KR20120003965A - 바이오필름 감염에 대한 항생제 선택용 플레이트 - Google Patents

바이오필름 감염에 대한 항생제 선택용 플레이트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오필름으로서 성장하는 미생물에 대해 효과적인 항생제 조합을 선택하는데 이용될 수 있는 진단 플레이트이다. 플레이트는 다수의 돌출부상에서 바이오필름이 성장가능하게 하며, 항-바이오필름 제제의 조합 및 독립적 농도로 플레이트의 모든 돌출부상의 바이오필름을 후속 시험이 가능하게 한다. 항생제에 대한 미생물의 내성은 이들이 항생제 민감도 수준을 측정하는데 일반적으로 사용되던 부유 상태로 성장할 경우와 비교하여, 바이오필름으로서 성장하는 경우 더 높다. 항-바이오필름 제제 시험에서 바이오필름을 제거하는 미생물의 성장은 최소 억제 농도 (MIC)를 결정하며, 이는 부유 상태의 미생물의 민감도에 관련된 것이다. 후속 회수 단계에서 바이오필름으로부터 생존한 미생물의 성장은 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC)를 결정하며, 이는 바이오필름으로서 성장한 미생물의 민감도에 관련된 것이다. 회수 단계에서 생존한 미생물의 계수는 최소 살균 농도 (MBC)를 결정한다.

Description

바이오필름 감염에 대한 항생제 선택용 플레이트 {PLATE FOR SELECTION OF ANTIBIOTICS AGAINST BIOFILM INFECTIONS}
본 발명은 바이오필름의 분석 및 항균제 또는 항-바이오필름 제제, 바람직하게는, 항-바이오필름 제제 예컨대, 항생제 또는 살균제의 조합물에 대한 미생물 민감성을 측정하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 특히, 낭포성 섬유증 (CF) 환자에서 폐 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 바이오필름 질환을 치료하는데 있어서 증가된 효력을 갖는 적합한 개개의 항-바이오필름 제제 또는 이들의 조합물을 선택하는 방법 및 장치를 포함한다.
본 발명은 바이오필름 질환의 치료를 위해 증가된 효력을 갖는 적합한 항-바이오필름 제제를 선택하는 방법 및 장치를 제공한다.
미생물의 특성 결정은 관습적으로, 회분 배양 (batch culture) 연구 방법을 이용하였으며, 여기서, 유기체는 분산되거나 부유된 상태로 존재한다. 지난 25년에 걸쳐, 많은 환경에서 박테리아 바이오매스의 주요 성분은 고착성 박테리아인 것으로 인식되었다. 미생물 생태학 분야에서 최근의 기술적 진보로 인해 세균이 실질적으로 자연상태 및 질환에 존재하는 경우의 세균의 면밀한 연구가 가능해졌다. 이러한 연구는 대부분의 미생물이 바이오필름에서 성장할 수 있으며, 바이오필름에서의 유기체의 성장은 회분 배양시 동일한 유기체의 성장과 물리적 및 생리학적으로 상이하다는 것을 보여주었다. 이러한 차이는 이들 유기체의 병인 및 항균제에 대한 이들의 민감성 둘 모두에서의 관찰된 변화에 기여한다. 항생제 내성은 일반적으로 미생물 생태의 변화 및 보호성 엑소폴리사카라이드 매트릭스의 생성에 기인한다.
그램-네거티브 로드인 P. 애루기노사 (P. aeruginosa)는 매우 다양한 산업, 상업 및 처리 작업시 예컨대, 하수도, 재활수 시스템 (냉각 타워, 에어 컨디셔닝 시스템 등), 물 응축 콜렉션, 페이퍼 펄핑 작업 및 일반적으로, 물 함유, 조작, 치료, 수집, 등의 시스템에서 발견되는 많은 유기체중 하나이다. 바이오필름은 물 조작 시스템에서 편재되어 있기 때문에, P.애루기노사가 또한, 이들 바이오필름과 관련되어 발견된다는 것은 놀랍지 않다. 많은 경우, P.애루기노사는 주요 미생물 요소이다.
산업 공정에서의 중요성에 더하여, P.애루기노사 및 이의 관련 바이오필름 구조는 광범위한 의학적 관계를 가지며, 많은 병인론적 질병의 기초가 된다. P.애루기노사는 다양한 감염과 관련되며, 예를 들어, 낭포성 섬유증을 갖는 환자의 폐를 만성적으로 콜론화시키는 기회감염 박테리아이다. 바이오필름으로서 성장하는 슈도모나스 애루기노사는 항생제에 매우 내성이며, 식세포에 내성이다.
본 발명자들은 바이오필름을 제거하고 제어하는데 효과적인 항-바이오필름 제제 및 항-바이오필름 제제 조합을 선별하기 위한 특정 목적을 갖는 검정법을 개발하였다. 특히, 슈도모나스 애루기노사 바이오필름에 대한 장치 및 방법을 개발하였다. 이러한 생산물은 낭포성 섬유증 폐 감염 및 기타 슈도모나스 감염을 갖는 환자에 대한 항균 약물 치료법 선택을 개선시켜야 한다.
이들 기면에 존재하는 유기체는 많은 병인성 및 비병인성 박테리아 및 진균류를 포함한다. 스타필로코커스 spp. (Staphylococcus spp.) 감염은 스테인레스 강철, 실리콘, 폴리우레탄으로 이루어진 이식된 의료 장치와 주로 관련이 있다. 이식된 의료 장치는 먼저 글리코단백질 예컨대, 피브로넥틴으로 피복되며, 이는 스타필로코커스 유기체가 기면에 접착되어, 종국에는 미생물 바이오필름을 형성하게 한다. 스타프 (Staph)는 의료 장치와 관련된 경우 항생제 치료에 반응하지 않는 것으로 널리 인식되어 있다. 고착성 박테리아에 대한 항미생물 활성의 평가는 스타프 감염에 대해 의학적 효력을 더욱 잘 예측해야 한다.
병원성 진균류 예컨대, 캔디다 (Candida) 및 애스퍼길루스 푸미가투스 (Aspergilus fumigatus)는 현재 중요한 감염물로서 인식되어 있으며, 현저한 사망율의 원인이다. 종종 이들은 이식된 장치와 관련있으며, 면역저하된 환자와 관련있다. 최근에는, 치료 실패가 바이오필름의 형성과 관련있는 것으로 인식되었다. 항진균제에 대한 내성 유전자가 기술되어 있지만, 치료 실패에 있어서 바이오필름 모드의 성장에 기초한 생리학적 내성은 동일하거나 더욱 현저할 수 있다.
바이오필름 형태의 박테리아가 부유형 박테리아 보다 항박테리아 제제에 더욱 내성이라는 것은 널리 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 바테리아의 존재 및 박테리아에 대한 항생제 효력에 대한 시험은 전형적으로 부유형 박테리아에 대한 시험과 관련된다. 연구는 부유 (자유 부유) 상태의 박테리아와 비교한 경우, 바이오필름의 항생제에 대한 내성이 100배를 초과한다는 것을 보여주었다. 이러한 내성은 개발된 뮤코폴리사카라이드 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않은 바이오필름 모드 성장의 일부로서의 많은 표현형 변화 및 미생물의 생리학적 변화로 인해 다요인적이다.
바이오필름 감염을 치료하기 위한 항생제 및 항생제 조합의 선택은 최소 억제 농도 (MIC) 검정법의 효율성이 부족한 것으로 인식되었음에도 불구하고 이러한 시험에 여전히 의존적이다. 일부는 바이오필름 억제 농도 (BIC)를 사용할 것을 제안하였으나 (Moskowitz, et al.; J.Clin. Microbiology, 42:1915-1922 (May 2004)), 이러한 증거는 BIC 및 MIC 둘 모두가 고착성 박테리아에 대한 것이 아니라 부유 박테리아에 대한 것임을 시사한다. 예를 들어, 모스코비츠 등은 이들 공정시 원심분리를 이용하였으며, 시험된(challenged) 바이오필름으로부터 유래된 대다수의 세포를 제거하지 않았으며, 따라서 부유 박테리아 단독에 대한 검정 결과이거나 단지 일부의 바이오필름 검정 결과에 해당한다. 따라서, 이러한 검정은 페그(peg)상에 남아있는 생존가능한 세포를 놓치고 있으며, 따라서 잠재적으로 부정확한 결론에 도달하게 된다. 또한, 종래 기술은 전형적으로 정적 (비-유동) 환경하에서 바이오필름을 성장시키며, 이는 때때로 결과에 영향을 끼친다.
이에 반하여, 본 발명에 따른 공정에 있어서는, 초음파 처리 또는 별도의 회수 플레이트상에서의 재성장한 바이오필름을 사용하였으며, 따라서 완전한 본래의 바이오필름이 수득될 수 있으며, 검정될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 공정은 동적이거나 유동 환경하에서 바이오필름을 성장시키고 항균제를 중화시키는 것을 포함하며, 이는 개별적으로 또는 종합적으로 검정 결과를 뒷받침한다.
