL，记为MIC氨苄青霉素(单独)。
2、黄芩苷和氨苄青霉素联合使用对S.maltophilia的真菌生长抑制百分数(抑制率)
使用棋盘稀释法测定黄芩苷和氨苄青霉素联合作用于S.maltophilia的真菌生长抑制百分数，步骤为：用移液枪吸取100μL浓度为1×105CFU/mL的嗜麦芽窄食单胞菌菌悬液加入96孔板中，再向孔中分别加入50μL浓度为32768、16384、8192、4096、2048、1024μg/mL的黄芩苷溶液，使其终浓度分别为8192、4096、2048、1024、512、256μg/mL，再向各孔中分别加入50μL浓度为512、256、128、64、32、16μg/mL的氨苄青霉素溶液，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4μg/mL。
在上述选定范围内，不同浓度的黄芩苷和不同浓度的氨苄青霉素在不同孔中以任意浓度两两搭配并穷尽所有搭配可能。例如，黄芩苷+氨苄青霉素：8192μg/mL+128μg/mL、8192μg/mL+64μg/mL、8192μg/mL+32μg/mL、8192μg/mL+16μg/mL、8192μg/mL+8μg/mL、8192μg/mL+4μg/mL、4096μg/mL+128μg/mL、4096μg/mL+64μg/mL、4096μg/mL+32μg/mL、4096μg/mL+16μg/mL、4096μg/mL+8μg/mL、4096μg/mL+4μg/mL……16μg/mL+4μg/mL，以此类推，并穷尽上述各浓度下的搭配可能。
用移液枪吸取100μL菌悬液与100μL LB培养基混合加入96孔板中作为生长对照组，移液枪吸取200μLLB培养基加入96孔板中作为空白对照组，每个浓度设置三平行。37℃培养24h，培养完成后使用酶标仪测定OD600吸光度值，用酶标仪在波长600nm处读取96孔板中各孔的OD值。使用相同公式计算黄芩苷和氨苄青霉素联合作用于S.maltophilia的真菌生长抑制百分数。
测试结果显示，当黄芩苷浓度≥1024μg/mL，且氨苄青霉素浓度≥16μg/mL时，联用药物对S.maltophilia的抑制率大于90％。即，该联用药物的MIC值为1024μg/mL+16μg/mL，取1024μg/mL作为药物联用环境中黄芩苷的MIC值，记为MIC黄芩苷(联合)；取16μg/mL作为药物联用环境中氨苄青霉素的MIC值，记为MIC氨苄青霉素(联合)。
3、黄芩苷和氨苄青霉素联合作用效果评价
评价两种药物联合作用效果，运用Loewead－ditivity(LA)理论，是比较黄芩苷或氨苄青霉素单用和两种药物联用时产生相同药效的浓度差别。FICI法是以LA理论为基础的评价联合作用方法。FICI公式为∑FICI＝FIC黄芩苷(单独)+FIC氨苄青霉素(单独)＝MIC黄+氨(联合)/MIC黄芩苷(单独)+MIC氨+黄(联合)/MIC氨苄青霉素(单独)。计算所得的∑FIC值，当∑FIC最大值>4时，则FICI定义为∑FICmax；反之，FICI定义为∑FICmin。联合作用结果判断依据是FICI≤0.5为协同作用，FICI＞4为拮抗作用，0.5＜FICI≤4为无关作用。
结果如表1所示。
表1黄芩苷联合氨苄青霉素降低S.maltophilia耐药性结果
由表1可以看出，与单独使用黄芩苷或氨苄青霉素处理S.maltophilia的MIC相比，黄芩苷与氨苄青霉素联合抑制S.maltophilia各自的MIC值明显降低(P<0.05)，且FICI法评价结果值为0.25，说明两种药物之间为协同作用，证明黄芩苷与氨苄青霉素联合使S.maltophilia耐药性降低。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (3)
1.组合物在制备防治嗜麦芽窄食单胞菌和/或由嗜麦芽窄食单胞菌引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述组合物含有黄芩苷和氨苄青霉素，所述黄芩苷和氨苄青霉素的质量比为 64:1。
2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体。
3.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
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