CN101283104A - 选择具有抗生物膜感染功效的试剂的板 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种可以用于选择具有抗生长为生物膜的微生物的功效的抗生素组合的诊断板。所述板允许在多个凸起上生长生物膜,并且随后将在所述板的所有凸起上的生物膜同时用独立的浓度和抗生物膜试剂的组合进行攻击。当与它们以浮游状态生长时相比较,所述浮游状态通常用于确定它们的抗生素敏感水平,当它们生长为生物膜时,微生物对抗生素的抗性更高。在抗生物膜试剂攻击中脱离生物膜的微生物的生长确定最小抑制浓度(MIC),其与浮游状态的微生物的敏感性相关。在随后的恢复步骤中来自生物膜的任何存活的微生物的生长确定最小生物膜根除浓度(MBEC),其与生长为生物膜的微生物的敏感性相关。在恢复步骤中计数存活的微生物确定最小杀生物浓度(MBC)。
Description
本申请要求于2005年7月22日提交的美国临时申请号60/701,858的优先权。
I.发明领域
本发明涉及分析生物膜的方法和装置,并且涉及确定抗微生物或抗生物膜试剂,优选抗生物膜试剂的组合诸如抗生素或杀生物剂的微生物敏感性。在本发明的一个优选的实施方案中,方法和装置包括选择适当的单个具有增强的治疗生物膜疾病的功效的抗生物膜试剂及其组合,生物膜疾病包括但不限于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),特别是在囊性纤维化(CF)患者中的肺部感染。
本发明提供选择具有增强的治疗生物膜疾病的功效的适当的抗生物膜试剂的方法和装置。
II.发明背景
微生物的表征传统上应用分批培养研究的方法,其中微生物以分散或浮游状态存在。在过去的25年里,已经认识到在许多环境中细菌生物量的主要成分是固着细菌。近来在微生物生态学中的技术进步已经允许如同它们在自然和疾病中存在那样对微生物进行仔细的研究。这些研究表明,大多微生物能够在生物膜上生长,并且微生物在生物膜上的生长在物理和生理上不同于相同的微生物在分批培养中的生长。这些不同构成这些微生物的发病机理和它们对抗微生物试剂的敏感性的观察到的改变。抗生素抗性一般归因于保护性外泌多糖基质的产生和微生物生理的改变。
革兰氏-阴性杆菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是在广泛种类的工业、商业和处理操作中发现的许多微生物中的一种,所述工业、商业和处理操作如污水排放、再循环水系统(冷却塔、空气调节系统等)、冷凝水收集、纸浆操作、以及,一般地,任何蓄水、处理、加工、收集等系统。正是由于生物膜在水处理系统中普遍存在,所以并不奇怪还发现铜绿假单胞菌与这些生物膜缔合。在许多情形中,铜绿假单胞菌是主要的微生物成分。
除了它在工业处理中的重要性,铜绿假单胞菌和与其缔合的生物膜结构具有影响深远的医学意义,并且是许多病理条件的基础。铜绿假单胞菌是一种与广泛种类的感染相关的机会致病菌,例如,缓慢定居在患有囊性纤维化患者的肺部。作为生物膜生长的铜绿假单胞菌高度抗抗生素并且抗吞噬细胞。
本发明人已经研发了具有鉴定有效消除并且控制生物膜的抗生物膜试剂和抗生物膜试剂组合的特殊目的的检测。对于铜绿假单胞菌生物膜已经研发了特殊的装置和方法。这样的产品应该提高用于患有囊性纤维化肺部感染和其它假单胞菌感染的患者的抗微生物药物治疗的选择。
在这些表面上存在的生物包括许多致病的和不致病的细菌和真菌。葡萄球菌(Staphylococcus spp.)感染通常与由不锈钢、硅氧烷、聚氨基甲酸酯组成的移植的医学装置相关。移植的医学装置首先用糖蛋白如纤连蛋白涂敷,所述糖蛋白允许葡萄球菌生物粘附到表面并且最终形成微生物生物膜。充分认识到,当与医学装置缔合时,葡萄球菌(Staph)对抗生素治疗没有反应。对固着细菌的抗微生物活性的评估应该更好地预测关于葡萄球菌感染的临床功效。
现在,认为致病真菌如念珠菌属(Candida)和烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是重要的感染,并且负责显著的发病率和死亡率。通常它们与移植的装置相关,或者在免疫损害的患者中。只是在最近才认识到治疗失败与生物膜的形成相关。尽管已经描述了针对抗真菌剂的抗性基因,但是基于生物膜形式的生长的生理抗性可能等价于治疗失败或者比治疗失败更重要。
现在广为人知,以生物膜形式的细菌比浮游细菌更加抵抗抗细菌剂。然而,检测细菌的存在和检测抗生素抗细菌的功效通常包括检测浮游细菌。当与在浮游(自由浮动)状态的相同细菌比较时,研究已经表明生物膜大于几百倍的抗生素抗性。由于作为生长的生物膜形式的一部分的许多表型适应性,这种抗性是多因素的,包括但不限于发展的粘多糖包被,和在微生物中的生理改变。
选择用于治疗生物膜感染的抗生素和抗生素组合继续依赖于最小抑制浓度(MIC)测定,而不管这些检测的公认的缺乏功效性。一些人提议应用生物膜抑制浓度(BIC)(Moskowitz,等;J.Clin.Microbiology(临床微生物学杂志),42:1915-1922(2004年5月)),但是证据表明BIC和MIC二者都针对浮游细菌,而不是固着细菌。例如,Moskowitz等在他们的方法中应用离心,并没有去除大部分来源于激活的生物膜的细胞,因此导致只针对浮游细菌的测定,或者只是部分生物膜的测定。因此这一测定可能忽略了遗留在栓(peg)上的存活细胞,因而导致潜在的错误推论。此外,现有技术典型地将生物膜生长在静态(不流动)环境中,其有时影响结果。
相反,本发明在其处理过程中在独立的恢复板上应用超声或再生生物膜,以致可以获得并检测完整无缺的生物膜。此外,本发明的方法包括在动态或流动条件下生长生物膜,并且中和抗微生物剂,二者都单独地和共同地加强任何测定结果。
因此,存在对于改进的处理和测定装置和方法的需求,所述处理和测定装置和方法用于选择有效的抗生物膜组合物,包括有效抗人和动物生物膜介导的疾病的抗生物膜组合物,所述疾病包括但不限于CF肺部感染。
III.发明概述
本发明包括用于选择单独的或组合的,有效抗生物膜的一种或多种活性剂的改进的方法和装置。在本发明的优选实施方案中,所述装置和方法可以用于生物膜感染的治疗。所述生物膜可以是任何生物膜,例如,由细菌、真菌、或藻类、病毒、和寄生虫形成的那些;或者结合在它所形成的生物膜内的微生物;或者混合的生物膜,例如,含有多于一种细菌、病毒、真菌、寄生虫或藻类生物膜。
本发明的装置和方法还包括研发治疗方法。在优选的实施方案中,所述治疗方法可以适合具体的患者和/或可以形成研发个性化的医学治疗或方法的基础。
本发明的装置和方法还有效地治疗广泛种类的微生物,包括但不限于铜绿假单胞菌,葡萄球菌,念珠菌属物种(Candida ssp.),和烟曲霉。
本发明的装置和方法还有效地治疗由一种或多种生物膜介导的广泛种类的疾病和病况,所述疾病包括但不限于囊性纤维化(CF),包括由一种或多种细菌、病毒、真菌、寄生虫、藻类或它们的组合引起或介导的疾病和病况。
本发明还提供适合生长特别的一种或多种生物膜、并且适合确定有效抗所述生物膜的适当的一种或多种活性剂的临床上重要的测定。在本发明的优选的实施方案中,所述测定提供最小生物膜根除浓度(MBEC),最小抑制浓度(MIC),或最小杀生物浓度(MBC),或它们的组合。
本发明提供一组单个的和/或组合的活性剂,用于选择包含一种或多种具有抗生物膜功效的活性剂的组合物。这些试剂或试剂的组合可以用于治疗患者-特异性感染的生物体。本发明提供用于选择生物膜相关的感染疾病的组合抗生素治疗的方法和装置。
本发明的装置和方法还可以用于确定并且开发对个体患者特异性的药物组合物。
本发明的装置和方法还为有助于公知的抗生素抗性的现有治疗方法提供备选方案。
本发明的装置和方法还可以用于鉴定在开发适合特别患者的适当的治疗方法的过程中的遗传漂移、抗生素抗性、和遗传变异。
本发明还提供适合生物膜存在的体外测定,即,基于确定最小生物膜根除浓度(MBEC)的测定。在本发明的优选实施方案中,所述装置和方法提供MBEC、最小抑制浓度(MIC)、和最小杀生物浓度(MBC)值的任何组合。
本发明的装置和方法与现有技术装置相比,在下述一项或多项改进:所述装置和方法包括检测完整的生物膜;应用超声去除完整的生物膜;所述装置和方法适用于更宽范围的生物膜,例如,真菌的等等;抗生物膜试剂涵盖更宽范围的试剂,包括杀生物剂等等;所述装置和方法是高流通量的,并且因此更加有效和节约成本;并且生长生物膜得到改进,包括增加的了解和应用方法条件,以增强生物膜生长。
微生物生物膜存在于许多医学、兽医、农业和工业系统,方法,处理设备中,和表面上。在这些表面存在的生物体包括许多致病的和不致病的生物膜。
本发明的方法和装置可以用于降解生物膜,无论它们在哪里存在,例如,在淤积发生的工业过程中,例如,除垢浆(de-fouling pulp)和造纸厂设备,处理气/油管线,和净化食品加工设备,或者移植的医学装置,其包括导管、髋部移植物和套管。在本发明的范围内,本文列出的原理还适用于它们所发生的所有环境中的所有生物膜。
本发明还包括完整装置或组件、多样的或多个组件、多样的或多个亚组件、或它们的组合的应用。
本发明的这些和其它方面将在下述附图、描述和权利要求中更加清楚。
III.附图简述
图1是在容器盖子上的多个生物膜附着位点的底视图。
图2是图1接受多个生物膜附着位点的容器的顶面图。
图3是图1和2的盖子和容器的侧面图,部分断裂。
图4是本发明的一个代表性实施方案的方法步骤的流程图。
图5显示本发明的生物膜生长和形成过程的实例。
图6显示本发明的生物膜敏感性测定的实例。
图7显示按照本发明恢复完整的生物膜的方法实例。
图8显示按照本发明确定MBEC和MIC测定的方法实例。
图9是在实施例6中描述的实验结果的图表。
图10显示在实施例7中所用的攻击板(challenge plate)的设置。
图11显示在实施例10中所用的攻击板的设置。
图12是确定生物膜的MIC、MFC和MBEC值的图表。
IV.发明详述
本发明包括用于选择单独的或组合的有效抗生物膜的一种或多种活性剂的改进的方法和装置。在本发明的优选实施方案中,所述装置和方法可以用于治疗生物膜感染。在本发明最优选的实施方案中,所述装置和方法可以用作诊断工具,以确定用于治疗一种或多种生物膜和/或一种或多种由所述生物膜介导的疾病或病况的各种组合物,包括优化组合物。
本发明包括用于选择治疗生物膜的适当的抗生物膜试剂组合的改进的方法和装置。在本发明的优选实施方案中,所述方法和装置提供诊断敏感性测试,并且在最优选的实施方案中,在单一实验中提供MBEC、MBC、和MIC值。本发明一个实施方案可以包括用于选择针对特异的生物膜或生物膜群体的活性剂组合的方法和装置。
本发明的方法和装置可以用于降解生物膜,无论它们在哪里发生,例如,在淤积发生的工业过程中;移植的医学装置,其包括导管、髋部移植物和套管;或者用于广泛种类的感染,如:眼部应用(感染、移植、隐形眼镜、手术操作等等),呼吸道感染,包括肺炎和囊性纤维化,耳部感染,复发性关节相关的感染,尿道感染,皮肤和软组织感染,在烧伤受害者中发生的感染,心内膜炎,阴道感染和胃肠道感染。在本发明的范围内,本文列出的原理还适用于它们所发生的所有环境中的所有生物膜。
本发明还包括用于治疗患有由生物膜介导或引起的疾病或病况的患者或受试者的方法和装置。在本发明的这些实施方案中,将来自患者或受试者的生物样品用生物膜形成装置处理;然后将生物膜用生物膜敏感装置处理,以提供一种或多种针对所述生物膜具有活性的试剂。