따라서, CF 폐 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 및 동물에서의 바이오필름 매개된 질환에 효과적인 항-바이오필름 조성물을 포함하는, 바이오필름에 대해 효과적인 조성물을 선택하기 위한 개선된 처리 및 검정 장치 및 방법이 요구된다.
본 발명의 요약
본 발명은 바이오필름에 대해 효과적인 단독의 또는 조합된 하나 이상의 활성제를 선택하는 방법 및 장치를 개선시켰다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 바이오필름 감염의 치료에 사용될 수 있다. 바이오필름은 임의의 바이오필름 예를 들어, 박테리아, 진균류 또는 조류, 및 기생충으로부터 형성된 것; 또는 생성될 때 바이오필름내에 혼입된 미생물; 또는 혼합된 바이 오필름 예를 들어, 하나 초과의 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충 또는 조류 바이오필름을 함유하는 바이오필름일 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법은 치료 프로토콜을 개발하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료 프로토콜은 특정 환자에 맞춰질 수 있고/거나 개인적 의학 치료법 또는 방법 개발의 기초를 형성할 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법은 또한, 슈도모나스 애루기노사, 스타필로코커스 ssp., 캔디다 ssp., 및 애스퍼길루스 푸미가투스를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 미생물 치료에 효과적이다.
본 발명의 장치 및 방법은 또한, 하나 이상의 바이오필름에 의해 매개된 다양한 질환 및 질병을 치료하는데 효과적이며, 상기 질환은 낭포성 섬유증 (CF)을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 하나 이상의 박테리아, 바이러스, 진균류, 기생충, 조류 또는 이들의 복합물에 의해 매개되거나 초래된 질병 및 질환을 포함한다.
본 발명은 또한, 특정 바이오필름 또는 바이오필름들을 성장시키고, 이러한 바이오필름에 대해 효과적인 적합한 활성제 또는 활성제들을 결정하도록 맞춰지는 의학적으로 중요한 검정법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 검정법은 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC), 최소 억제 농도 (MIC) 또는 최소 살균 농도 (MBC) 또는 이의 조합을 제공한다.
본 발명은 바이오필름에 대한 효력을 갖는 하나 이상의 활성제를 함유하는 조성물을 선택하기 위한 개별적 및/또는 조합된 활성제의 패널을 제공한다. 이러한 활성제 또는 활성제 조합은 환자-특이적 감염성 유기체를 처리하는데 유용할 수 있다. 본 발명은 바이오필름 관련된 감염성 질환의 복합적 항생제 치료법을 선택하기 위한 방법 및 장치를 제공한다.
본 발명의 장치 및 방법은 또한, 개별적 환자에 대해 특이적인 약제 조성물을 결정하고 개발하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법은 널리 공개된 항생제 내성의 원인이 되는 현존하는 치료법에 대한 대안을 제공한다.
본 발명의 장치 및 방법은 또한, 특정 환자에 맞춰진 적합한 치료 프로토콜 개발 과정에서의 유전자 변화, 유전자 이동 및 항생제 내성을 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 바이오필름의 존재에 맞춰진 실험관내 검정법 즉, 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC) 측정에 기초한 검정법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 MBEC, 최소 억제 농도 (MIC), 및 최소 살균 농도 (MBC) 값의 조합을 제공한다.
본 발명의 장치 및 방법은 하기중 하나 이상에서 종래 장치에 비해 개선되었다: 본 장치 및 공정은 본래의 바이오필름을 시험하고; 본래의 바이오필름을 제거하기 위해 초음파 처리를 이용하는 것을 포함하며; 장치 및 공정은 넓은 범위의 바이오필름 예를 들어, 진균류 등에 적용되며; 항-바이오필름 제제는 살균제 등을 포함하는 더 넓은 범위의 제제에 망라하며; 장치 및 방법은 높은 처리량을 가져, 더욱 효율적이고 비용 효과적이며; 향상된 바이오필름 성장을 위한 처리 조건에 대한 이해 및 적용이 증대된 것을 포함하여, 바이오 필름 성장이 개선되었다.
세균 바이오필름은 많은 의학적, 수의학적, 농업적 및 산업적 시스템, 처리, 공정 장치 및 기면에 존재한다. 이러한 기면에 존재하는 유기체는 많은 병인성 및 비병인성 바이오필름을 포함한다.
본 발명의 방법 및 장치는 이들이 발생하는 곳마다 예를 들어, 오염이 발생하는 산업 처리장 예를 들어, 오염 제거 펄프 및 페이퍼 분쇄 장치, 기체/오일 처리 파이프 라인, 및 오염 제거 음식 처리 장치, 또는 카테터, 힙 이식물 및 캐뉼라를 포함하는 이식된 의료 장치에서 바이오필름을 분해하는데 사용될 수 있다. 본원에 개략된 원리가 또한, 바이오필름이 발생하는 모든 환경하의 모든 바이오필름에 적용된다는 것은 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명은 또한, 일체화된 장치 (device) 또는 어셈블리 (assembly), 다수의 어셈블리, 다수의 서브-어셈블리, 또는 이들의 복합물의 용도를 포함한다.
본 발명의 이러한 및 기타 양태는 하기 도면, 설명 및 청구범위에 의해 자명해질 것이다.
본 발명은 바이오필름에 대해 효과적인 단독의 또는 조합된 하나 이상의 활성제를 선택하기 위한 개선된 방법 및 장치를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 바이오필름 감염의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 장치 및 방법은 하나 이상의 바이오필름을 처리하고/거나 바이오필름에 의해 매개된 하나 이상의 질환 또는 질병을 치료하기 위한, 최적의 조성물을 포함하는 다양한 조성물을 측정하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다.
본 발명은 바이오필름을 처리하기 위한 항-바이오필름 제제의 적합한 조합물을 선택하기 위한 개선된 방법 및 장치를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법 및 장치는 진단용 민감성 테스트를 제공하며, 가장 바람직한 구체예에서, 단일 실험으로 MBEC, MBC 및 MIC 값을 제공한다. 본 발명의 구체예는 특이적 바이오필름 또는 바이오필름 그룹에 대한 활성제의 조합을 선택하기 위한 방법 및 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 장치는 바이오필름이 발생하는 곳마다 예를 들어, 오염이 발생하는 산업 처리장; 카테터, 힙 이식물 및 캐뉼라를 포함하는 이식된 의료 장치; 또는 다양한 감염 예컨대, 안과적 적용물 (감염물, 이식물, 콘택트 렌즈, 수술 조작물 등), 폐렴 및 낭포성 섬유증을 포함하는 호흡기 감염, 귀 감염, 회귀성 관절 관련 감염, 요로관 감염, 피부 및 연조직 감염, 화상 희생자에게 발생하는 감염, 질 감염, 및 위장관 감염에 있어서 바이오필름을 분해하는데 사용될 수 있다. 본원에 개략된 원리가 바이오필름이 발생하는 모든 환경하에 모든 바이오필름에 적용되는 것은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한, 바이오필름에 의해 매개되거나 초래된 질환 또는 질병을 갖는 환자 또는 피검체를 치료하는 방법 및 장치를 포함한다. 본 발명의 이러한 구체예에서, 환자 또는 피검체로부터의 생물학적 샘플은 바이오필름 형성 장치로 처리되며, 그 후, 바이오필름은 바이오필름 민감성 장치로 처리되어 바이오필름에 대한 하나 이상의 활성제를 제공한다.
본 발명의 구체예는 특정 바이오필름 또는 바이오필름들에 대한 하나 이상의 사전 선택된 항-바이오필름 제제로 사전 로딩된 하나 이상의 플레이트를 포함하는 어셈블리를 포함하며, 상기 플레이트는 바이오필름-매개된 질환 또는 질병을 치료하는데 효능있는 개별적 또는 조합된 활성제를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 방법은 또한, 하기중 하나 이상을 포함한다: 실질적으로 균일한 바이오필름 생성을 촉진시키는 조건하에 다수의 바이오필름을 성장시키고; 큰 그룹의 활성제에 대해 생물학적 샘플을 스크리닝하고; 하위 그룹의 활성제를 선택하고; 하위 그룹중 다수의 활성제를 검정 장치에 로딩시키고; 특이적 환자 또는 피검체 샘플로부터 바이오필름을 성장시키고; 하위 그룹의 활성제에 대해 특이적 환자 또는 피검체로부터의 바이오필름을 스크리닝하고; 결과를 판독하고; 특정 바이오필름에 적합한 활성제 또는 활성제 조합을 측정하고; 성장시킬 경우 미생물 (예를 들어, 슈도모나스)이 육안으로 확인가능한 혼탁을 유도하는 경우, 혼탁도 검정을 수행하고; 미생물이 육안으로 확인가능한 혼탁성을 띠도록 성장하지 않는 경우 플레이팅 검정을 수행한다.