本发明的一个实施方案包括一种组件,其包括一个或多个预先负载一种或多种预先选择的针对特异的一种或多种生物膜的抗生物膜试剂的板,所述板可以用于鉴定治疗生物膜-介导的疾病或病况的有效的单个或组合的活性剂。
在本发明的一些实施方案中,所述方法还可以包括一个或多个下述各项:在促进基本上均一的生物膜生产的条件下生长多样的或多种生物膜;针对一大组活性剂筛选生物样品;选择一小组活性剂;用多样的或多种在小组中的活性剂上样负载检测装置;生长来自具体的患者或受试者样品的生物膜;针对活性剂小组,筛选来自具体的患者或受试者的生物膜;读取结果;确定适于特别的生物膜的适当的活性剂或活性剂的组合;如果当生长时微生物产生明显可见的混浊(如假单胞菌),进行浊度检测;并且如果微生物不以明显的浊度生长,进行板接种检测。
本发明的一个实施方案包括用于选择具有抗作为生物膜的具体的病原体的分离物的功效的抗生素的特别组合的方法,其通过针对单独的或组合的广泛范围的抗生素而筛选某一物种的宽范围的临床分离物,以鉴定具有抗生物膜生长的生物的功效的组合。
本发明的一个实施方案包括形成其中生长生物膜的患者分离物的生物膜,使用如美国专利号6051423,6326190,6410256,6596505,6599696和6599714中的一个或多个中所述的生物膜检测装置,用于检测生物膜抗生素敏感性。
本发明的一个实施方案包括确定用于治疗生物膜感染的抗生素选择,其通过针对对形成生物膜的物种特异的诊断板攻击患者的特异性分离物的生物膜而进行。
本发明的一个实施方案包括将预先负载抗生素的物种特异性板再水合作为攻击板,以鉴定具有抗特异性病原体功效的抗生素。板可以是冷冻的(不需要再水合),或者冻干的,冷冻干燥或真空干燥的。
本发明的一个实施方案包括一种孔板(well plate),其包含冷冻的或冻干的抗生素组合,其可以再水合用于抗生素敏感性检测。
本发明的一个实施方案包括生长从分离的患者病原体获得的生物膜,并且将所述生物膜用于敏感性检测。
本发明的实施方案包括针对所选择的抗微生物或抗生物膜试剂的组合而攻击生物膜,由此选择最适宜的组合。
本发明的一个实施方案包括在能够形成生物膜的任何微生物的诊断和治疗中提供MBEC值,并且应用这些值治疗或者开发用于任何微生物-介导的疾病、感染、或病况的治疗方法。本发明还可以包括提供MIC和/或MBC值。
在本发明的另一个方面中,在将生物膜生长在盖子或板上的粘附位点上后,将所述生物膜从生物膜粘附位点移下,并且进一步培养所述生物膜。从生物膜粘附位点移下生物膜可以包括将来自每一个生物膜粘附位点的生物膜移动到微量滴定板或基底的独立的孔中。在本发明的优选实施方案中,所述生物膜使用导致完整的生物膜从粘附位点移出的任何方法进行移动。本发明人发现使用离心只移除一部分微生物,因此任何检测可能是不完全或不准确的。
优选地,多个生物膜粘附位点以多排形成,在每一排有多个位点;并且容器包括多个通道,每一通道用于每一排多个生物膜粘附位点。这样配置的装置或组件允许高通量的生物膜分析。
在整体上,本发明包括生物膜生长组件1,生物膜攻击组件2,漂洗组件3,和生物膜移动和再生组件4。共同使用,所述组件在单一实验中提供MIC、MBC和MBEC值。
按照本发明,生物膜生长组件1可以包括配置成接受盖子10的基底或板20。盖子10可以配置成包括一个或多个凸起12,所述凸起12延伸到由基底20限定的空间。在本发明最优选的实施方案中,生物膜生长组件1是摇动的、移动的等等,以致在所述组件中的生长流体穿过凸起12流动或移动。在本发明的优选实施方案中,基底20是培养基底,并且被设置成为每个凸起提供基本上相等的暴露于微生物源和其营养/生长肉汤。如在本说明书其它地方所述,典型的基底包括多个通道26中的一个。一种代表性的构型在图3中所示。
按照本发明,生物膜攻击组件2包括配置成接受盖子60的第二基底或板21,所述盖子60具有典型地被生物膜覆盖的凸起61。凸起61延伸到在板21上设置的一个或多个孔中。一种典型的第二基底21是标准的96孔微量滴定板,尽管本领域的技术人员应该易于认识到可以使用其它构型。第二基底21在孔中含有一种或多种抗生物膜试剂。按照本发明,第二板21可以移开,并且用于确定非生物膜(如浮游)微生物的MIC值(参见图8)。
按照本发明,生物膜漂洗组件3包括设置成接受盖子60的第三基底或板40,所述盖子60具有典型地被生物膜覆盖的凸起61。凸起61延伸到在板40上设置的一个或多个孔中。一种典型的第三板40是标准的96孔微量滴定板,尽管本领域的技术人员应该易于认识到可以使用其它构型。第三板40在孔中含有一种或多种漂洗和/或中和试剂。
漂洗后,然后盖子60可以与第四基底50结合,第四基底50还叫作恢复板。盖子60和第四基底50形成生物膜中断组件4。所述恢复板含有恢复培养基,并且按照本发明,组件4可以进行超声处理并且再生生物膜(证实生物膜没有被去除)。在本发明的优选实施方案中,恢复培养基包括一种或多种中和试剂。如在实施例中所示,在已经暴露于恢复培养基后检测盖子60上的凸起提供微生物的MBEC值,并且从恢复板铺板接种提供MBC值。
下面描述本发明的一个代表性实施方案。如最特别在图1、2和3中所示,本发明的一种代表性生物膜生长组件包括具有凸起12的盖子10,和基底20,所述基底20适于接受盖子10和凸起12,并且包括至少一个通道24或孔。如在附图中所示,所述装置包括由组织级别的塑料或其它适宜的材料(例如,不锈钢、钛)组成的生物膜盖子10,其具有从盖子10向下延伸的凸起12。凸起12可以是生物膜可以与之粘附的生物膜粘附位点,并且可以设置成适合与含有通道或含有孔的底部如基底20结合使用的任何模式或形状。凸起12的模式优选地反映常规板如通常用于检测步骤的96微量滴定或孔板中的通道和/或孔的模式。在本发明最优选的实施方案中,凸起12优选地在每排至少12个凸起的至少8个排14中形成。可以使用其它的排数或者每排的凸起数,但是由于它符合通常在生物医学装置中所用的96孔板,所以这是方便的数目。所示的其它的或一些凸起可以用来在培养后确定初始生物膜浓度。所示的代表性凸起12约1.5cm长和2mm宽,但是可以是任何大小和/或形状。
生物膜生长组件1还包括设置成并且适于接受具有凸起12的盖子10的培养基底20。盖子10形成凸起12的支持物,用于支持在通道24内的生物膜粘附位点。盖子10具有周围的盖子16,其紧密盖在容器20的周围壁28上,以避免在温育过程中污染容器内部。
基底20为生物膜形成提供两种重要的作用。第一种是含有细菌群体的液体生长培养基的储蓄池,所述细菌群体将在凸起12上形成生物膜。第二种作用是具有适于产生穿过凸起的剪切力的构型。尽管不意欲受限于任何具体的操作理论,本发明人相信由穿过凸起的流体形成的剪切力在所述凸起上促进最理想的生物膜生产和形成。
在凸起12上的剪切力可以通过在倾斜工作台30上摇动具有盖子10的容器20而产生。本发明人发现使用在约7°-约11°之间斜度的摇动工作台适于大部分应用。在本发明的优选实施方案中,摇动工作台应该设定在约9°。应该理解,本发明不应该限制在使用目前的倾斜角度,但是用于任何具体的机器的任何斜度应该适于生长按照本发明所述的生物膜。
凸起12可以悬浮在通道24中,以致凸起12的顶端可以浸没在通道24中流动的液体生长培养基中。隆起26沿着通道24引导液体生长培养基经过并且穿过凸起12,并且因此产生穿过凸起的剪切力。摇动容器10引起流动方向的重复改变,在这种情形中,液体生长培养基穿过凸起10流动的重复逆转,其帮助保证生物膜等比例分布在盖子10的每一个凸起12上。摇动容器以致液体沿着通道前后流动不但提供极好的生物膜生长环境,而且模拟天然存在的条件。
每个凸起12和每个通道24优选地具有基本上相同的形状(在制造公差(manufacturing tolerance)内),以保证在生物膜形成过程中穿过凸起的剪切流的均一性。在本发明的优选实施方案中,通道24应该都被设置或者连接,以致它们共有充满皿22的相同的液体营养物和细菌混合物。本发明人发现,基本上均一的通道构型和通向相同微生物来源的途径促进在每个凸起上产生相等的生物膜,至少等于检测抗生物膜试剂所需要的程度。认为这样产生的生物膜是均一的。对于板上的随机凸起,已经获得P<0.05内的结果。
生物膜的敏感性可以通过用一种或多种抗生物膜试剂处理生物膜粘附位点,即,攻击生物膜,然后检测生物膜而进行检测。这可以通过将盖子60(具有在凸起上形成的生物膜)安放在适合接受盖子10和凸起12的第二基底21上而完成。在本发明的优选实施方案中,盖子60以充分防止组件污染的方式与第二基底21啮合。当用于此处时,充分防止污染的方式是指配合结构的构型和组件,以致闭合的组件的内容物免受外部污染。
按照本发明,本领域的技术人员可以使用任何安排或方案攻击一组生物膜。例如,攻击板的所有孔可以包含相同的抗生物膜试剂;多个或多样的孔可以包括不同剂量的相同的抗生物膜试剂;在单排上的多个或多样的孔可以包含相同剂量或不同剂量的抗生物膜试剂;多个或多样的排可以包含相同剂量或不同剂量的抗生物膜试剂;多个或多样的孔或者多个或多样的排可以包含多于一种抗生物膜试剂;或者多个或多样的孔或者多个或多样的排可以包含多于一种抗生物膜试剂,每个孔、每一排和/或每种抗生物膜试剂剂量不同。本领域的技术人员应该理解,孔的构型和排列,抗生物膜试剂的类型和数目,和每个孔的剂量应该随需要而变化,以实现特别的目的,例如,使用如对目的目标合理的一样多的变量,用一种或多种抗生物膜试剂检测一种或多种生物膜。
例如,在容器20的相同通道24中温育的凸起12可以用不同的抗细菌试剂处理。以这种方式,由于在任何一个通道里的生长条件沿着整个通道非常相似,并且对于悬浮在所述通道中的每个凸起12也是非常相似的,所以可以获得一致的结果。这帮助提高用不同抗细菌试剂处理不同凸起12的可靠性。这一实例表明不同的排列适合与本发明的组件一起使用。
一些不同的常规方法可以用于计数细菌。它可以通过培养超声处理的细菌,采用连续稀释并且视觉计数菌落形成单位而进行,或者可以使用自动方法,例如使用光学读数仪确定光密度。然而,已经发现,浊度的光学读数对于实际应用过于不准确,并且优选地应该应用活体染料技术以将存活能力检测自动化,其通过用活体染料处理生物膜,并且检测由染色的生物膜发出的光的强度而进行。在使用活体染料技术的情形中,生物膜不需要进一步培养。本领域的技术人员应该认识到,可以使用用于细胞群体的其它染料;稍后这些染料可以提取出来并且读数OD(剩余细胞生物量的检测)。在另一个实施方案中,检测可以这样进行,即,通过超声处理细胞直到它们裂解并且释放ATP,然后加入萤光素酶,以产生机械可读的光学输出量。在另一个实施方案中,检测可以使用共焦显微镜在凸起上的生物膜上直接进行,尽管应该考虑到这很难自动化。在下述实例中,结果在连续稀释后从人工计数获得。
细菌存活下降到零的抗细菌试剂的浓度(MBEC)可以从所述检测容易地估计。同样地,还可以从所述检测确定MIC。
本发明人发现,在一些情形中,在生物膜中不包含宿主成分的情况下,不形成生物膜。因此,宿主成分可以在细菌培养过程中加入到容器中的生长培养基中,以形成生物膜。可以加入的宿主成分包括血清蛋白和来自宿主生物体的细胞。对于检测不同宿主细胞和成分的作用,通道24的末端25可以通过壁密封,以防止在一个通道中的生长培养基流到另一个通道中,因此将在每个通道生长的细菌与其它通道分开。这样描述的装置还可以用来检测用于抑制生物膜生长的涂层,和检测可以增强生物膜形成的涂层。在初始步骤中,凸起12可以用待检测的涂层包被,然后将生物膜在所述凸起上生长。然后,可以对生物膜进行检测,或者用抗细菌试剂处理然后进行检测。所述检测可以在原位的或者在移开生物膜之后进行。不同的涂层可以在不同排的栓上进行检测。增强的生物膜形成可以用来产生用于生物发酵的大的有活力的生物膜。
当用于本文时,组件是指设计或者配置成协同工作的元件或成分的综合集合。本发明的典型的组件包括盖子及其相对应的基底。在本发明的一些实施方案中,一个组件的元件可以与独立的组件一起作用或工作。例如,组件1的盖子可以用作组件2的盖子,即,具有不同的基底。在本发明的优选实施方案中,盖子可以以可移动的、密封的方式与基底啮合。在本发明的其它实施方案中,盖子可以以闭合的,密封的方式与基底啮合;在这些实施方案中,可需要适合组件的其它元件,以致它们可以移动,例如,一个或多个可以移动的凸起。
当用于本文时,攻击板是指具有一个、多样的或多个孔构型等的任何基底,所述板用于将一种或多种生物膜暴露于一种或多种抗生物膜试剂。典型的攻击可以用来确定包含一种或多种抗生物膜试剂的环境中的生物膜生长。在本发明方法的后续步骤中,所述攻击板可以用来确定任何浮游微生物的MIC值。一种代表性的攻击板在图6和8中显示。
当用于本文时,恢复板是指具有一个、多样的或多个孔构型等的任何基底,所述板用来在已经暴露于抗生物膜试剂后漂洗生物膜,中和任何抗生物膜试剂,以在所述组件超声处理后收集任何分解的生物膜,或者它们的组合。在本发明方法的后续步骤中,所述恢复板可以用来确定在本方法中形成的任何生物膜的MBEC值。一种代表性的恢复板在图7和8中显示。
当用于本文时,中和试剂是指适于减小或者抵消由抗生物膜试剂引起的任何毒性的任何组合物。如果它对于所用的抗生物膜试剂和对于具体的生物膜是有效的,那么中和试剂是适宜的。中和试剂的选择在本领域的技术范围内。一些中和试剂和组合物在实施例中显示。如在图7中所示和在实施例中所述,恢复培养基是包含一种或多种中和试剂的组合物。
当用于本文时,活性剂或抗生物膜试剂是指有效减少、降解或者消除生物膜或生物膜样结构的一种或多种试剂。本发明包括但不限于,已经公知的活性剂,例如,抗生素,抗微生物剂,和杀生物剂。一种或多种活性剂可以独立作用;一种或多种活性剂可以组合或协同作用;一种或多种活性剂可以顺序或连续地应用。
当用于本文时,活性剂组或文库是指按照预先确定的方法分组的多样的或多种活性剂的集合。例如,第一文库可以包含一种或多种活性剂,所述活性剂在有效抗具体的生物膜中表现出某种程度的潜力。第二文库可以以第一文库的子集起始,并且设计成缩小有效活性剂的选择,或者提供关于活性剂的具体子集的更多的信息。一组或文库还可以包含按照预先确定的方法,例如,可变的剂量,而分组的专有(proprietary)或非专有活性剂组。
当用于本文时,含有活性剂的组合物包含一种或多种活性剂,并且还可以包含一种或多种其它试剂,包括但不限于细菌素或其它抗细菌肽或多肽,一种或多种消毒剂等,一种或多种表面活性剂等,一种或多种载体、生理盐水等,一种或多种稀释剂等,以及一种或多种防腐剂等。
当用于本文时,样品是指从患者、动物或环境采集的生物或流体样品;样品确切地包含任何来源或潜在来源的微生物。患者的分离物来源于标准的实验室方法,并且还通过标准实验室操作(CLSI)制备用于检测。用于攻击板的接种物包括应用现有技术,美国专利号6051423,6326190,6410256,6596505,6599696和6599714,而以标准密度形成的生物膜。
当用于本文时,生物膜攻击包括将在栓MBEC装置上生长的生物膜培养物置于预先包装的攻击盘的孔中,以致患者的分离物暴露于某种浓度范围的针对它们抗目标生物体的协同作用进行选择的抗生素谱。所用的培养时间和条件以及培养基随分离物而不同。
当用于本文时,功效是基于组合的抗生素具有生物膜活性的能力,并且基于MIC(最小抑制浓度)、MBC(最小杀生物浓度)和MBEC(最小生物膜根除浓度)而定义。检测细菌抗生素敏感性的标准检测是最小抑制浓度(MIC),其检测细菌在它们的浮游阶段的敏感性。MIC是确定细菌在其生物膜阶段的真正抗生素敏感性的有限的值。另一方面,MBEC检测允许在生物膜阶段的细菌的直接测定,并且包括在生物膜生长装置或板上形成生物膜,将生物膜暴露于一种或多种测试抗生素或活性剂确定的时间周期,将生物膜转移到具有新鲜细菌学培养基的第二个板上,并且将生物膜培养过夜。MBEC值是防止细菌从处理过的生物膜再生的最低活性剂稀释度。当用于本文时,处理方案是指活性剂的剂量,活性剂的组成,和它应该施用的频率。使用本发明的装置和方法,所述处理方案可以适合具体的人或动物,具体的一种生物膜或多种生物膜,和/或具体的疾病或病况。对于一些疾病和病况,例如,CF,可以理想地在不同的时间进行独立的检测,以优化治疗疗程。例如,据信,当患者和感染改变时,CF患者的病况随着时间改变;监测这些变化并且在需要时改变任何处理将是有利的结果。
当用于本文时,有利的结果是指任何程度抗微生物或生物膜的功效。益处的实例包括但不限于在生物膜或形成生物膜的微生物中的减低,消除,根除,或减少;并且处理微生物的能力被生物膜掩盖或防止。在治疗患者的方式中的改进的代表性实例包括但不限于治疗具体的患者的能力或潜能,使治疗方案在具体的时间适合具体的患者的能力;和能够选择一种或多种特别的活性剂的提高的能力。
当用于本文时,敏感性检测或相似的短语是指确定活性剂是否并且以多少量影响在生物膜中的微生物的生长或状态。在本发明的装置和方法中,敏感性检测与现有技术方法不同,在于其使用高通量的装置,在非静止环境中形成生物膜,通过流动系统产生生物膜。
当用于本文时,高通量是指同时或者在同一步骤中生长和/或检测大量生物膜和/或大量抗生物膜试剂的能力。典型地,高通量体现为以一种或多种组件存在的结构元件,以提高生长或被检测的物质的速度或数量,例如,96孔检测板,适合并且设置成与96孔板啮合的顶盖,具有与所述孔相对应的栓的顶盖,和具有通道的生物膜生长板,以致你可以同时处理大量的单个生物膜。
实施例:
下述用于实施例1-4:
抗生素和其它抗微生物剂储液应该以在攻击板中所用的最高浓度的5×预先制备。例如,去离子水或适当的溶剂用来制备5120μg ml-1活性剂的抗生素储液。参考临床实验室标准研究所(Clinical Laboratory StandardsInstitute,CLSI)文献M100-S8关于应该使用哪种溶剂和稀释剂的详情。大部分抗生素储液在-70℃稳定最少6个月。
对于科研应用,适当地应用中和剂来确定最小杀细菌和杀真菌浓度。这些试剂减少生物活性化合物从攻击到恢复培养基的残余物的毒性。例如,可以使用β-内酰胺酶中和青霉素,或L-半胱氨酸中和Hg2+和一些其它的重金属阳离子。下述实验在杀生物剂敏感性检测中使用通用的中和剂,所述中和剂是调节产品开发方面必需的。这一实施例描述如下:
1.0g L-组氨酸
1.0g L-半胱氨酸
2.0g还原谷胱甘肽
用双蒸水补足到20ml。通过具有0.20μm滤器的注射器以除菌。这一溶液可以保存在-20℃。补足1升适当的生长培养基(阳离子调节的MHB)。将这种培养基每升补充20.0g皂苷和每升补充10.0g吐温-80。用稀释的NaOH调节到正确的pH(在20℃ 7.0±0.2)。向用于恢复板的每20ml补充表面活性剂的生长培养基中加入500μl通用中和剂。
在图4中提供这一实验方案的综述。完成这一方案需要的天数取决于要检验的微生物的生长速率。所述方案被分成6个相续的步骤,每一步骤在下文部分中详细叙述。
这种方案研发用于Nunc牌,平底,96孔微量滴定板。这些微量板具有每孔300μl的最大体积。对于不同牌子的微量滴定板,这里列出的培养基和缓冲液的体积可能需要调整。
实施例1.步骤1-生长需要的微生物的传代培养物
1如果使用低温储液(在-70℃),将需要的细菌或真菌菌株的第一传代培养物划线到适当的琼脂平板上。在所述微生物的最佳生长温度培养适当的时间阶段。对于大部分细菌菌株,所述第一传代培养物可以用石蜡膜(ParafilmTM)包裹,并且在4℃保存多达14天。
2检验所述第一传代培养物的纯度(即,在平板上只应该存在单菌落形态)。
3从所述第一传代培养物或从临床分离物,将第二传代培养物划线到适当的琼脂平板上。在所述微生物的最佳生长温度培养适当的时间阶段。第二传代培养物应该在它第一次从温育移开的时刻开始的24小时之内使用。
4检验第二传代培养物的纯度。
不推荐在含有选择性试剂的培养基上生长传代培养物。抗生素和其它抗微生物剂可能在细菌中引发适应性胁迫反应和/或可能在群体中增加突变体的积聚。这可能导致异常的敏感性确定。
步骤2-接种组件
这一步骤,接种组件,在图5中图示。概括地,新鲜的第二传代培养物用来产生匹配1.0McFarland标准的接种物。这种溶液用生长培养基1比30稀释。将22ml的1比30的稀释液加入到本发明组件的基底的槽中。将所述装置置于摇动台上以辅助在聚苯乙烯栓上形成生物膜。
推荐下述步骤应该在生物安全柜中(如果可用的话)进行。然而,在工作台上应用无菌技术是可能的:
1.打开无菌96孔微量滴定板。对于每次高通量检测,将微量滴定板从A到F‘排’的4‘列’用180μl生理盐水溶液填充。
2.将1.5ml(对于同时接种的每个另外的装置加1.0ml)需要的肉汤生长培养基加入到无菌玻璃检测管中。
3.使用无菌棉签,收集在第二琼脂传代培养物表面上的细菌菌落。棉签顶端覆盖一薄层细菌。
4.将所述棉签浸没在肉汤中悬浮细菌。目的是产生匹配1.0McFarland标准(即3.0×108cfu ml-1)的混悬液。小心不要在溶液中形成细菌团。
5.重复步骤2,部分3和4根据需要进行多次,以匹配光学标准。
6.将29ml适当的肉汤生长培养基(例如,TSB)加入到无菌的50ml聚丙烯或玻璃管中。向所述聚丙烯或玻璃管中加入1.0ml 1.0McFarland标准细菌混悬液。这种1.0McFarland标准(即1.0×107cfu ml-1)的30倍稀释物作为所述装置的接种物。
7.打开所述装置的无菌包装。将所述接种物倒入试剂储存器中。使用无菌移液器,将22ml接种物加入到用所述装置包装的槽中。将栓盖放置到槽上。
校准在这一步骤中所用的接种物的体积,以致生物膜覆盖被步骤3(下文)设置的攻击板中所用的抗微生物剂体积完全浸没的表面积。使用更大体积的接种物可能导致在栓的高处形成生物膜,其物理地避免暴露在该攻击步骤中。
8.将所述装置放置在适当温度的湿润的培养箱中的摇动台上。所述台应该设置在每分钟3-5次摇动。关键是摇动台的角度设置在9°-16°的倾斜。这种运动必须是对称的。
9.将接种物样品连续稀释(10倍)(重复3或4次)。这些是用来检验接种物中的起始细胞数的对照。
10.在适当标记的系列琼脂平板上从10-6到10-1点滴接种接种物的连续10倍稀释物。将点滴板温育适当的时间阶段,并且为生长打分。
实施例2.步骤3-设置抗微生物攻击板
下述部分描述怎样在攻击板上设置单一抗微生物剂的连续两倍稀释梯度。这只是一个实例。抗微生物剂攻击板可以以抗微生物剂的任何组合所需要的任何方式设置。重要地是攻击板的每个孔的终体积是200μl。这是确保将生物膜完全浸没在抗微生物剂中。
1.取一个全新的无菌96孔微量滴定板,并且在层流罩超静台中将其打开。
2.在适当的生长培养基中设定需要的抗微生物剂的工作溶液。不要将所述抗微生物剂稀释超过20%(即,每4份生长培养基不超过1份储备的抗微生物剂溶液)。抗微生物剂的工作溶液应该以与在攻击板中检测的最高浓度相等的浓度制备。
3.将200μl生长培养基加入到攻击板的第1‘列’和第12‘列’。这些将分别作为无菌状态和生长对照。