본 발명의 구체예는 바이오필름으로 성장한 유기체에 대해 유효성을 갖는 항생제 조합을 확인하기 위해 단독의 또는 조합된 광대한 항생제 패널에 대한 종의 광범위한 임상적 분리물을 스크리닝함으로써 바이오필름으로서 특정 병원균의 분리물에 대해 효과적인 특이적 항생제 조합을 선택하는 방법을 포함한다.
본 발명의 구체예는 바이오필름 항생제 민감성을 시험하기 위해 미국 특허 6051423, 6326190, 6410256, 6596505, 6599696, 및 6599714 중 하나 이상에 기술된 바와 같은 바이오필름 검정 장치를 사용하여 바이오필름이 성장하는 환자 분리물의 바이오필름을 형성시키는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 바이오필름을 형성하는 종에 대해 특이적인 진단 플레이트에 대한 환자 특이적 분리물의 바이오필름을 시험함으로써 바이오필름 감염을 치료하기 위한 항생제(들) 선택을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 특이적 병원균에 대해 효과적인 항생제를 확인하기 위해 시험 플레이트로서 사전로딩된 항생제의 종 특이적 플레이트를 재수화시키는 것을 포함한다. 플레이트는 냉동 (재수화가 요구되지 않음), 냉동건조, 동결건조 또는 진공 건조될 수 있다.
본 발명의 구체예는 항생제 민감성 분석에 사용되도록 재수화될 수 있는 냉동되거나 냉동건조된 항생제 조합을 함유하는 웰 플레이트를 포함한다.
본 발명의 구체예는 환자의 분리된 병원균으로부터 수득된 바이오필름을 성장시키고, 민감성 분석에 바이오필름을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 항-세균 또는 항-바이오필름 제제의 선택된 조합에 대해 바이오필름을 시험하고, 가장 적합한 조합을 선택하는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예는 바이오필름을 형성할 수 있는 미생물의 진단 및 처리에 있어서 MBEC 값을 제공하고, 이러한 값을 이용하여 임의의 미생물 매개된 질환, 감염 또는 질병을 치료하거나 이들의 치료법을 개발하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로, MIC 및/또는 MBC 값을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 리드 또는 플레이트상의 접착 부위에 바이오필름을 성장시킨 후, 바이오필름 접착 부위로부터 바이오필름을 이동시키고, 추가로 바이오필름을 인큐베이팅시킨다. 바이오필름 접착 부위로부터 바이오필름을 이동시키는 것은 각 바이오필름 접착 부위로부터의 바이오필름을 미세적정 플레이트 또는 베이스(base)의 각각의 웰로 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 바이오필름은 본래의 바이오필름이 접착 부위로부터 제거되게 하는 공정을 이용하여 이동된다. 본 발명자는 원심분리를 이용하는 것은 단지 미생물의 일부만을 제거하는 것이며, 따라서 분석이 불완전하거나 부정확할 수 있음을 발견하였다.
바람직하게는, 다수의 바이오필름 접착 부위가 다수의 횡렬에서 다수의 부위를 갖도록 형성되며; 용기는 다수의 채널을 포함하며, 한 채널은 다수의 바이오필름 접착 부위의 각 횡렬에 대한 것이다. 이렇게 구성된 장치 또는 어셈블리는 많은 처리량으로 바이오필름 분석을 가능하게 한다.
종합적으로, 본 발명은 바이오필름 성장 어셈블리 (1), 바이오필름 시험 어셈블리 (2), 린싱 어셈블리 (3) 및 바이오필름 이동 및 재성장 어셈블리 (4)를 포함한다. 일제히 사용되는 경우, 어셈블리는 단일 실험으로 MIC, MBC 및 MBEC 값을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바이오필름 성장 어셈블리 (1)는 리드 (10)를 수용하도록 형상화된 베이스 또는 플레이트 (20)를 포함할 수 있다. 리드 (10)는 베이스 (20)에 의해 규정된 공간으로 연장된 하나 이상의 돌출부 (12)를 포함하도록 형상화될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 바이오필름 성장 어셈블리 (1)는 진동되거나, 이동되거나 하여, 어셈블리중의 성장 유체가 돌출부 (12)를 가로질러 흐르거나 이동한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 베이스 (20)는 인큐베이션 베이스이며, 미생물의 공급원 및 이의 영양물/성장 브로쓰에 실질적으로 동일하게 노출되는 각각의 돌출부를 갖도록 형상화된다. 본 명세서에 다르게 언급되어 있지 않는 한, 전형적인 베이스는 하나 이상의 채널 (26)을 포함한다. 예시적 형상은 도 3에 도시되어 있다.
본 발명에 있어서, 바이오필름 시험 어셈블리 (2)는 바이오필름에 의해 전형적으로 덮여지는 돌출부 (61)를 갖는 리드 (60)를 수용하도록 형상화된 베이스 또는 플레이트 (21)를 포함한다. 돌출부 (61)는 플레이트 (21)에 형상화된 하나 이상의 웰로 확장된다. 전형적인 제 2 베이스 (21)는 표준 96 웰 미세적정 플레이트이나, 당업자는 기타 형태도 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 제 2 베이스 (21)는 웰중에 하나 이상의 항-바이오필름 제제를 포함한다. 본 발명에 있어서, 제 2 플레이트 (21)는 제거될 수 있으며, 비-바이오필름 (예를 들어, 부유성) 미생물의 MIC 값을 측정하는데 사용될 수 있다 (도 8 참조).
본 발명에 있어서, 바이오필름 린싱 어셈블리 (3)는 바이오필름에 의해 전형적으로 덮여진 돌출부 (61)를 갖는 리드 (60)를 수용하도록 형상화된 제 3 베이스 또는 플레이트 (40)를 포함한다. 돌출부 (61)는 플레이트 (40)에 형상화된 하나 이상의 웰로 연장된다. 전형적인 제 3 플레이트 (40)는 표준 96 웰 미세적정 플레이트이나, 당업자는 기타 형태도 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 제 3 플레이트 (40)는 웰 중에 하나 이상의 린싱 및/또는 중화 제제를 포함한다.
린싱 후, 리드 (60)가 회수 플레이트로서 언급된 제 4 베이스 (50)와 결합될 수 있다. 리드 (60) 및 제 4 베이스 (50)는 바이오필름 분해 어셈블리 (4)를 형성한다. 회수 플레이트는 회수 배지를 함유하며, 본 발명에 있어서, 어셈블리 (4)는 초음파 처리될 수 있으며, 바이오필름 재-성장 처리될 수 있다 (바이오필름이 제거되었음을 확인시켜줌). 본 발명의 바람직한 구체예에서, 회수 배지는 하나 이상의 중화제를 포함한다. 실시예에 기재된 바와 같이, 회수 배지에 노출시킨 후, 리드 (60)상의 돌출부를 분석함으로써, 미생물의 MBEC 값을 제공하고, 회수 플레이트로부터 플레이팅하여 MBC 값을 제공한다.
본 발명의 예시적 구체예는 하기에 기술되어 있다. 가장 특히 도 1, 2 및 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 예시적 바이오필름 성장 어셈블리는 돌출부 (12)를 포함하는 리드 (10) 및 리드 (10)와 돌출부 (12)를 수용하기에 적합하며, 하나 이상의 채널 (24) 또는 웰을 포함하는 베이스 (20)를 포함한다. 도면에 예시된 바와 같이, 장치는 돌출부 (12)가 리드 (10)로부터 하향으로 연장되며, 조직 등급의 플라스틱 또는 기타 적합한 물질 (예를 들어, 스테인레스 강철, 티탄)으로 이루어진 바이오필름 리드 (10)를 포함한다. 돌출부 (12)는 바이오필름이 접착될 수 있는 바이오필름 접착 부위일 수 있으며, 채널 또는 웰-함유 바닥 예컨대, 베이스 (20)와 결합되어 사용하기에 적합한 임의의 패턴 또는 형태로 형상화될 수 있다. 돌출부 (12)의 패턴은 바람직하게는, 검정 과정에 일반적으로 사용되는 통상적인 플레이트 예를 들어, 96 미세적정 또는 웰 플레이트에서 채널 및/또는 웰의 패턴을 반영한다. 본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 돌출부 (12)는 바람직하게는, 12개 이상의 각 돌출부의 8개 이상의 횡렬 (14)로 형성된다. 기타 수의 횡렬 또는 횡렬에서 기타 수의 돌출부가 사용될 수 있으나, 96 웰 플레이트가 생의학 장치에서 일반적으로 사용되기 때문이 상기가 편리한 수에 해당한다. 도시된 바와 같이 추가의 또는 일부의 돌출부가 인큐베이션 후 초기 바이오필름 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 도시된 예시적인 돌출부 (12)는 약 1.5cm 길이 및 2mm 폭을 가지나, 임의의 크기 및/또는 형상을 띨 수 있다.
바이오필름 성장 어셈블리 (1)는 또한, 돌출부 (12)를 갖는 리드 (10)를 수용하도록 형상화되고 적합하게 된 인큐베이션 베이스 (20)를 포함한다. 리드 (10)는 채널 (24)내에 바이오필름 접착 부위를 지지하기 위한 돌출부 (12)에 대한 지지체를 형성한다. 리드 (10)는 용기 (20)의 주위 벽 (28)에 걸쳐 단단하게 맞춰지는 주위 리드 (16)를 가져, 인큐베이션 동안 용기내부의 오염을 방지해준다.