4.将100μl生长培养基加入到微量滴定板的第3-11‘列’。
5.将200μl工作溶液加入到微量滴定板的第2‘列’。
6.将100μl工作溶液加入到微量滴定板的第3‘列’和第4‘列’。
7.使用多通道微量移液器,通过上下吹吸将第4‘列’的内容物混合。混合后,从第4‘列’中的孔转移100μl到第5‘列’中相对应的孔中。
8.混合,从第5‘列’转移100μl到第6‘列’。沿着微量滴定板的长连续重复这一混合和转移步骤,直到达到第11‘列’。
9.将第11列的内容物上下混合。从第11‘列’中的每个孔中吸取100μl并且弃之。
10.向第4-11‘列’的孔中加入100μl生长培养基。
11.将盖子重新放置在攻击板上。轻轻敲打板,以促进杀生物剂/抗生素和培养基的混合。
步骤4-暴露生物膜
本步骤,将生物膜暴露于一种或多种抗微生物剂,图示在图6中。简言之,将上文准备的组件从旋转摇动器上移下,并且将生物膜在生理盐水溶液中漂洗。然后将漂洗的生物膜浸没在攻击板的抗微生物剂中,并且温育需要的暴露时间。
1.在每个孔中用200μl生理盐水溶液设置无菌微量滴定板。这一板将用来漂洗栓,以从生物膜上去除松散附着的浮游细胞(这叫作‘漂洗板’)。
2.本步骤将用来确定在4个样品栓上和来自4个孔的浮游培养物的生物膜生长。对于每个接种的装置,在A排4‘列’中用200μl生理盐水溶液设置无菌微量滴定板(即,每3个装置需要1个微量滴定板)。用180μl生理盐水溶液填充B-F排。在第二个微量滴定板中,对于每个接种的装置,用180μl生理盐水溶液填充从A到H排的4‘列’。第一个微量滴定板将用来进行生物膜培养物的连续稀释,第二个将用来检验在含有接种物的微量滴定板的孔中浮游细胞的生长。
3.在需要的温育时间之后,将高通量的组件从摇动台上移下,并且移入层流罩超静台。将栓盖从槽上移下,并且将栓浸没在漂洗板的孔中。在进行下述步骤4时让所述漂洗板静置1-2分钟。
4.使用微量移液器将20μl浮游培养物(在装置的波状槽中)转移到在步骤2(直接见上文)设置的后一板‘A’排的180μl盐水中。重复这一操作3次,总共4×20μl整分试样。
5.将浮游培养物弃入适当的生物危害性废品中。
6.在层流罩超静台中,将一对镊子浸没在95%的乙醇中。在通风橱(flow hood)中用酒精灯灼烧镊子。当使用酒精灯时要小心。在使用70%乙醇消毒后手晾干之前不要点燃酒精灯,并且不要灼烧镊子。
7.使用灼烧的镊子,将栓A1、C1、E1和G1从组件的盖子折断,并且将它们浸没在步骤2设置的第一个板的A排中(并且分别在不同‘列’)的200μl的盐水中。
8.使用灼烧的镊子,将栓B1、D1、F1和H1折断并且丢弃。
9.将组件的栓盖插入到攻击板中。将所述攻击板置于适当的培养箱持续需要的暴露时间。考虑到MIC确定的扩大的次数,温育可以在备选温度进行。
10.将含有样品栓的微量滴定板置于超声清洁器(超声发生器)的托盘中。在设定的‘高’处超声5-30分钟(需要的时间取决于被检测的微生物)。由超声发生器在水中产生的振动首先从水中传播,然后通过钢制的插入盘传播,并且最后传播到所述装置,以应用振动将生物膜从96栓的表面分解到盐水中。
11.在相对应的微量滴定板的孔中连续稀释20μl浮游培养物的整分试样(来自步骤4)。一旦超声处理完成,用生物膜培养物重复这一连续稀释步骤。
12.在适当标记的系列琼脂平板上用浮游的和生物膜培养物的连续10倍稀释物点滴接种,从10-8到10-3和从10-5到10°。将点滴板温育适当的时间阶段,并且为生长打分。
步骤5-中和与恢复
本步骤,中和抗微生物剂并且恢复存活的生物膜细菌,图示在图7中。简言之,在暴露后,将生物膜在生理盐水中漂洗两次。然后,将生物膜转移到含有中和剂和恢复培养基的微量滴定板中。在水层超声发生器(watertable sonicator)中通过超声处理将生物膜分解到其中。
1.向全新的96孔微量滴定板的每个孔中加入200μl适当的恢复培养基(含有中和剂,参见部分3.2的实施例)。这一板叫作‘恢复板’。
2.为所用的每个组件准备2个漂洗板。
3.将攻击板从培养箱移出,并且置于层流罩超静台中(或者使用小心的无菌技术)。将栓盖移开并且将栓浸没在漂洗板的生理盐水中。将攻击板用漂洗板的无菌盖子盖上。大约1分钟后,将所述栓盖从第一个漂洗板转移到第二个漂洗板中。将攻击板盖上,并且如果适当保留用于MIC确定。
4.将所述栓盖从第二个漂洗板转移到上文设置的恢复板。将恢复板(包含装置的栓)转移到超声发生器的托盘中。高度超声5-30分钟(这取决于生物膜的厚度)。振动将把生物膜从96栓表面分解到恢复板中。
5.超声处理后,将栓盖从恢复板移开并且代替所述微量滴定板的原始盖子。现在所述装置的盖子可以丢弃到高压灭菌废物中。
6.将所述恢复板置于培养箱中,并且温育最少24-72小时,这取决于被检验的生物体。
存活细胞计数
为了在用抗微生物剂处理后生物膜的存活细胞计数,从恢复板转移100μl恢复培养基(含有超声的生物膜)到连续稀释板的A排。另外设置这一板以在B-F排的每个孔中含有180μl生理盐水溶液。使用多通道移液器从A排连续稀释20μl。在向微量滴定板的每排转移之间确保更换多通道移液器上的管尖(tip)。在适当标记的琼脂平板上点滴接种生物膜培养物(其已被连续稀释10倍)。温育最少48小时,以保证存活微生物的最大程度的恢复。
在温育后,计数在板上恢复的细菌。应用下部分的公式确定生物膜群体的杀死。
为了计算死亡和存活(log-kill),应用下述公式:
log-kill=log 10(初始cfu/ml)-log 10(暴露后剩余的cfu/ml)
备选地,
log-kill=log10[1/(1-%杀死(以小数))]
为了计算杀死百分数,应用下述公式:
%杀死=[1-(剩余cfu/ml)/(初始cfu/ml)]×100
为了计算存活百分数,应用下述公式:
%存活=[(暴露后剩余cfu/ml)/(初始cfu/ml)]×100
为了计算存活百分数的对数,应用下述公式:
log%存活=log10(%存活)
显微镜检
对于许多显微镜技术,可以理想地将生物膜固定在所述组件的栓表面上。可以应用下述方案来制备用于扫描电镜(SEM)和共焦激光扫描显微镜(CLSM)的生物膜。在上述标准实验步骤中,每个攻击板具有8个生长对照(在暴露之前)。这些当中的4个用作生长对照。其余4个可以用于显微镜检,而不是丢弃。
固定生物膜用于扫描电镜(SEM)
准备工作溶液
在下述步骤中戴上保护性手套,并且在通风橱中处理这些高毒性化学品。
二甲胂酸缓冲液0.1M:将16g二甲胂酸溶解在1升双蒸H2O中;调整到pH 7.2。
二甲胂酸缓冲液中2.5%的戊二醛:将2ml 70%戊二醛溶解在52ml二甲胂酸缓冲液中(产生2.5%的溶液)。还可以使用5%的溶液(2ml戊二醛在26ml二甲胂酸缓冲液中)。
标准方案
这种固定技术对于生物膜是破坏性的。然而,这允许对潜在的细菌细胞结构的检查。
1.使用一对灼烧的镊子,将栓从MBECTM-HTP装置上折断。
2.将栓在0.9%盐水中漂洗1分钟。这破坏松散附着的浮游细菌。
3.将栓在0.1M二甲胂酸(pH 7.2)的2.5%戊二醛中固定。在4℃栓在这种溶液中放置16小时。
4.在这一固定步骤之后,将栓在0.1M二甲胂酸中洗涤一次大约10分钟。
5.将栓在双蒸水中洗涤一次大约10分钟。
6.将栓在70%乙醇中脱水15-20分钟。
7.空气干燥最少24小时。
8.封固标本,并且通过SEM检查。
备选方案
这种固定技术较少破坏性。可能观察到细胞外聚合基质和一些(虽然脱水的)生物膜结构。
1.使用一对灼烧的镊子,将栓从MBECTM-HTP装置上折断。
2.将栓在0.9%盐水中漂洗2分钟。这破坏松散附着的浮游细菌。
3.将栓在0.1M二甲胂酸(pH 7.2)的2.5%戊二醛中固定。在20℃栓在这种溶液中放置2-3小时。
4.空气干燥最少120小时。
5.封固标本,并且通过SEM检查。
固定生物膜用于共焦激光扫描显微镜(CLSM)
在磷酸缓冲盐水中的5%戊二醛:将2ml 70%的戊二醛溶解在26ml磷酸缓冲盐水中(产生5%的溶液)。
标准方案
1.使用一对灼烧的镊子,将栓从盖子上折断。
2.将栓在0.9%盐水中漂洗1分钟。这破坏松散附着的浮游细菌。
3.将栓在磷酸缓冲盐水(pH 7.2)中的5%戊二醛中固定。在30℃栓在这种溶液中放置0.5-1小时。
4.将栓在0.9%盐水中漂洗1分钟。
5.将栓用适当的荧光团染色,并且使用共焦激光扫描显微镜检查。
表面包被组件的凸起
栓或凸起的表面可以用许多物质包被,以促进苛求微生物的生长。例如,由特定的念珠菌属物种(Candida spp.)形成的生物膜通过用1.0%L-赖氨酸溶液包被栓而增强。栓盖还可以用羟基磷灰石(hydroxyapetite)、胶原或铂包被。
实施例3确定MBEC值
为了确定最小生物膜根除浓度(MBEC)值,在恢复板的孔中检查浊度(视觉上的)。备选地,使用微量滴定板读数仪,获得在650nm的光密度检测(OD650)。清澈的孔(OD650<0.1)表明生物膜根除。
实施例4确定MIC值
为了确定最小抑制浓度(MIC)值,在攻击板的孔中检查浊度(视觉上的)。备选地,使用微量滴定板读数仪,获得在650nm的光密度检测(OD650)。MIC定义为抑制生物体生长的最小抗生素浓度。清澈的孔(OD650<0.1)表明在适当的培养时间后的抑制。
实施例5
背景:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa(Ps))和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(Staph))在组织和移植的表面上形成生物膜,这导致顽固的感染,由于生物膜-特异的抗性机制,所述顽固感染通常对抗微生物剂治疗没有反应。应用MIC选择用于生物膜感染的抗微生物剂治疗通常不适用。MBEC检测用于评估生物膜和浮游细菌对单一的和组合的试剂的抗微生物剂敏感性。
方法:Ps(来自囊性纤维化患者的12份分离物)和葡萄球菌(Staph)(来自与装置相关的感染的12份分离物)的生物膜在MBEC检测盖子的栓(pins)上形成。然后将生物膜和浮游细菌暴露于不同的抗生素和抗生素组合24小时(表1和2)。所述检测提供作为生物膜和浮游生物体的每种分离物对单独的或组合的抗微生物剂的定性敏感性。
结果:
表1.对单独的抗生素和抗生素组合的葡萄球菌抗性
抗生素 浮游的 生物膜 抗生素 浮游的 生物膜
GM/CLOX 1 12 VAN/GM 1 12
GM/AMP 3 12 CLIN/AMP 6 12
GM/CFZ 3 12 VAN/RIF 7 11
GM/CLIN 10 12 CIPRO/RIF 12 10
GM/RIF 12 12 CIPRO/CFZ 4 12
GM/CIPRO 9 12 CLOX/RIF 8 12
CLIN/RIF 12 12 GM 6 10
CLIN/CLOX 4 12 AMP 12 12
CLIN/VAN 4 12 CFZ 2 12
CLIN/CFZ 4 12 CIPRO 10 12
CLIN/CIPRO 10 12 VAN 6 12
VAN/CFZ 1 12 CLIN 9 12
VAN/CLOX 3 12 CLOX 3 12
VAN/CIPRO 1 12
表2.对单独的抗生素和抗生素组合的Ps抗性
抗生素 浮游的 生物膜 抗生素 浮游的 生物膜
GM/AZTR 1 12 CLO/TMS 0 3
GM/CFTZ 3 12 CFTZ/AZTR 11 12
TB/AZTR 1 12 CIPRO/AK 5 12
TB/CFTZ 3 12 CIPRO/AZTR 0 3
P+T/TB 1 12 P+T 4 12
P+T/GM 1 12 CLO 2 12
AK/AZTR 2 12 AZTR 0 9
AK/P+T 2 12 CIPRO 4 12
TB/CIPRO 3 12 GM 8 12
TB/IMP 1 12 AK 8 11
GM/IMP 8 12 TB 3 12
CLO/RIF 8 12 TMS 1 6
AK/CFTZ 2 12 CFTZ 3 12
AK/IMP 4 11 IMP 12 12
结论:对于每种菌株抗性模式是独特的。作为浮游形式,Ps和葡萄球菌菌株对多种抗生素敏感,但是作为生物膜显著更有抗性。某些抗生素当组合时比单一试剂更加有效。MBEC检测可以用于选择治疗生物膜相关的感染的抗生素。
实施例6
生物膜(bioFILM)PA抗微生物剂敏感性系统
生物膜PA面板设计用来确定浮游的和生物膜铜绿假单胞菌二者的抗微生物剂敏感性。
概述和原理
这种肉汤稀释物抗微生物剂敏感性检测具有各种单独的和组合的抗微生物剂,其稀释在由临床和实验室标准研究所TM(CLSI)定义的绝对断点浓度(categorical breakpoint concentration)的阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(CAMHB)中。使用95个栓的接种盖子,将面板孔接种浮游的和生物膜铜绿假单胞菌。然后将面板和具有栓的盖在35℃温育最少16小时。浮游生物的敏感性和抗性通过在35℃温育16-24小时后检测在抗微生物剂存在下的抑制和生长而确定。将含有已经暴露于抗微生物剂的生物膜细菌的具有栓的盖置于在96孔板中只含有CAMHB的恢复培养基中。生物膜敏感性和抗性通过检测继续在35℃温育16-24小时后的抑制和生长而确定。
方法材料
生物膜(bioFILM)PA断点面板
有盖无菌恢复面板
无菌MBEC TM具有95个栓的接种盖
无菌MBECTM托盘(用于生长接种物)
无菌漂洗面板
0.5McFarland硫酸钡浊度标准
接种物水
接种物肉汤(胰胨肉胨培养液)
检测和恢复肉汤,阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)
具有一次性管尖的100μl移液器
多通道微量移液器(推荐具有12通道的50-300μl)
摇动平台(9°倾斜角)
培养箱
25ml移液器
具有螺旋盖的无菌50ml管
定性对照生物体(铜绿假单胞菌,ATCC 27853)
定性对照报告形式
96孔微量滴定板(1个用于栓洗涤,和1个用于恢复板)
振荡器
步骤概述
A.接种物准备
CLSI推荐通过菌落计数而定时检查接种物密度。对于铜绿假单胞菌ATCC 27853的期望结果应该接近大约5×105CFU/ml2,3。
1.主要接种方法
推荐用浊度标准技术直接接种铜绿假单胞菌。
a.使用无菌木制涂布棒或细菌环,触及来自18-24小时非抑制性琼脂平板的4-5个大的或5-10个小的形态相似的、充分分离的菌落的表面。
b.在3ml接种物水(高压灭菌的蒸馏水)中乳化,并且与0.5McFarland标准进行比较。
c.振荡混悬液2-3秒。
d.将88g1标准化的混悬液移液到无菌的22ml胰胨肉胨培养液(TSB)中。紧密盖上。颠倒8-10次或者将样品振荡几秒钟以混合。
2.准备生物膜(bioFILM)PA接种栓盖
a.从包装移出MBECTM托盘和95个栓的盖(如果包装的完整性被破坏不要使用)。
b.从托盘移出栓盖。
c.吸取在TSB中的22ml铜绿假单胞菌混悬液(参见Id)到槽型托盘中。
d.将95个栓的接种盖放置在托盘上(检查栓盖正确排列以牢固地配合托盘)。
e.将组装的栓盖和托盘放置在具有大约9°倾斜的摇动平台上。排列槽,使之与摇动方向平行。在35℃温育,每分钟3-4次摇动。由于倾斜角太大或者平台摇动不对称,所以一些摇动器不适合生物膜(bioFILM)PA检测。操作者应该检查以确定摇动器满足这一检测必要的要求。
f.温育4-6小时。这足以产生约105cfu/栓的生物膜。
B.面板准备
1.从冷冻保藏中移出待用的面板。打开封袋,移出面板,并且允许平衡到室温30-60分钟。
C.浮游生物抗微生物剂敏感性检测
1.将准备好的MBECTM 95个栓的盖放置在解冻的bioFILM PA面板上。
2.应该获得3-7×105CFU/ml的最终浮游铜绿假单胞菌的孔浓度2。
3.应该通过将接种物划线到血琼脂平板上并且温育16-20小时而准备纯度板。如果在纯度板上存在不止一种菌落形态,那么保证重新分离检测菌落和重新检测所述面板。
D.抗微生物剂面板培养
1.将所述面板以3-5个为组叠放,以保证在培养过程中均匀的热量分布。
2.将所述面板在无CO2培养箱中在35℃培养16-24小时。
3.在16-24小时培养之后,浮游生物面板准备好进行读数。
4.移开带栓的盖(参见/下述部分E 1.)。
5.读取浮游生物抗微生物剂敏感性结果(参见下述F)。
E.生物膜抗微生物剂敏感性检测
1.将带栓的盖置于每孔含有200g1±10g1接种物水的96孔板中大约30秒。进行这以便从栓上去除任何残余的抗生素。
2.将带栓的盖置于每孔含有200g1 CAMHB的96孔恢复板中。
3.为了确保在培养过程中均匀的热量分布,将所述面板以每组不多于5个叠放。
4.将所述面板在无CO2培养箱中在35℃培养16-24小时。
5.培养16-24小时后,生物膜恢复面板准备好进行读数。
6.移开带栓的盖并且丢弃。
7.读取生物膜抗微生物剂敏感性结果(参见下述F)。
F.对关于浮游生物的和生物膜敏感性的面板进行读数
1.在16-20小时培养之后,移出面板。
2.用没有棉绒的棉纸擦拭面板底部,以去除可能存在的任何凝聚物或残渣。
3.在抗微生物剂孔中的生长出现混浊,其可能采取下述形式:在整个孔中的白色雾状,在孔中央的白色块状(white button),或者在整个孔中的细小颗粒生长。不充分的或没有生长定义为在孔中或肉汤中的微白色。
4.对面板进行读数的预防措施:
a.如果生长孔混浊,那么只对所述面板进行读数。
b.如果无菌对照孔(SC)混浊,或者如果在生长孔或生长对照(GC)中没有生长,那么不要对抗微生物剂敏感性孔进行读数。
G.读取浮游生物抗微生物剂敏感性:
描述 | 结论 | 编码 |
在16-20小时培养后,在更高和更低的抗微生物剂浓度的抗微生物剂中没有生长 | 敏感型 | S |
在更低浓度的抗微生物剂中生长,但是在更高浓度的抗微生物剂中不生长 | 中间型 | I |
在两种浓度的抗微生物剂中都生长 | 抗性型 | R |
结果解释
通过比较生物体的断点敏感性与可获得的抗微生物剂的血液或尿液水平,而确定敏感性。下表列出在CLSI文献M100-S9中显示的解释标准。
J.解释断点*
抗微生物剂 敏感性 中间型 抗性
阿米卡星 <16 32 >64
氨曲南 <8 16 >32
头孢吡肟 <8 16 >_32
头孢他啶 <8 16 >32
氯霉素 <8 16 >32
环丙沙星 <1 2 >4
多粘菌素E <2 - >4
庆大霉素 <4 8 >16
美罗培南 <4 8 >_16
哌拉西林/三唑巴坦 <16/4 32/4-64/4 >128/4
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 <2/38 - >4/76
妥布霉素 <4 8 >16
阿米卡星/氨曲南 <16/8 32/16 >64/32
阿米卡星/头孢吡肟 <16/8 32/16 >64/32
阿米卡星/头孢他啶 <16/8 32/16 >64/32
阿米卡星/环丙沙星 <16/1 32/2 >64/4
阿米卡星/多粘菌素E <16/2 - >64/4
阿米卡星/美罗培南 <16/4 32/8 >64/16
阿米卡星/哌拉西林/三唑巴坦 <16/16/4 32/32/4-32/64/4 >64/128/4
阿米卡星/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 <16/2/38 - >64/4/76
氯霉素/头孢他啶 <8/8 16/16 >32/32
氯霉素/美罗培南 <8/4 16/8 >32/16
环丙沙星/氨曲南 <1/8 2/16 >4/32
环丙沙星/多粘菌素E <1/2 - >4/4
环丙沙星/美罗培南 <1/4 2/8 >4/16
环丙沙星/哌拉西林/三唑巴坦 <1/16/4 2/32/4-2/64/4 >4/128/4
环丙沙星/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 <1/2/38 - >4/4/76
庆大霉素/氨曲南 <4/8 8/16 >16/32
庆大霉素/头孢吡肟 <4/8 8/16 >16/32
庆大霉素/头孢他啶 <4/8 8/16 >16/32
庆大霉素/环丙沙星 <4/1 8/2 >16/4
庆大霉素/多粘菌素E <4/2 - >16/4
庆大霉素/美罗培南 <4/4 8/8 >16/16
庆大霉素/哌拉西林/三唑巴坦 <4/16/4 8/32/4-8/64/4 >16/128/4
庆大霉素/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 <4/2/38 - >16/4/76
妥布霉素/氨曲南 <4/16 8/32 >16/64
妥布霉素/头孢吡肟 <4/8 8/16 >16/32
妥布霉素/头孢他啶 <4/8 8/16 >16/32
妥布霉素/环丙沙星 <4/1 8/2 >16/4
妥布霉素/多粘菌素E <4/2 - >16/4
妥布霉素/美罗培南 <4/4 8/8 >16/16
妥布霉素/哌拉西林/三唑巴坦 <4/16/4 8/32/4-8/64/4 >16/128/4
妥布霉素/甲氧苄啶/磺胺甲噁唑 <4/2/38 - >16/4/76
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑/氨曲南 <2/38/16 - >4/76/64
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑/头孢他啶 <2/38/8 - >4/76/32
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑/美罗培南 _<2/38/4 - >_4/76/16
甲氧苄啶/磺胺甲噁唑/哌拉西林/ <2/38/16/4 - >4/76/128/4
*基于在CLSI文献M100-S16中显示的解释断点
参考文献
1.Murray,PR.,E.J.Baron,M.A.Pfaller,F.C.Tenover和R.H.Yolken(eds)2003.Manual of Clinical Microbiology(临床微生物学手册),第8版.American Society of Microbiology Washington,D.C.(华盛顿美国微生物学会)
2.Clinical Standard Laboratory Institute TM(2006)(临床标准实验室研究所TM(2006)).Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests forbacteria that grow aerobically(用于关于需氧生长细菌的稀释抗微生物剂敏感性检测的方法);第6版.批准的标准M7-A7.