베이스 (20)는 바이오필름 발생을 위한 2개의 중요한 기능을 수행한다. 첫 째는 돌출부 (12)상에 바이오필름을 형성할 박테리아 군집을 함유하는 액제 성장 배지에 대한 수용기이다. 두 번째 기능은 돌출부를 가로질러 전단력을 생성시기키에 적합한 형상을 갖는다는 점이다. 특정 작용 이론에 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 돌출부를 가로질러 통과하는 유체에 의해 형성된 전단력이 최적의 바이오필름 생성 및 돌출부상의 형성을 촉진하는 것으로 여긴다.
돌출부 (12)상의 전단력은 경사 테이블 (30)상에 리드 (10)를 갖는 용기 (20)를 진동시킴으로써 유도될 수 있다. 본 발명자들은 약 7° 내지 약 11°의 경사를 갖는 진동 테이블을 사용하는 것이 대부분의 적용에 적합하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 진동 테이블은 약 9°로 설정되어야 한다. 본 발명은 실제의 경사도 사용에 의해 제한되지 않아야 하며, 본 발명에 따른 바이오필름 성장에 적합한 임의의 특정한 기기에 대해 임의의 경사가 이용될 수 있다.
돌출부 (12)는 채널 (24)에 띄워져 있어 돌출부 (12) 의 팁이 채널 (14)중에 흐르는 액체 성장 배지중에 함침될 수 있다. 릿지 (ridge) (26)는 채널 (14)을 지나 돌출부 (12)를 가로질러 액체 성장 배지를 유도하여, 돌출부를 가로질러 전단력을 발생시킨다. 용기 (10) 진동은 돌출부 (10)를 가로질러 흐름 방향의 반복적 변화, 이 경우, 액체 성장 배지의 흐름의 반복된 역전을 초래하여, 리드 (10)의 각각의 돌출부 (12) 상의 동일한 비의 바이오필름을 확보하는 것을 돕는다. 액체가 채널을 따라 후방 및 전방으로 흐르도록 용기를 진동시키는 것은 우수한 바이오필름 성장 환경을 제공할 뿐만 아니라, 자연 발생 상태를 모방한다.
각각의 돌출부 (12) 및 각각의 채널 (24)은 바람직하게는, 바이오필름 형성동안 돌출부에 걸쳐 균일한 전단 흐름을 보장하는 실질적으로 동일한 형태 (조작 공차내)를 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 채널 (24)은 모두 베이신 (basin) (22)을 충전하는 동일한 액체 영양물 및 박테리아 혼합물을 공유하도록 형상화되거나 연결되어야 한다. 본 발명자들은, 동일한 미생물 공급원에 대한 실질적으로 균일한 채널 형상 및 접근은 항-바이오필름 제제를 시험하는데 요구되는 정도와 적어도 동일하도록 각 돌출부상에 동일한 바이오필름 생성을 조장함을 발견하였다. 이와 같이 생성된 바이오필름은 균일한 것으로 간주된다. 결과는 플레이트상의 무작위 돌출부에 대해 P<0.05 내로 수득되었다.
바이오필름의 민감도는 바이오필름 접착 부위를 하나 이상의 항-바이오필름 제제로 처리함으로써, 즉 바이오필름을 시험한 후, 바이오필름을 분석함으로써 측정될 수 있다. 이는 리드 (60) (돌출부상에 형성된 바이오필름을 갖는)를 리드 (10)와 돌출부(12)를 수용하기에 적합한 제 2 베이스 (21)에 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 리드 (60)는 어셈블리의 오염을 방지하게에 충분한 방식으로 제 2 베이스 (21)에 맞물려진다. 본원에 사용된 바와 같이, 오염을 방지하는데 충분한 방식은 밀봉된 어셈블리의 내용물이 외부 오염물로부터 자유롭게 하는 결합 구조물의 형상 및 어셈블리에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 당업자는 바이오필름 그룹을 시험하기 위한 임의의 설비 또는 계획을 이용할 수 있다. 예를 들어, 시험 플레이트의 모든 웰은 동일한 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있거나; 다수의 웰은 상이한 용량의 동일항 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있거나; 단일 횡렬의 다수의 웰은 동일하거나 상이한 용량의 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있거나; 다수의 횡렬은 동일하거나 상이한 용량의 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있거나; 다수의 웰 또는 다수의 횡렬은 하나 초과의 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있거나, 다수의 웰 또는 다수의 횡렬은 웰, 횡렬 및/또는 항-바이오필름 제제에 따라 용량을 변화시킴으로써 하나 이상의 항-바이오필름 제제를 포함할 수 있다. 웹의 형상 및 배열, 항-바이오필름 제제의 유형 및 수, 및 각 웰의 용량은 특정 목적을 달성하기 위해 당업자에게 요망되는 한 변화되어야 하며, 예를 들어, 하나 이상의 항-바이오필름 제제로 하나 이상의 바이오필름을 테스트하는 것은 의도한 목적에 합당하는 한 많은 변수를 이용한다.
예를 들어, 용기 (20)의 동일한 채널 (24)내에 인큐베이션된 돌출부 (12)는 상이한 항-박테리아 제제로 처리될 수 있다. 이러한 방식으로, 임의의 한 채널에서의 성장 조건이 전체 채널에 따라 매우 유사하며, 따라서 이러한 채널에 띄여져 있는 각 돌출부 (12)에 있어서 매우 유사하기 때문에 일관된 결과가 수득될 수 있다. 이는 상이한 항-박테리아 제제로 상이한 돌출부 (12)의 처리에 대한 신뢰성을 향상시킨다. 실시예는 본 발명의 어셈블리로 사용하기에 적합한 상이한 배치를 나타낸다.
수개의 상이한 통상적인 방법이 박테리아를 계수하는데 사용될 수 있다. 초음파 처리된 박테리아를 인큐베이션하고, 연속 희석시키고, 육안으로 콜로니 형성 유닛을 계수함으로써 수행될 수 있거나, 자동화된 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 광학 밀도를 측정하기 위해 광학 판독기를 사용할 수 있다. 그러나, 혼탁 광학 판독기는 실제 적용하기에 너무 부정확하며, 바이탈 염료 기법 (vital dye technology)을 적용하여, 바이오필름을 바이탈 염료로 처리하고, 염색된 바이오필름에 의해 제공된 광 밀도를 측정함으로써 생존도를 자동으로 측정하는 것이 바람직하다. 바이탈 염료 기법을 이용하는 경우, 바이오필름을 추가로 인큐베이션될 필요가 없다. 당업자는 세포 집단에 대한 기타 염료가 사용될 수 있음을 인지할 수 있을 것이며; 이러한 염료는 후에 추출되고, OD로 판독될 수 있다 (남아있는 세포 바이오매스 측정). 추가의 구체예에서, 세포가 용해되고 ATP를 방출할 때까지 세포를 초음파 처리하고, 루시퍼라아제를 첨가하여 기계적으로 판독가능한 광을 방출시킴으로써 검정이 수행될 수 있다. 추가의 구체예에서, 자동화가 어려운 것으로 간주되지만, 공초점 현미경을 사용하여 돌출부상의 바이오필름에 대해 직접적으로 검정을 수행할 수 있다. 하기 실시예에서, 결과는 연속 희석 후 수동 계수에 의해 수득된 것이다.
박테리아 생존이 0이 되게 하는 항-박테리아 제제의 농도 (MBEC)는 검정법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 마찬가지로, MIC 또한 검정법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명자들은 일부 예에서, 바이오필름중에 숙주 성분을 포함하지 않고서는 바이오필름이 형성되지 않을 것임을 발견하였다. 따라서, 숙주 성분은 박테리아의 인큐베이션 동안 용기중의 성장 배지에 첨가되어 바이오필름을 형성시킬 수 있다. 첨가될 수 있는 숙주 성분은 숙주 유기체로부터의 혈청 단백질 및 세포를 포함한다. 상이한 숙주 세포 및 성분의 효과를 시험하는데 있어서, 채널 (24)의 말단부 (25)는 벽에 의해 밀봉되어 성장 배지가 한 채널에서 또 다른 채널로 흐르는 것을 방지하여, 각 채널에서의 박테리아 성장이 기타 채널들로부터 격리될 수 있다. 이와 같이 기술된 장치는 또한, 바이오필름 성장을 억제하는데 사용된 코팅을 시험하고, 바이오필름 형성을 향상시킬 수 있는 코팅을 시험하는데 사용될 수 있다. 초기 단계에서, 돌출부 (12)는 시험할 코팅으로 코팅된 후, 돌출부상에서 바이오필름이 성장될 수 있다. 그 후, 바이오필름이 검정되거나, 항-박테리아 제제로 치료된 후 검정될 수 있다. 검정법은 원래의 위치에서 또는 바이오필름을 이동시킨 후 수행될 수 있다. 상이한 코팅이 페그의 상이한 횡렬에서 시험될 수 있다. 증가된 바이오필름 형성은 생발효를 위한 생존가능한 큰 바이오필름을 생성시키는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 어셈블리는 일제히 작업할 수 있도록 설계되거나 형상화된 요소 또는 성분의 일체화된 콜렉션을 나타내다. 본 발명의 전형적인 어셈블리는 리드와 이의 상응하는 베이스를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 한 어셈블리의 요소는 별도의 어셈블리와 함께 작용하거나 작동할 수 있다. 예를 들어, 어셈블리 (1)의 리드는 어셈블리 (2) 즉, 상이한 베이스를 갖는 어셈블리 (2)에 리드로서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 리드는 착탈가능한 밀봉 방식으로 베이스에 맞물려질 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 리드는 밀폐된 밀봉 방식으로 베이스에 맞물려질 수 있다; 이러한 구체예에서, 어셈블리의 또 다른 요소가 착탈가능하도록 하는 것이 바람직할 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 착탈가능한 돌출부).