3.Clinical Standard Laboratory lnstituteTM(2006)(临床标准实验室研究所TM(2006)).Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing(关于抗微生物剂敏感性检测的性能标准);第16次信息增刊,Wayne,宾夕法尼亚CLSI文献M100-S16,Clinical and Laboratory Standards Institute(临床和实验室标准研究所),940 West Road Suite 1400,Wayne,宾夕法尼亚.
实施例7
使用在图10中所示的攻击板设置和断点,重复在实施例6中描述的实验。
实施例8
在本研究中,使用铜绿假单胞菌生物膜检测试剂盒检测在不同浓度的10种抗生素以及这些抗生素的组合的作用,并且比较抗生素对两种铜绿假单胞菌菌株CF 6649和CF 6106的作用。
基于显示抗生素组合和微生物生物膜之间的效力的初步研究结果,而选择抗生素和抗生素组合。
形成生物膜:准备生物体的混悬液,以致在TSB中的混浊度匹配1.0的McFarland标准(大约3.0X108cfu/mL)。通过1/30稀释所述混悬液而准备30mL接种物,其为107cfu/mL的初始接种物。将22mL接种物放置到本发明组件的槽中,并且更换栓盖。将所述装置放置在35℃大约9°倾斜并且每分钟3-4次摇动的摇动平台上,槽与摇动方向平行。目的是产生>105cfu/栓的生物膜;这在不到24小时的培养中获得。
96孔组织培养板用来准备攻击板。将20μL每种检测抗生素置于所述96孔组织培养板中,并且将180μL阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)加入到所述微量滴定板的每个孔中,以获得检测药物的1∶10稀释物。两个孔(G12和H12)空着或者包含200μL无菌正常盐水。G12和H12作为无菌对照。类似地,A12和B12作为生长对照。
将具有栓的盖子安放在攻击板上,并且在35℃培养24小时。
准备漂洗板,其在无菌的96孔微量滴定板中含有盐水(每孔200μL)。还准备恢复板,其在另一个96孔微量滴定板中含有CAMHB(每孔200μL)。将栓置于盐水中。将栓转移到恢复培养基中,然后高度超声处理5分钟,以去除存活的生物膜。然后将栓在35℃培养20-24小时,以允许存活的细菌生长至混浊。
通过视觉检查攻击板的孔的混浊度,并且在650nm的板读数仪上而确定浮游生物的MIC。确定在攻击培养过程中每种抗生素对从生物膜上脱落的浮游细菌的MIC(最小抑制浓度)。MIC定义为抑制生物体生长的抗生素的最小浓度。清澈的孔(A650<0.1)表示抑制。
通过读取恢复板的混浊度而确定每种抗生素的生物膜MBEC(最小生物膜根除浓度)。MBEC定义为抑制生物膜细菌在恢复培养基中再生的最小抗生素浓度。清澈的孔(A650<0.1)表示抑制。
铜绿假单胞菌MBEC检测板:GM=庆大霉素,AK=阿米卡星,CFTZ=头孢他啶,TMS=甲氧苄啶/磺胺甲噁唑,P+T=哌拉西林/三唑巴坦(浓度以哌拉西林给出),AZTR=氨曲南,IMP=亚胺培南,TB=妥布霉素,CIPRO=环丙沙星,GC=生长对照,SC=无菌对照。
浮游和生物膜形式的铜绿假单胞菌对单独的和组合抗微生物剂的敏感性可以快速(48小时)并且可重现性地确定(表1)。对于每种分离物,抗性模式是独特的。以浮游形式时铜绿假单胞菌对多种抗生素敏感,但是作为生物膜时显著更有抗性。
表1:抗单独的抗生素和抗生素组合的铜绿假单胞菌分离物的数目
抗生素 浮游的 生物膜 抗生素 浮游的 生物膜
GEN/ATM 1 12 CT/SXT 0 3
GEN/CAZ 3 12 CAZ/ATM 11 12
TOB/ATM 1 12 CIP/AK 5 12
TOB/CAZ 3 12 CIP/ATM 0 3
TZP/TOB 1 12 TZP 4 12
TZP/GEN 1 12 CT 2 12
AK/ATM 2 12 ATM 0 9
AK/TZP 2 12 CIP 4 12
TOB/CIP 3 12 GEN 8 12
TOB/IPM 1 12 AK 8 11
GEN/IPM 8 12 TOB 3 12
CT/RA 8 12 SXT 1 6
AK/CAZ 2 12 CAZ 3 12
AK/IPM 4 11 IPM 12 12
特定的抗生素当组合时比单一试剂更加有效。本检测为临床医生提供10种单独的和82种在断点浓度的抗生素组合。对于临床医生,这一检测可以用于选择治疗在囊性纤维化患者中普遍的生物膜相关的感染的抗生素。
本实验表明,每种菌株具有独特的生物膜敏感性。由于浮游形式的数据在分离物之间非常相似,所以这是令人惊讶的。这些结果清楚地表明,生物体对单独的抗生素或抗生素组合具有不同的敏感性,这取决于它们的生长条件(浮游的或生物膜)。
实施例9葡萄球菌检测板组件
开发一种原型葡萄球菌检测板,以评估可以用于治疗葡萄球菌感染的抗生素和抗生素组合。所选择的抗生素和抗生素组合是基于证明抗生素组合和微生物生物膜之间的效力的初步研究的结果。所述原型96孔板描述如下:
葡萄球菌检测板:GM=庆大霉素;CLIN=克林霉素;CFZ=头孢唑啉;CLOX=氯唑西林;RIF=利福平;VAN=万古霉素;LIZD=利奈唑胺;AMP=氨苄青霉素舒巴坦合剂(ampicillin sublactamj);Cipro=环丙沙星;GC=生长对照;SC=无菌对照
浮游和生物膜形式的金黄色葡萄球菌对单独的和组合抗微生物剂的敏感性可以快速(约48小时之内)并且可重现性地确定(表2)。对于每种分离物,抗性模式是独特的。以浮游形式时金黄色葡萄球菌对多种抗生素和抗生素组合敏感,但是作为生物膜时显著更有抗性。
表2:抗单独的抗生素和抗生素组合的金黄色葡萄球菌分离物的数目
抗生素 浮游的 生物膜 抗生素 浮游的 生物膜
GEN2/CLO 2 10 CLIN1/CIP 9 12
GEN4/CLO 0 10 CLIN2/CIP 10 12
GEN2/AMP 0 09 VAN2/CFZ 0 12
GEN4/AMP 1 12 VAN4/CFZ 1 12
GEN2/CFZ 3 09 VAN2/CLO 0 12
GEN4/CFZ 1 10 VAN4/CLO 0 12
GEN2/CLN 5 12 VAN2/CIP 1 12
GEN4/CLN 7 12 VAN4/CIP 0 12
GEN2/RIF 11 09 VAN2/GM 0 09
GEN4/RIF 11 10 VAN4/GM 0 08
GEN2/CIP 4 11 CLI1/AM 4 12
GEN4/CIP 2 11 CLI2/AM 2 12
CLIN1/RIF 10 12 VAN4/RIF 7 10
CLIN2/RIF 10 12 VAN8/RIF 7 11
CLIN1/CLO 2 12 CIP2/CFZ 3 09
CLIN2/CLO 2 12 CIP4/CFZ 7 10
CLIN1/VAN 1 12 CIP2/RIF 4 12
CLIN2/VAN 0 12 CIP4/RIF 3 11
CLIN1/CFZ 4 12 CLO2/RIF 5 12
CLIN2/CFZ 2 12 CLO4/RIF 4 12
GM2 4 11 CIP2 7 12
GM4 3 10 VAN2 5 12
AMP4/2 10 12 VAN4 1 12
AMP8/4 10 12 CLI1 8 12
CFZ4 4 12 CLI4 5 12
CFZ8 6 12 CLO2 2 12
CIP1 7 12 CLO4 2 12
某些抗生素当组合时比作为单独的试剂更加有效。本检测为临床医生提供10种单一的和82种在断点浓度的抗生素组合。
这一实验表明,每种菌株具有独特的生物膜敏感性。由于浮游形式的数据在分离物之间非常相似,所以这是令人惊讶的。这些结果清楚地表明,生物体对单独的抗生素或抗生素组合具有不同的敏感性,这取决于它们的生长条件(浮游的或生物膜形式)。
实施例10:比较浮游和生物膜形式的念珠菌属物种和烟曲霉对抗真菌剂的敏感性
三种念珠菌的临床分离物用于本研究,包括一种白念珠菌(albicans)和两种非白念珠菌物种。白念珠菌(C.albicans)ATCC 14053从卡尔加里大学(University Of Calgary)生物科学系获得。热带念珠菌(C.tropicalis)99916和光滑念珠菌(C.glabrata)14326从进行连续流动腹膜透析(continued ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)的患者的渗析液中获得。还检测烟曲霉。
使用本发明的组件,进行念珠菌属和曲霉属生物膜的生物膜形成和抗微生物剂敏感性的检测。所述装置特征在于具有分布在盖子上的96个栓或凸起的微量滴定板盖。每个栓为微生物提供附着、定居和形成均一的生物膜的表面。所述栓正好啮合标准96孔微量滴定板的孔。盖子与具有用于生长、洗涤和培养真菌的专用槽的基底联合使用。从Sabouraud葡聚糖琼脂(SDA)(BBL微生物系统,科克艾斯维尔,Md)上的24小时培养物挑取念珠菌物种的菌落,并且置于Mueller-Hinton肉汤(MHB)(Difco实验室,底特律,密歇根州.),以致混悬液匹配1.0的McFarland标准。然后将这一混悬液在MHB中1∶30稀释,并且移取25ml到基底的槽室中。将闭合的组件(具有栓的盖子放置在基底上)放置在37℃培养箱中设置成每分钟摇动板3.5转的Hoeffer Red摇动器(VWR,科学(Scientific))上。白念珠菌和热带念珠菌进行有氧培养,而光滑念珠菌在10%CO2中培养。在初步实验中确定,光滑念珠菌需要10%CO2氛围用于形成生物膜。
在接种后1,2,3,4,5,6,7,22,23,24和26小时,通过随机从所述装置的盖子上移下3个栓,而获得关于每种分离物的生长曲线。将移下的栓放置在含有200μl盐水的微量离心管中,并且超声处理(Aquasonic超声发生器,VWR科学(Scientific),)5分钟。进行连续稀释,并且在SDA上进行存活的念珠菌物种细胞的平板计数。将含有22小时念珠菌物种生物膜的其它栓用在磷酸缓冲的盐水溶液(PBSS)中的2.5%戊二醛进行固定,风干过夜,并且准备用于扫描电镜。
在初步研究中确定形成烟曲霉生物膜的最佳条件。首先将栓在1%L-赖氨酸(希格玛化学公司,圣路易斯,Mo)中浸泡过夜,然后在层流罩超静台内风干。将50μl体积的烟曲霉孢子混悬液添加到在500ml锥形瓶(Erlynmeyer flask)中的250ml胰胨豆胨培养液(TSB)(Difco,底特律,密歇根州)中。将所述烧瓶在37℃以150rpm摇动20小时。将在液体肉汤顶部的玻璃上生长的附着菌丝体细胞用无菌棉签移下。将这转移到具有平衡到4℃的250ml新鲜TSB的混合器(韦林氏(Waring))中。菌丝体以中等速度在冰上搅拌2分钟。这重复3次。然后将烟曲霉混悬液(25ml)转移到生物膜生长装置的槽中。将包含赖氨酸-处理的栓的盖子放置在混悬液中,并且将所述装置转移到上文所述的Red摇动器上。将板在37℃培养25小时,在每个栓上形成明显的生物膜。对包含24小时曲霉属生物膜的栓进行扫描电镜检查。
最小生物膜根除浓度检测