본원에 사용된 바와 같이, 시험 플레이트는 하나 또는 다수의 웰 등의 형상을 갖는 임의의 베이스를 나타내며, 상기 플레이트는 하나 이상의 바이오필름을 하나 이상의 항-바이오필름 제제에 노출시키는데 사용된다. 전형적인 시험은 하나 이상의 항-바이오필름 제제를 포함하는 환경에서 바이오필름 성장을 측정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 공정의 후속 단계에서, 시험 플레이트는 부유 미생물의 MIC 값을 측정하는데 사용될 수 있다. 예시적 시험 플레이트는 도 6 및 8에 도시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 회수 플레이트는 하나 또는 다수의 웰 등의 형상을 갖는 베이스를 나타내며, 상기 플레이트는 항-바이오필름 제제에 노출된 후 바이오필름을 린싱하거나, 항-바이오필름 제제를 중화시키거나, 어셈블리를 초음과 처리한 후 임의의 분해된 바이오필름을 수집하거나, 또는 이의 복합된 과정을 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 공정의 후속 단계에서, 회수 플레이트는 본 공정에 형성된 임의의 바이오필름의 MBEC 값을 측정하는데 사용될 수 있다. 예시적 회수 플레이트는 도 7 및 8에 도시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 중화제는 항-바이오필름 제제에 의해 초래되는 임의의 독성을 저하시키거나 중화시키는데 적합한 임의의 조성물을 나타낸다. 중화체는 사용되는 항-바이오필름 제제(들) 또는 특정 바이오필름에 대해 효과적인 경우 적합하다. 중화제의 선택은 당해분야에 속한다. 수개의 중화제 및 조성물이 실시예에 제시되어 있다. 도 7에 도시되고, 실시예에 기술된 바와 같이, 회수 배지는 하나 이상의 중화제를 포함하는 조성물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성제 또는 항-바이오필름 제제는 바이오필름 또는 바이오필름 유사 구조를 축소시키거나, 분해하거나 제거하는데 효과적인 하나 이상의 제제를 나타낸다. 본 발명은 이미 널리 공지된 활성제 예를 들어, 항생제, 항균제 및 살균제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 활성제는 독립적으로 작용할 수 있으며; 하나 이상의 활성제는 조합되어 또는 상승효과적으로 작용할 수 있으며; 하나 이상의 활성제가 연속적으로 또는 일렬로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성제의 패널 또는 라이브러리는 소정의 방법에 따라 그룹화된 다수의 활성제 콜렉션을 나타낸다. 예를 들어, 제 1 라이브러리는 특정 바이오필름에 대해 효과적인 것으로 어느 정도의 잠재성을 나타내는 하나 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 제 2 라이브러리는 제 1 라이브러리의 하위 세트로 시작될 수 있으며, 이는 유효한 활성제 선택의 폭을 좁히거나, 활성제의 특정 하위 세트에 대한 더 많은 정보를 제공하도록 설계된다. 패널 또는 라이브러리는 또한, 소정의 방법에 따라 그룹화된 독점적 또는 비독점적 활성제 그룹을 예를 들어, 변화가능한 용량으로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성제를 함유하는 조성물은 하나 이상의 활성제를 포함하며, 추가로 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있으며, 이는 박테리오신 또는 기타 항-박테리아 펩티드 또는 폴리펩티드, 하나 이상의 살균제 등, 하나 이상의 계면활성제 등, 하나 이상의 담체, 생리학적 염수 등, 하나 이상의 희석제 등, 및 하나 이상의 방부제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 샘플은 환자, 동물 또는 환경으로부터 취해진 생물학적 또는 유체 샘플을 나타내며; 샘플은 특별히, 미생물의 임의의 공급원 또는 잠재적 공급원을 포함한다. 환자 분리물은 표준 실험 방법에 의해 유래되며, 표준 실험 실시법 (standard laboratory practice: CLSI)에 의해 검정하기 위해 제조된다. 시험 플레이트에 대한 접종물은 현존하는 기법을 이용한 표준 밀도로 형성된 바이오필름을 포함한다 (미국 특허 6051423, 6326190, 6410256, 6596505, 6599696 및 6599714).
본원에 사용된 바와 같이, 바이오필름 시험은 페그 MBEC 장치상에서 성장한 바이오필름 배양물을 사전 패키징된 시험 트레이의 웰로 이동시켜 환자의 분리물이 표적 유기체에 대한 이들의 상승효과를 위해 선택된 분광 농도 범위의 항생제에 노출시키는 것을 포함한다. 이용된 인큐베이션 시간 및 조건 및 배지는 분리물에 따라 변화될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 효력은 바이오필름의 활성을 갖는 조합된 항생제의 능력에 기초하며, MIC (최소 억제 농도), MBC (최소 살균 농도) 및 최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC)에 기초하여 규정된다. 박테리아의 항생제 민감성을 시험하기 위한 표준 검정은 최소 억제 농도 (MIC)이며, 이는 부유 상태의 박테리아의 민감성을 시험한다. MIC는 바이오필름 상태에서의 박테리아의 진정한 항생제 민감도를 측정하는데 있어서 제한된 값이다. 다른 한편으로, MBEC 검정은 바이오필름 상태의 박테리아를 직접적으로 측정가능하게 하며, 바이오필름 성장 장치 또는 플레이트에서 바이오필름을 형성시키고, 바이오필름을 하나 이상의 시험 항생제 또는 활성제에 규정된 기간 동안 노출시키고, 바이오필름을 새로운 박테리아 배지를 갖는 제 2 플레이트로 이동시키고, 바이오필름을 밤새 인큐베이션시키는 것을 포함한다. MBEC 값은 처리된 바이오필름으로부터 박테리아의 재성장을 억제하는 가장 낮은 활성제 희석값이다. 본원에 사용된 바와 같이, 처리 프로토콜은 활성제의 용량, 활성제의 조성 및 얼마나 자주 투여하는 지에 관한 것이다. 본 발명의 장치 및 방법으로, 처리 프로토콜은 특정 인간 또는 동물, 특정 바이오필름 또는 바이오필름들, 및/또는 특정 질환 또는 질병에 맞추어질 수 있다. 일부 질환 및 질병 예를 들어, CF에 있어서, 처리 과정을 최적화시키기 위해 상이한 시간에 별도의 검정을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CF 환자의 질병은 환자 및 감염이 변화되기 때문에 시간에 걸쳐 변화되는 것으로 여겨지며; 이러한 변화를 모니터링하고, 필요에 따라 많은 임의의 처리를 변경시킴으로써 이로운 결과를 유도할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 이로운 결과는 미생물 또는 바이오필름에 대한 임의의 정도의 효력을 의미한다. 이로운 결과의 예는 바이오필름 또는 바이오필름을 형성하는 미생물의 축소, 제거, 박멸 또는 감소; 및 바이오필름에 의해 숨겨지거나 보호된 미생물의 처리 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 환자가 처리되는 방식에서 개선된 예로는 특정 환자의 치료 능력 또는 역량, 특정 시간에 특정 환자에 대해 치료 프로토콜을 맞추는 능력; 및 특정 활성제 또는 활성제들을 선택가능하게 하는 증가된 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 민감성 시험 또는 유사한 표현은 활성제가 바이오필름중의 미생물의 성장 또는 상태에 영향을 끼치는지 그리고, 얼마나 많은 영향을 끼치는 지를 측정하는 것이다. 본 발명의 장치 및 방법에서, 민감도 측정은 높은 처리량의 장치를 사용함으로써, 비정적 환경에서 바이오필름을 형성시킴으로써, 유동 시스템을 통해 바이오필름을 생성시킴으로써 종래 기술과 구별된다.
본원에 사용된 바와 같은 높은 처리량은 많은 바이오필름 및/또는 많은 항-바이오필름 제제를 한번에 또는 동일한 공정으로 성장시키고/거나 검정하는 능력을 나타낸다. 전형적으로, 높은 처리량은 성장하거나 시험하는 물질의 속도 또는 양을 증가시키기 위해 하나 이상의 어셈블리의 구조적 요소 예를 들어, 96 웰 검정 플레이트, 96 웰 플레이트와 맞물리도록 개조되고 형상화된 탑, 웰에 상응하는 페그를 갖는 탑, 및 채널을 갖는 바이오필름 성장 플레이트로 이동되어, 많은 수의 개별적 바이오필름을 한번에 처리할 수 있다.
도 1은 용기 리드상의 다수의 바이오필름 접착 부위의 하면이다.
도 2는 도 1의 다수의 바이오필름 접착 부위의 수용하는 용기의 상면이다.
도 3은 도 1 및 2의 리드 및 용기의 부분적으로 생략된 측면도이다.
도 4는 본 발명의 예시적 구체예인 처리 단계의 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 바이오필름 성장 및 형성 공정의 예를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 바이오필름 민감성 검정법의 예이다.
도 7은 본 발명에 따른 본래의 바이오필름을 회수하기 위한 공정의 예이다.
도 8은 본 발명에 따라 MBEC 및 MIC 측정치를 확립하기 위한 공정의 예이다.
도 9는 실시예 6에 기술된 실험의 결과 차트이다.
도 10은 실시예 7에 사용된 시험 플레이트(challegne plate)의 구성을 나타낸다.
도 11은 실시예 10에 사용된 시험 플레이트의 구성을 나타낸다.
도 12는 측정된 바이오필름의 MIC, MFC 및 MBEC 값의 챠트이다.
실 시 예
하기는 실시예 1-4에 사용되었다:
항생제 및 기타 항균제 스톡 용액이 시험 플레이트에 사용되는 가장 높은 농도 x 5로 미리 제조되어야 한다. 예를 들어, 탈이온수 또는 적합한 용매를 사용하여 5120㎍ ml-1 활성제의 항생제 스톡 용액을 준비하였다. 사용된 용매 및 희석물에 대한 상세한 내용은 컨설트 크리니컬 라보라토리 스탠다드 인스티튜트 (Consult Clinical Laboratory Standards Institute: CLSI) 다큐먼트 M100-S8를 참조하였다. 대부분의 항생제의 스톡 용액은 -70℃에서 최소 6개월 동안 안정적이다.
연구에 있어서, 최소 박테리아 및 진균류 농도 측정을 위해 중화제를 사용하는 것이 적합하다. 이들 제제는 시험물로부터의 생물학적 활성 화합물의 나머지의 독성을 저하시켜 배지를 회복시킨다. 예로서, 페니실린을 중화시키는데 β-락타마아제를 사용하거나, Hg2 + 및 기타 중금속 양이온을 중화시키는데 L-시스테인을 사용하는 것이 가능하다. 하기 실험은 생성물 개발의 조절 측면에 있어서 요구되는 살균제 민감도 검정시 보편적인 중화제를 사용한다. 본 실시예는 하기에 나타내었다:
1.0g L-히스티딘
1.0g L-시스테인
2.0g 환원된 글루타티온
이중의 증류수중에 20ml를 제조하였다. 0.20㎛ 필터를 갖는 주사기를 통과시켜 멸균시켰다. 이 용액은 -20℃에서 저장될 수 있다. 적합한 성장 배지 (양이온 조절된 MHB) 1리터를 제조하였다. 이러한 배지에 리터당 20.0g의 사포닌 및 리터당 10.0g의 트윈-80을 보충하였다. 묽은 NaOH에 의해 정당한 pH로 조절하였다 (20℃에서 7.0 ±0.2). 500㎕의 보편적 중화제를 회수 플레이트에 사용된 각 20ml의 계면활성제가 보충된 성장 배지에 첨가하엿다.
본 실험 프로토콜의 개관은 도 4에 제공되어 있다. 본 프로토콜을 완료하는데 소요되는 날짜는 시험하는 미생물의 성장 속도에 의해 좌우된다. 프로토콜은 6개의 일련의 단계로 나누어지며, 이들 각각은 하기 섹션에서 자세히 설명되었다.
본 프로토콜은 눈크 브랜드 (Nunc Brand) 평바닥 96-웰 미세적정 플레이트에 사용하기 위해 개발되었다. 이러한 마이크로플레이트는 웰 당 최대 300㎕의 용적을 갖는다. 상이한 브랜드의 미세적정 플레이트를 위해 기재된 배지 및 완충제 용적이 조절될 수 있다.
실시예 1. 단계 1 - 목적하는 미생물의 계대배양물 성장
1. 극저온 스톡 (-70℃)을 사용하는 경우, 적합한 아가 플레이트상에 목적하는 박테리아 또는 진균의 제 1 계대 배양물을 스트리킹하였다. 적합한 기간 동안 미생물의 최적의 성장 온도에서 인큐베이션하였다. 대부분의 박테리아 균주에 있어서, 제 1 계대 배양물을 파라필름 (ParafilmTM)으로 랩핑시키고, 14일 이하 동안 4℃에서 저장하였다.
2. 제 1 계대 배양물의 순도를 체크하였다 (즉, 단지 단일 콜로니 형태만이 플레이트상에 존재해야 한다).
3. 제 1 계대 배양물 또는 임상 분리물로부터의 제 2 계대 배양물을 적합한 아가 플레이트상에 스트리킹하였다. 적합한 기간 동안 최적의 미생물 성장 온도에서 인큐베이션하였다. 제 2 계대 배양물은 처음으로 배양물로부터 제거된 시간으로부터 24h 이내에 사용되어야 한다.
4. 제 2 계대 배양물의 순도를 확인하였다.
선택적 제제를 함유하는 배지상에서 계대배양물을 성장시키는 것은 권고되지 않는다. 항생제 및 기타 항균제는 박테리아에서의 적합한 스트레스 반응을 촉발시킬 수 있고/거나 변이 집단의 축적을 증가시킬 수 있다. 이는 정도를 벗어난 민감도 측정치를 초래할 수 있다.
단계 2 - 어셈블리 접종
어셈블리 접종의 본 단계는 도 5에 설명되어 있다. 요약하면, 새로운 제 2 계대배양물을 사용하여 1.0 맥파랜드 기준 (McFarland Standard)에 부합한 접종물을 생성시켰다. 이 용액을 성장 배지로 30대 1로 희석시켰다. 22ml의 30대 1 희석물을 본 발명의 어셈블리의 베이스의 트로프(trough)에 첨가하였다. 장치를 진동 테이블에 위치시켜 폴리스티렌 페그상에 바이오필름이 형성되는 것을 보조하였다.
하기 단계는 생물학적으로 안정적인 캐비넷 (이용가능하다면)에서 수행할 것이 권고된다. 그러나, 밴치 탑에서의 무균 기법을 사용하는 것도 가능하다.
1. 멸균 96-웰 미세적정 플레이트를 개봉한다. 각각의 고처리량 검정을 위해, '횡렬' A에서 F까지 미세적정 플레이트의 4개 '칼럼'을 180㎕의 생리 염수 용액으로 충전시켰다.
2. 목적하는 브로쓰 성장 배지 1.5ml (및 동시에 접종되는 각각의 추가적인 장치에 있어서, 1.0ml)를 멸균 유리 시험 튜브에 넣었다.
3. 멸균 면봉을 사용하여, 제 2 아가 계대배양물의 표면상의 박테리아 콜로니를 수집하였다. 면봉 끝을 얇은 박테리아 층으로 덮었다.
4. 면봉을 브로쓰에 담궈 박테리아를 현탁시켰다. 목적은 1.0 맥파랜드 기준에 부합하는 (즉, 3.0 x 108 cfu ml-1) 현탁물을 제조하는 것이다. 용액중에 박테리아 덩어리가 생기지 않게 조심해야 한다.
5. 단계 2의 3번 및 4번을 최적의 기준에 부합되는데 필요한 만큼 많이 반복하였다.
6. 29ml의 적합한 브로쓰 성장 배지 (예를 들어, TSB)를 50ml의 멸균 폴리프로필렌 또는 유리 튜브에 넣었다. 여기에, 1.0ml의 1.0 맥파랜드 기준 박테리아 현탁물을 첨가하였다. 1.0 맥파랜드 기준의 30배 희석물 (즉, 1.0 x 107 cfu ml-1)이 장치에 대한 접종물로서 작용한다.
7. 장치의 멸균 패키지를 개봉하였다. 접종물을 제제 수용기에 부었다. 멸균 피펫을 사용하여, 22ml의 접종물을 장치와 패키징된 트로프에 첨가하였다. 페그 리드를 트로프 위에 위치시켰다.
본 단계에서 사용된 접종물의 부피는, 바이오필름이 단계 3 (하기)에 설정된 시험 플레이트에 사용된 부피의 항균제에 의해 전체적으로 함침되는 표면 영역을 덮게 하도록 결정되었다. 더 큰 부피의 접종물을 사용하면 페그상에서 높게 바이오필름을 형성시켜 시험 단계에서 노출이 물리적으로 이루어지지 않을 수 있다.