生物膜敏感性检测使用所述组件的具有栓的盖子,现在其含有在托盘中摇动24小时后形成的生物膜。将盖子上的每个栓在96孔微量滴定板(Falcon)中的200μl磷酸缓冲的盐水溶液(PBSS)中轻轻洗涤一次。然后将具有栓的盖子转移到另一个96孔微量滴定板中,所述板含有在200μlRPMI 1640(希格玛,圣路易斯,Mo)或含有1%DMSO的RPMI 1640(参见测试药物部分)中的2倍稀释的抗真菌剂。在栓暴露于药物24小时后,移下具有栓的盖子,并且在盐水中轻轻漂洗两次。然后将具有栓的盖子放置在含有RPMI 1640恢复培养基的96孔板中。将所述栓在超声发生器中超声处理5分钟(念珠菌属物种)或7分钟(曲霉属),以将附着的细胞去除到恢复培养基中。将20μl恢复培养基的整分试样点滴接种在SDA(念珠菌属物种)或四碘四氯荧光素琼脂(烟曲霉)上,以获得MBEC。所述组件还用来确定最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)。在650nm检测含有抗生素和从生物膜上脱落的浮游细胞的孔的混浊度,以获得MIC。将来自每个孔的20μl样品也点滴接种在Sabouraud葡聚糖琼脂(念珠菌属物种)或四碘四氯荧光素琼脂(烟曲霉)上,以获得MFC。
念珠菌属物种和烟曲霉的浮游形式敏感性:
按照临床实验室标准国家委员会(National Committee for Clinicallaboratory Standards,NCCLS)的指导,确定最小抑制浓度(MIC)和最小杀真菌浓度(MFC)。简言之,在铺板之前将念珠菌属物种在-70℃保存在聚苯乙烯球体上。在开始检测之前24小时将这些生物体划线到Sabouraud葡聚糖琼脂(Microbiologie)板上。从所述琼脂板上挑取24小时菌落,并且放置于Muellar-Hinton肉汤(MHB,Microbiologie)中,以致浊度匹配0.5的McFarland标准。然后,将这1∶10稀释在MHB中,以获得大约1×105-5×105CFU/ml的混悬液。将5μl体积的这一混悬液添加到在96孔微量滴定板(Nunclon)的孔中,所述孔中含有连续稀释在RPMI 1640培养基(希格玛)中的200μl抗真菌剂。在检测前烟曲霉以孢子混悬液保存在4℃。将所述孢子混悬液(50μl)稀释到250ml TSB中,并且将5μl这一混悬液添加到含有上述抗真菌剂稀释液的每个检测孔中。
然后,将检测孔与所述抗真菌剂一起在37℃温育24小时。在温育后通过在微量滴定板读数仪(Softmax,VWR)上在650nm读取浊度,而获得念珠菌的MICs。还将20μl每个孔的整分试样铺板(SDA),并且在37℃培养24小时后从它们获得MFCs。关于曲霉属MFCs这样确定:通过将来自每个孔的100μl铺板到四碘四氯荧光素琼脂上,然后用无菌玻璃涂布器涂布。在菌落计数前将接种的生物在25℃保存3天。
检测的药物。伊曲康唑,氟康唑,和酮康唑从在比利时布鲁塞尔的杨森制药(Janssen Pharmaceuticals)获得。制霉菌素5-氟胞嘧啶,灰黄霉素,两性霉素B和多粘菌素B从希格玛化学公司,圣路易斯,Mo获得。5-氟胞嘧啶,多粘菌素B硫酸盐和制霉菌素溶解在双蒸水中到浓度10.24mg/ml,并且在检测孔在1024μg/ml-0.125μg/ml范围内稀释在RPMI中。两性霉素B溶解在纯二甲亚砜(dimethylsulfoxone)(DMSO)中至51.2mg/ml的浓度最大值。将这连续稀释,以获得在检测孔中在RPMI 1640(希格玛,圣路易斯,Mo)和1%DMSO中的512μg/ml到0.016μg/ml的两性霉素B。氟康唑,伊曲康唑,酮康唑和灰黄霉素溶解在纯DMSO中到浓度102.4mg/ml,并且进一步稀释,以获得在检测孔在RPMI 1640和1%DMSO中的1024μg/ml到0.032μg/ml药物的范围。
为了确定1%DMSO对真菌细胞的作用,含有在RPMI 1640中1%DMSO而没有药物的对照孔与所有含有DMSO的检测孔平行进行。另外,所有的检测都包括不进行接种的无菌对照孔,以及不含抗真菌剂的生长对照孔。
生物膜在装置表面上的生长:每个念珠菌物种在所述装置的每个栓上形成生物膜,以在接种后22小时之后达到105-106CFU/栓。光滑念珠菌是最苛求菌,需要10%CO2来形成生物膜。当有氧培养时,20小时之后,光滑念珠菌只生长大约5×103CFU/栓,而在10%CO2中它生长到平均4.1×104CFU/栓。曲霉属生物膜似乎更紧密地附着到栓上。在24小时培养之后,曲霉属生长至105CFU/栓(数据未显示)。
对于念珠菌的所有物种,在MBEC装置的栓上形成的生物膜都是相似的。念珠菌细胞均一地包被整个栓,并且包入大量外泌多糖基质。念珠菌细胞在某些区域生长为伸长细胞的凸起的簇。曲霉属生物膜由在24小时后云集在整个栓上的规律的分生孢子梗组成。外泌多糖附着到栓表面,并且包围每个曲霉属分生孢子梗。
抗真菌敏感性:抑制浮游的细胞(MIC)、杀死浮游的细胞(MFC)和杀死生物膜真菌(MBEC)所需要的抗生素浓度总结在表3中。从NCCLS方法和从在所述装置栓上形成的生物膜释放的浮游细胞而获得的MIC和MFC值类似或者相同。从所述装置获得的MIC和MFC是高度可重现性的。真菌生物膜普遍比浮游细胞更难消除(表3)。
对于所有检测的念珠菌物种,获得相似的结果。一般地,MBEC超过MIC或MFC几个数量级。尽管两性霉素B(Amphoteracin B)、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑都有效杀死浮游的念珠菌细胞,但是只有制霉菌素有效抗生长为生物膜的相同念珠菌。例如,两性霉素B,一种多烯抗真菌药,发现当用于抗白念珠菌的浮游培养物时,其具有0.09μg/ml的平均MIC和0.02μg/ml的平均MFC。相反,杀死白念珠菌的生物膜细胞需要平均12μg/ml的同一种药物。灰黄霉素和多粘菌素B对浮游的和固着的念珠菌无效。
由于曲霉属细胞在96孔微量滴定板中成团,这使得通过板读数仪进行分析变得不准确,所以不能获得烟曲霉的MIC。MFC值(通过将100μl的孔内容物点滴接种到四碘四氯荧光素琼脂上而获得)表明浮游曲霉属对两性霉素B、伊曲康唑、酮康唑和制霉菌素的敏感性(表1)。相反,即使在最高的检测浓度,也没有一种抗真菌剂有效抗烟曲霉生物膜。
即使在极高的浓度,唑类药物抑制,但不杀死生物膜细胞。在药物治疗之后,能生存的细胞的存活不是有利结果,并且可能助于产生念珠菌的唑类-抗性菌株(8)。可以推测,这些药物对消除生物膜细胞的失败在于它们必须被细胞主动吸收。减小的药物摄取率或这些生物膜生物体对外泌多糖的抑制可能防止药物到达它的靶点酶。小于或等于8μg/ml的抗念珠菌物种的氟康唑MIC表明所述物种对所述药物敏感(16)。按照这些标准,检测的白念珠菌和热带念珠菌菌株将归类为对氟康唑敏感。然而,对于氟康唑和伊曲康唑的MBEC值(>1024μg/ml)大大超过这两种分离物的64μg/ml的断点,这表明所述生物膜细胞是抗性的。尽管氟康唑和伊曲康唑只是已经确定这些试验性断点的药物,但是对于酮康唑和5-氟胞嘧啶观察到相同的趋势。这可以解释为什么唑类通常对治疗某些慢性念珠菌病和念珠菌相关的移植装置的病例无效(4,5,12)。
多烯,制霉菌素和两性霉素B,是消除念珠菌生物膜的最有效的试剂。然而,在临床情形中两性霉素B 16μg/ml的MBEC可能达不到——允许的人血清峰值浓度为2μg/ml。所述多烯在真菌的血浆膜上作用而不需要吸收到细胞中的能力可以解释它们在所检测的抗生物膜细胞的药物中相关的有效性。
一旦提供蛋白表面,诸如L-赖氨酸,曲霉属就容易在栓表面形成规律的生物膜。曲霉属生物膜的形态特征与在组织内和在医学装置上存在的生物膜没有不同。尽管所述生物膜很快形成,但是它仍然抵抗所有检测的试剂。如同念珠菌生物膜,似乎生长速率不影响抗性。在曲霉属生物膜中观察到大量的外泌多糖,其可能对抗性很重要。对于侵入性肺部、窦和大脑曲霉病使用两性霉素B治疗的患者的初步死亡率报道分别为86%,66%和99%。只有54%的病例对14天的治疗表现出任何反应。尽管多烯对曲霉属表现出体外功效,但是它们主要影响侵入性曲霉病的治疗。MBEC检测的结果将预测这种治疗失败。尽管迄今为止还没有消除烟曲霉的备选的化学治疗剂,但是所述组件可以用于筛选可能有潜力开发成有前途的治疗的试剂。
应该确定药物的体外成功不能外推到治疗方法的成功,但是药物的体外失败应该预测治疗的失败。从本研究中,预测唑类,5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、和多粘菌素B在治疗生物膜念珠菌感染中不成功,而多烯可能有效或可能无效。
从本研究清楚的是念珠菌和曲霉属物种附着到塑料上,并且生物膜的形成趋向于允许这些生物体耐受暴露于比在分批培养中生长的相同物种高出许多倍的浓度的抗微生物剂中。当它们能够以生物膜形式生长时,特征性描述抵抗分批培养的生物体的抗真菌剂不再是令人满意的。为了准确评估特别的试剂清除生物膜生物体感染的能力,由于发现它们将在宿主中或天然存在,即,表现出深刻改变的生理并且包在保护性外泌多糖基质中,所以敏感性检测应该在细胞上进行。
实施例11
如上文所述,本发明的装置可以负载一种或多种抗生物膜试剂。可能的抗生物膜试剂的不完整和代表性列表包括,但不限于:抗生素,包括但不限于下述种类和在种类中的成员:氨基糖苷类,如庆大霉素,妥布霉素,奈替米星,阿米卡星,卡那霉素,链霉素,新霉素,喹诺酮类/氟喹诺酮类,萘啶酸,西诺沙星,诺氟沙星,环丙沙星,甲氟哌酸,氧氟沙星,依诺沙星,氟罗沙星,和左氧氟沙星;抗假单胞菌药,如羧苄西林,卡茚西林,替卡西林,阿洛西林,美洛西林,哌拉西林头孢菌素类,头孢噻吩,头孢匹林(Cephaprin),头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢唑林头孢孟多,头孢西丁,头孢克洛,头孢呋辛,头孢替坦,头孢雷特,头孢呋辛醋氧乙酯,头孢尼西头孢噻肟,拉氧头孢,头孢唑肟,头孢曲松,头孢哌酮,头孢他啶(Cftazidime),其它头孢菌素类,如头孢噻啶,和头孢磺啶;其它β-内酰胺;抗生素,如亚胺培南,氨曲南β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸,力百汀,舒巴坦;磺胺类药,如磺胺,磺胺甲噁唑,磺胺醋酰,磺胺嘧啶,磺胺异噁唑,磺胺西汀,磺胺多辛,磺胺米隆,对-氨基苯甲酸,甲氧苄啶-磺胺甲噁唑;尿道抗菌药,如乌洛托品,呋喃妥因,非那吡啶和其它萘基吡啶药;青霉素类药,如青霉素(Penicillin G)和青霉素V,青霉素酶抗性甲氧西林,萘夫西林,苯唑西林,氯唑西林,用于革兰氏-阴性菌的双氯西林青霉素/氨基青霉素药氨苄青霉素(多链丝霉素),阿莫西林,环青霉素,巴氨西林;四环素类,如四环素,氯四环素,地美环素,美他环素,多西环素,二甲胺四环素;其它抗生素,如氯霉素(Chlormycetin),红霉素,林可霉素,克林霉素,大观霉素,多粘菌素B(多粘菌素E),万古霉素,杆菌肽;结核病药,如异烟肼,利福平,乙胺丁醇,吡嗪酰胺,Ethinoamide,对氨水杨酸,环丝氨酸;抗真菌剂,如两性霉素B,环胞菌素,氟胞嘧啶咪唑类和三唑类酮康唑,咪康唑,伊曲康唑,氟康唑,灰黄霉素;局部抗真菌剂,如克霉唑,益康唑,咪康唑,特康唑,布康唑,奥昔康唑,硫康唑,环吡酮胺,卤普罗近,托萘酯,萘替芬,多烯,两性霉素B,那他霉素
实施例12
使用96-栓盖和槽的高通量筛选(HTP)检测
提供的方法是一个怎样使用本发明的装置和方法评估化合物抗生物膜和浮游细菌的抗微生物活性的实例。
材料列表:
无菌盖和槽(1)
无菌96孔组织培养板(3)