8. 적합한 온도에서 습윤화된 인큐베이터내의 진동 테이블상에 장치를 위치시켰다. 테이블은 분당 3 내지 5회 진동으로 세팅되어야 한다. 진동 테이블이 9° 내지 16° 경사로 셋팅되어야 하는 것이 중요하다. 이러한 움직임은 대칭적이다.
9. 접종물 (3 또는 4회 복제) 샘플을 연속 희석시켰다 (10배). 이는 접종물중의 출발 세포 수를 확인하는데 사용된 대조군이다.
10. 10-6 내지 10-1의 접종물의 연속 10배 희석물을 적합하게 라벨링된 일련의 아가 플레이트상에 스팟 플레이팅시켰다. 스팟 플레이트를 적합한 기간 동안 인큐베이션하고 성장을 기록하였다.
실시예 2. 단계 3 - 항균제 시험 플레이트 설정
하기 섹션은 시험 플레이트에 단일 항균제의 일련의 2배 희석 구배를 설정하는 방법을 기술한다. 이는 단지 예일 뿐이다. 항균 시험 플레이트는 임의의 항균제 조합으로 임의의 목적하는 방식으로 설정될 수 있다. 시험 플레이트의 각 웰의 최종 부피가 200㎕가 되게하는 것이 중요하다. 이는 항균제중의 바이오필름의 완전한 함침을 보장한다.
1. 신품의 멸균 96-웰 미세적정 플레이트를 입수하고, 무균 작업대에서 개봉하였다.
2. 적합한 성장 배지중의 목적하는 항균제의 처리 용액을 설정하였다. 항균제를 20% 초과 (즉, 4부의 성장 배지당 1부 이하의 스톡 항균제 용액)로 희석하지 않아야 한다. 항균 처리 용액은 시험 플레이트에서 시험할 가장 높은 농도에 해당하는 농도로 제조되어야 한다.
3. 200㎕의 성장 배지를 시험 플레이트의 '칼럼' 1 및 '칼럼' 12에 첨가하였다. 이는 각각 멸균 및 성장 대조군으로서 작용할 것이다.
4. 100㎕의 성장 배지를 미세적정 플레이트의 '칼럼' 3 내지 11에 첨가하였다.
5. 200㎕의 처리 용액을 미세적정 플레이트의 '칼럼' 2에 첨가하였다.
6. 100㎕의 처리 용액을 미세적정 플레이트의 '칼럼' 3 및 '칼럼' 4에 첨가하였다.
7. 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여, 상하로 피펫팅하여 '칼럼' 4의 내용물을 혼합하였다. 혼합 후, '칼럼' 4의 웰로부터 100㎕을 '칼럼' 5의 상응하는 웰로 이동시켰다.
8. 이를 혼합하고, '칼럼' 5로부터 100㎕를 '칼럼' 6으로 이동시켰다. 이러한 혼합 및 이동 과정을 미세적정 플레이트 길이에 따라 '칼럼' 11에 도달할 때 까지 반복하였다.
9. 칼럼 11의 내용물을 위 아래로 혼합하였다. '칼럼' 11에서 각 웰로부터 100㎕를 추출하여 버렸다.
*10. '칼럼' 4 내지 11의 웰에 100㎕의 성장 배지를 첨가하였다.
11. 시험 플레이트상에 리드를 재위치시켰다. 플레이트를 부드럽게 두드려서 살균제/항생제와 배지의 혼합을 촉진시켰다.
단계 4 - 바이오필름 노출
바이오필름을 하나 이상의 항균제에 노출시키는 본 단계는 도 6에 설명되어 있다. 요약하면, 상기 제조된 어셈블리를 지로로터리 쉐이커 (gyrorotary)로부터 제거하고, 바이오필름을 생리 염수 용액으로 린싱하엿다. 그 후, 린싱한 바이오필름을 시험 플레이트의 항균제중에 함침시키고, 요망되는 노출 시간 동안 인큐베이션시켰다.
1. 매 웰마다 200㎕의 생리 염수 용액을 갖는 멸균 미세적정 플레이트를 설정하였다. 이 플레이트는 페그를 린싱하여 바이오필름으로부터 느슨하게 접착된 부유 세포를 제거하는데 사용될 것이다 (이는 '린스 플레이트'로 불림).
2. 이 단계는 부유 배양물의 4개 웰로부터 4개의 샘플 페그상에서의 바이오필름 성장을 측정하기 위해 사용될 것이다. 접종된 각 장치에 있어서 횡렬 A의 4개 '칼럼'에서 생리 염수 용액 200㎕를 갖는 멸균 미세적정 플레이트를 설정하였다 (즉, 1 미세적정 플레이트가 매 3개의 장치에 요구된다). 180㎕의 생리 염수 용액으로 횡렬 B 내지 F를 충전시켰다. 제 2 미세적정 플레이트에서, 각 접종된 장치에 있어서 180㎕의 생리 염수 용액을 횡렬 A로부터 H까지 4개 '칼럼'에 충전시켰다. 제 1 미세적정 플레이트를 사용하여 바이오필름 배양물을 연속 희석시키고, 제 2 미세적정 플레이트를 사용하여 접종물을 함유하는 미세적정 플레이트의 웰에서 부유 세포의 성장을 체크하였다.
3. 요망되는 기간동안 인큐베이션 시킨 후, 진동 테이블로부터 고처리량 어셈블리를 무균 작업대로 제거하였다. 트로프로부터 페그 리드를 제거하고, 린스 플레이트의 웰중에 페그를 함침시켰다. 린스 플레이트를 1 내지 2분 동안 방치시키면서, 하기 단계 4를 수행하였다.
4. 마이크로피펫을 사용하여, 20㎕의 부유 배양물 (장치의 주름진 트로프에서)을 단계 2 (바로 상기)에서 설정된 후속 플레이트의 횡렬 'A'의 180㎕ 염수에 이동시켰다. 총 4 x 20㎕ 분취량을 위해 이를 3회 더 반복하였다.
5. 부유 배양물을 적합한 생물적 위해 처리물로서 폐기 처리하였다.
6. 무균 작업대에서, 한쌍의 집게를 95% 에탄올중에 담궜다. 무균 작업대에서 에탄올 램프를 이용하여 집게를 불에 쬐었다. 에탄올 램프 사용시 주의를 요한다. 70% 에탄올을 사용하여 소독한 후 손이 건조되기 전에 에탄올 램프에 불을 부치지 말아야 하며, 집게를 불에 쬐여서도 않된다.
7. 불에 쬐인 집게를 사용하여, 에셈블리 리드로부터 페그 A1, C1, E1 및 G1을 분질러서 이를 단계 2에서 설정된 제 1 플레이트의 횡렬 A의 (각각의 상이한 '칼럼'에) 200㎕ 염수에 함침시켰다.
8. 불에 쬐인 집게를 사용하여, 페그 B1, D1, F1 및 H1을 뜯어서 버렸다.
9. 어셈블리의 페그 리드를 시험 플레이트에 삽입하였다. 시험 플레이트를 적합한 인큐베이터에 요망되는 노출 시간 동안 위치시켰다. 대안적 온도에서 인큐베이션을 수행할 수 있으며, 이는 MIC 결정을 위해 시간 연장이 고려될 수 있다.
10. 초음파 세척기 (초음파 처리기)의 트레이에 샘플 페그를 함유하는 미세적정 플레이트를 위치시켰다. '하이(high)'로 셋팅하여 5 내지 30분 동안 초음파처리하였다 (요망되는 시간은 검정할 미생물에 좌우됨). 초음파 처리기에 의해 물중에서 생성된 진동은 먼저 물을 통해 이동되어, 강철 삽입 트레이를 통과하여, 최종적으로 장치로 이동되어, 진동을 이용하여 96 페그의 표면으로부터 염수로 바이오필름을 분쇄시켰다.
11. 상응하는 미세적정 플레이트의 웰중의 부유 배양물 20㎕ 분취물 (단계 4로부터의)을 연속 희석하였다. 초음파 처리가 완료되면, 바이오필름 배양물로 이러한 연속 희석 공정을 반복하였다.
12. 적합하게 라벨링된 일련의 아가 플레이트상에 10-8 내지 10-3 및 10-5 내지 100으로 부유형 및 바이오필름 배양물의 연속 10배 희석물을 스팟 플레이팅하였다. 적합한 기간 동안 스팟 플레이트를 인큐베이션시키고, 성장을 기록하였다.
단계 5 - 중화 및 회수
항균제를 중화시키고 생존한 바이오필름 박테리아를 회수하는 본 단계는 도 7에 설명되어 있다. 요약하면, 노출 후, 바이오필름을 생리 염수로 2회 린싱하였다. 그 후, 바이오필름을 중화제 및 회수 배지를 함유하는 미세적정 플레이트로 이동시켰다. 바이오필름을 수 테이블 초음파 처리기상에서의 초음파 처리에 의해 분해하였다.