平台摇动器(倾斜角度大约9°)
超声发生器
针头(needle nose)镊子(任选)
方法描述
形成生物膜:
1.使用来自新鲜过夜划线的平板的单一菌落,制备所述生物体的混悬液,以致在TSB或其它适当的培养基中浊度匹配1.0的McFarland标准(大约3.0×108cfu/mL)。通过将所述混悬液1/30稀释,而制备30mL接种物,初始接种物为107cfu/mL。苛求生物体可能需要补充的培养基以在肉汤中生长。
2.打开无菌生长组件。将22mL接种物加入到槽中,并且更换栓盖。将所述装置放置在35℃大约9°倾斜并且每分钟3-4次摇动的摇动平台上,槽与摇动方向平行。目的是产生>105cfu/栓的生物膜,通常24小时的培养是足够的。
注意:由于倾斜角太大或者平台摇动不对称,所以一些摇动器不适合所述检测。操作者应该检查以确定摇动器满足这一检测必要的要求。
3.稀释并且点滴接种接种物样品,以检查接种物数目(应该包含大约1×107cfu/mL),并且检测在所述培养物中的污染物。
4.无菌对照(任选)。使用酒精灼烧的镊子,折断栓A1、B1、C1和D1,以致不再存在细菌能够附着的凸起。这些位置将作为本检测的无菌对照。
第2天:抗生素储液:
抗生素储液应该提前制备,并且保存在-70℃。去离子水或适当的溶剂用来制备5120μg/ml活性剂的储液。参考NCCLS文献M100-S8关于应该使用哪些溶剂和稀释剂的详细内容。以250μL的整分试样(足够用于2个攻击板)保存储液。在-70℃大部分抗生素的储液稳定最少6个月。
第2天:制备抗生素攻击板:
1.使用96孔组织培养板来准备攻击板。指定要在本检测中检测的抗生素,并且将它们分配在A-H排。这一板设置将允许以10种浓度的8种不同的抗生素进行检测。
注意:MBEC板适合96孔板(例如Nunc),但是不是所有96孔板都兼容。
2.制备1024μg/mL的工作溶液,这通过将200μL 5120μg/mL的储液加入到800μL阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)中进行,其提供用于两排的足够的工作溶液。工作溶液必须在它们制备的同一天使用。
3.攻击板可以怎样制备的一个实例如下:
将200μL CAMHB加入到A1,B1,C1和D1孔中。这些将作为无菌对照。
将200μL CAMHB加入到#2列A-H孔中。这些将作为生长对照。
将100μL CAMHB加入到第4-12列的所有孔中。这些将用来稀释抗生素的工作浓度。
将200μL指定抗生素的工作溶液加入到第3列的孔中。
将100μL抗生素的工作溶液加入到第4和5列的孔中。
使用8通道移液器准备稀释液,在列之间更换管尖:#5孔:混合并且转移100μL到#6孔;#6孔:混合并且转移100μL到#7孔,继续直到#12孔;#12孔:混合并且弃掉100μL。
将100μL CAMHB加入到第5-12列的孔中,以使得所有孔的体积达到200μL。这种稀释方案将导致在第3列中1024μg/mL的抗生素浓度减少到第12列中的2μg/mL。这些浓度可以相应调整,以适合研究的需要。
生物膜的抗生素攻击:
1.准备0.9%盐水的漂洗板(每孔200μL)。通过将栓放入漂洗板中大约1分钟,而漂洗来自栓的浮游的细菌。
2.生物膜接种物检查(任选):使用灼烧的镊子,移下栓E1、F1、G1和H1,将每个栓放置在稀释板的200μL盐水中。将样品栓E1-H1高度超声处理5分钟,以使生物膜细菌移下,然后连续稀释至10-7,并且点滴接种到TSA(或适当的培养基)上,并且培养过夜以确定cfu/栓。
3.将具有剩余的栓的盖子转移到攻击板上,并且在35℃培养24小时。
恢复存活的生物膜
1.在无菌96孔微量滴定板中准备盐水漂洗板(每孔200μL)。
2.在另一个96孔微量滴定板中准备CAMHB恢复板(每孔200μL)。
3.将栓在盐水中漂洗大约1分钟。不要丢弃攻击板。将栓转移到恢复培养基中,然后高度超声处理5分钟,以移下存活的生物膜。丢弃栓盖,并且盖上恢复板。在35℃培养20-24小时,以允许存活的细菌生长至混浊。如果需要关于每个孔的存活cfu/栓的数据,可以在超声步骤后立即从恢复板的每个孔取出50μL,并且转移到稀释板,在盐水中连续稀释,并且点滴接种(100-107)到适当的培养基上。
确定浮游生物的MIC
1.检查攻击板的孔的混浊度(视觉上)或者在650nm板读数仪上检查。
2.确定在攻击培养过程中每种抗生素对从生物膜上释放出来的浮游细菌的MIC。MIC定义为抑制生物体生长的最小抗生素浓度。清澈的孔(A650<0.1)表明抑制。
3.记录每种抗生素的MIC值。
确定生物膜MBEC
1.通过读取恢复板的浊度而确定每种抗生素的MBEC。MBEC定义为抑制生物膜细菌在恢复培养基中再生的最小抗生素浓度。清澈的孔(A650<0.1)表示抑制。
2.记录每种抗生素的MBEC值。
实施例13
使用96孔微量滴定板检测生理和遗传(P&G)
使用96孔微量滴定板,可以形成不同生物体的多种生物膜,或者同种生物体的等价生物膜。这种方法可以用于研究生物膜形成或抗微生物剂检测中的变量。应该注意,这种检测可以用来筛选生物膜形式的遗传突变体,用来比较不同分离物或不同物种的细菌的MBEC值,用来比较生长为生物膜的不同分离物中的基因表达,或者用于需要不同分离物的生物膜的许多其它形式中。
下文所述的方法描述用于检测生长为生物膜的多种生物体针对单一抗微生物剂的测定。
材料列表:
无菌盖子和托盘
无菌96孔组织培养板(3)
旋转摇动器
超声发生器
针头镊子(任选)
方法描述
第1天:形成生物膜:
1.使用来自新鲜过夜划线的平板的单一菌落,准备每种生物体(最多12种/板)的混悬液,以致在TSB或其它适当的培养基中浊度匹配1.0的McFarland标准(大约3.0×108cfu/mL)。
2.1/30稀释以获得107cfu/mL的接种物。在指定的列,每测试孔放入150μL每种生物体的起始接种物。列可以设置成最多检测8种分离物,1个孔作为生长对照和11种抗生素浓度,或者12种分离物,1个孔作为生长对照,和7种抗生素浓度(如果需要,1列可以指定为无菌对照)。
3.打开无菌组件。将所述盖子放置在含有细菌接种物的96孔微量滴定板上。将所述装置放置在35℃大约150rpm的旋转平台上。一些物种可能需要更低的培养温度或增加的CO2。目的是产生>105cfu/栓的生物膜;通常24小时的培养是足够的。
4.稀释并且点滴接种接种物样品,以检查接种物数目(应该包含大约1×107cfu/mL),并且检测在所述培养物中的污染物。
第2天:抗生素储液:
抗生素储液应该提前制备,并且保存在-70℃。去离子水或适当的溶剂用来制备5120g/ml活性剂的储液。参考NCCLS文献M100-S8关于应该使用哪些溶剂和稀释剂的详细内容。在-70℃大部分抗生素的储液稳定最少6个月。
第2天:准备抗生素攻击板:
1.使用96孔组织培养板来准备攻击板。
注意:所述板适合96孔板(例如Nunc),但是不是所有96孔板都兼容。
2.将在阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)中制备的每种检测抗生素浓度置于在需要的范围内2倍稀释的抗生素的微量滴定板的一排中(每孔200μL总体积)。
第2天:生物膜的抗生素攻击:
1.准备0.9%盐水的漂洗板(每孔200μL)。通过将栓放入漂洗板中大约1分钟,而漂洗来自栓的浮游的细菌。
2.将所述栓盖转移到攻击板上,并且在35℃培养24小时。
第3天:恢复存活的生物膜
1.在无菌96孔微量滴定板中准备盐水漂洗板(每孔200μL)。
2.在另一个96孔微量滴定板中准备CAMHB恢复板(每孔200μL)。
3.将栓在盐水中漂洗大约1分钟。不要丢弃攻击板。将栓转移到恢复培养基中,然后高度超声处理5分钟,以移下存活的生物膜。丢弃栓盖,并且盖上恢复板。在35℃培养20-24小时,以允许存活的细菌生长至混浊。
注意:如果需要关于每个孔的存活cfu/栓的数据,可以在超声处理步骤后立即从恢复板的每个孔取出50μL,并且转移到稀释板,在盐水中连续稀释,并且点滴接种(100-107)到适当的培养基上。
第3天:确定浮游生物的MIC
1.检查攻击板的孔的混浊度(视觉上)或者在650nm板读数仪上检查。
2.确定在攻击培养过程中每种抗生素对从生物膜上释放出来的浮游细菌的MIC(最小抑制浓度)。MIC定义为抑制生物体生长的最小抗生素浓度。清澈的孔(A650<0.1)表明抑制。
3.记录每种抗生素的MIC值。
第4天:确定生物膜MBEC
1.通过读取恢复板的浊度而确定每种抗生素的MBEC(最小生物膜消除浓度)。MBEC定义为抑制生物膜细菌在恢复培养基中再生的最小抗生素浓度。清澈的孔(A650<0.1)表示抑制。
2.记录每种抗生素的MBEC值。
尽管已经描述了一些优选的实施方案,但是本领域的技术人员应该理解,在不背离本发明范围下可以进行各种改变和改进。在前述说明书中的术语和表述用于本文作为描述的术语,并且没有限制,并且在应用所述术语和表述时没有排除所示和所述的特征的等价物或其部分的目的,它被视作仅由下述权利要求定义和限定的本发明的范围。
Claims (11)
1.一种处理一种或多种生物膜的方法,其包括:a)生长生物膜,其中所述生长包括使生物膜经受剪切力;b)将所述生长的生物膜在攻击板上暴露于一种或多种抗生物膜试剂;c)在恢复板上移下并且中和所述暴露的生物膜;d)通过评估任何生物膜在所述攻击板上的生长而确定MIC值;e)通过评估任何生物膜在所述恢复板上的生长而确定MBEC值;和f)通过评估所述恢复板可存活细胞计数而确定MBC值。
2.一种处理一种或多种生物膜的方法,其包括选择抗生物膜试剂的有效组合,其中有效的组合基本上由两种或多种相同或不同剂量的活性剂组成;将所述生物膜与抗生物膜试剂的组合接触;并且对于每种组合,确定MIC、MBEC、MBC、或它们的组合。
3.权利要求1的方法,其中确定MIC、MBEC和MBC值。
4.权利要求1的方法,其还包括在接触步骤之后,中和所述抗生物膜试剂。
5.权利要求3的方法,其还包括分解并且收集所述生物膜。
6.一种用于检测固着微生物的MBEC检测,其包括在预选的第一板上形成生物膜;移下所述生物膜并且将所述生物膜放置在第二板上;将所述生物膜暴露于至少一种活性剂;和确定所述活性剂抗所述生物膜的效力。
7.一种用于确定生物膜的MIC、MBEC和MBC值和确定适合处理所述生物膜的组合物的处理方法,其包括:1)提供具有第一基底和第一盖子的第一组件,所述第一盖子具有从其上延伸出来的凸起,所述第一组件设置成在一个或多个凸起上生长一种或多种生物膜;2)提供包含第二基底和所述第一盖子的第二组件,所述第二组件设置成将在所述凸起上的生物膜暴露于一种或多种抗生物膜试剂;3)提供包括第三基底和所述第一盖子的第三组件,所述第三组件设置成漂洗在所述凸起上的任何生物膜;和4)包括第四基底和所述第一盖子的第四组件,所述第四组件设置成并且适于将所述生物膜从所述凸起上移下。
8.权利要求7的处理方法,其包括提供具有预先负载营养组合物的第一基底的第一组件。
9.权利要求7的处理方法,其包括提供具有预先负载一种或多种生物膜试剂的第二基底的第二组件。
10.权利要求7的处理方法,其包括提供具有预先负载漂洗组合物的第三基底的第三组件。
11.权利要求7的处理方法,其包括提供具有预先负载恢复组合物的第四基底的第四组件。
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