1. 신품의 96-웰 미세적정 플레이트의 각 웰에 200㎕의 적합한 회수 배지 (중화제 함유, 섹션 3.2의 실시예 참조)를 첨가하였다. 이러한 플레이트는 '회수 플레이트'로 불린다.
2. 사용된 각 어셈블리마다 2개의 린스 플레이트를 준비하였다.
3. 인큐베이터로부터 시험 플레이트를 제거하고, 무균 작업대에 위치시켰다 (또는, 주의하여 무균 기법을 이용). 페그 리드를 제거하여, 페그를 린스 플레이트의 생리학적 염수에 함침시켰다. 시험 플레이트를 린스 플레이트의 멸균 리드로 덮었다. 약 1 분 후, 제 1 린스 플레이트로부터 제 2 린스 플레이트로 페그 리드를 이동시켰다. 시험 플레이트를 덮고, 필요에 따라 MIC 측정을 위해 보유하였다.
4. 제 2 린스 플레이트로부터 상기 설정된 회수 플레이트로 페그 리드를 이동시켰다. 회수 플레이트 (장치의 페그를 함유)를 초음파 처리기의 트레이상에 이동시켰다. 5 내지 30분 동안 하이에서 초음파 처리하였다 (바이오필름의 두께에 의존적임). 박멸에 의해 96 페그의 표면으로부터 회수 플레이트로 바이오필름이 분해될 것이다.
5. 초음파 처리 후, 회수 플레이트로부터 페그 리드를 제거하고, 미세적정 플레이트의 원래의 리드를 재위치시켰다. 장치의 리드는 이제 오토클래이브 폐기물로 버려도 된다.
6. 회수 플레이트를 인큐베이터에 위치시키고, 시험할 유기체에 따라 최소 24 내지 72h 동안 인큐베이션시켰다.
생존가능한 세포 계수
항균제로의 처리후 바이오필름의 생존가능한 세포를 계수하기 위해, 회수 플레이트로부터의 회수 배지 (초음파 처리된 바이오필름 함유) 100㎕를 연속 희석 플레이트의 횡렬 A에 이동시켰다. 이러한 플레이트가 추가로 횡렬 B에서 F까지의 각 웰마다 생리 염수 용액 180㎕를 함유하도록 설정하였다. 다중-채널 피펫을 사용하여 횡렬 A로부터 20㎕를 연속희석시켰다. 다중-채널 피펫상의 팁은 미세적정 플레이트의 각 횡렬로의 이동 사이에 교체되어야 한다. 적합하게 라벨링된 아가 플레이트상에 바이오필림 배양물 (10배 연속 희석됨)을 스팟 플레이팅시켰다. 최소 48시간 동안 인큐베이션시켜 생존한 미생물을 최대한 회수하였다.
인큐베이션 후, 플레이트상에 회수된 박테리아를 계수하였다. 하기 섹션의 공식을 이용하여 바이오필름 군집의 치사율을 측정하였다.
치사 및 생존 (log-kill)을 계산하기 위해, 하기 공식을 이용하였다:
log-kill = log10 (초기 cfu/ml) - log10 (노출 후, 잔존하는 cfu/ml)
또는,
log-kill = log10 [1/(1 - 치사율 % (십진법으로서))]
치사율을 계산하기 위해, 하기 공식을 이용하였다:
치사율 % = [1 - (잔존하는 cfu/ml)/(초기 cfu/ml)] x 100
생존율을 계산하기 위해, 하기 공식을 이용하였다:
생존율 % = [(노출후 잔존하는 cfu/ml)/(초기 cfu/ml)] x 100
log 생존율 %를 계산하기 위해서는, 하기 공식을 이용하였다:
*log 생존율 % = log10 (생존율 %)
현미경 검사
많은 현미경 검사 기법에 있어서, 바이오필름을 어셈블리의 페그의 표면에 고착시키는 것이 바람직할 수 있다. 하기 프로토콜을 사용하여 주사 전자 현미경 (SEM) 및 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 위한 바이오필름을 준비하였다. 상기 표준 실험 공정에서, 각 시험 플레이트는 8개의 성장 대조군 (노출 전)을 갖는다. 이들중 4개는 성장 대조군으로서 사용하였다. 나머지 4개는 폐기하는 대신에 현미경에 사용될 수 있다.
주사 전자 현미경 ( SEM )을 위한 바이오필름 고정
작업 용액을 제조하였다.
이후 단계에서는 보호 장갑을 착용하고, 흄후드(fume hood)에서 이러한 매우 독성인 화학품을 조작하였다.
카코딜레이트 완충제 0.1M : 이중 증류된 H2O 1리터중 16g의 카코딜산 16g을 용해시켰다; pH 7.2로 조절하였다.
카코딜레이트 완충제중의 2.5% 글루타르알데히드: 52ml의 카코딜레이트 완충제중에 70% 글루타르알데히드 2ml를 용해시켰다 (2.5% 용액 수득). 또한, 5% 용액이 사용가능하다 (26ml의 카코딜레이트 완충제중의 2ml의 글루타르알데히드).
표준 프로토콜
이러한 고정 기법은 바이오필름에 해롭다. 그러나, 이는 근본적인 박테리아의 세포 구조를 조사가능하게 한다.
1. 불에 쬐인 한쌍의 집게를 사용하여 MBECTM-HTP 장치로부터 페그를 부러뜨렸다.
2. 페그를 1분 동안 0.9% 염수로 린싱하였다. 이는 느슨하게 부착된 부유 박테리아를 분쇄시킨다.
3. 페그를 0.1M 카코딜산중의 2.5% 글루타르알데히드중에 고정시켰다 (pH 7.2). 페그를 이 용액중에서 4℃에서 16h 동안 위치시켰다.
4. 이러한 고정 단계 후, 페그를 약 10분 동안 0.1M 카코딜산중에 세척하였다.
5. 약 10분 동안 이중 증류수로 페그를 1회 세척하였다.
6. 70% 에탄올중에서 15 내지 20분 동안 페그를 탈수시켰다.
7. 최소 24h 동안 공기 건조시켰다.
8. 조각을 탑재하여, SEM으로 조사하였다.
대안적 프로토콜
본 고정 단계가 덜 해롭다. 세포외 중합성 매트릭스 및 일부 (탈수화된) 바이오필름 구조를 관찰가능하다.
1. 불에 쬐인 한쌍의 집게를 사용하여 MBECTM-HTP 장치로부터 페그를 부러뜨렸다.
2. 페그를 2분 동안 0.9% 염수로 린싱하였다. 이는 느슨하게 부착된 부유 박테리아를 분쇄시킨다.
3. 페그를 0.1M 카코딜산중의 2.5% 글루타르알데히드중에 고정시켰다 (pH 7.2). 페그를 이 용액중에서 20℃에서 2 내지 3h 동안 위치시켰다.
4. 120h 이상 동안 공기 건조시켰다.
5. 조각을 탑재하여, SEM으로 조사하였다.
공초점 레이저 주사 현미경 ( CLSM )을 위한 바이오필름 고정
인산염 완충된 염수중의 5% 글루타르알데히드: 26ml의 인산염 완충된 염수중에 70% 글루타르알데히드 2ml를 용해시켰다 (5% 용액 수득).
표준 프로토콜
1. 불에 쬐인 한쌍의 집게를 사용하여 리드로부터 페그를 부러뜨렸다.
2. 페그를 1분 동안 0.9% 염수로 린싱하였다. 이는 느슨하게 부착된 부유 박테리아를 분쇄시킨다.
3. 페그를 인산염 완충된 염수중의 5% 글루타르알데히드중에 고정시켰다 (pH 7.2). 페그를 이 용액중에서 30℃에서 0.5 내지 1h 동안 위치시켰다.
4. 0.9% 염수중에 1분 동안 페그를 린싱하였다.
5. 페그를 적합한 형광발색단으로 염색하고, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 조사하였다.
어셈블리의 돌출부 표면 코팅
페그 또는 돌출부 표면은 많은 물질로 코팅되어 배양 조건이 까다로운 미생물의 성장을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 캔디다 spp.에 의한 바이오필름 형성은 페그를 1.0% L-리신으로 코팅함으로써 향상된다. 페그 리드는 또한, 히드록시아페타이트, 콜라겐 또는 플라티늄으로 코팅될 수 있다.
실시예 3 MBEC 값 측정
최소 바이오필름 박멸 농도 (MBEC) 값을 측정하기 위해, 회수 플레이트의 웰중의 혼탁도를 (육안으로) 체크하였다. 대안적으로, 미세적정 플레이트 판독기를 이용하여 650nm (OD650)에서 광밀도 측정치를 수득하였다. 투명한 웰 (OD650 < 0.1)은 바이오필름이 박멸되었음을 나타낸다.
실시예 4 MIC 값 측정
최소 억제 농도 (MIC) 값을 측정하기 위해, 시험 플레이트의 웰중의 혼탁도를 (육안으로) 체크하였다. 대안적으로, 미세적정 플레이트 판독기를 사용하여 650nm (OD650)에서의 광밀도 측정치를 수득하였다. MIC는 유기체의 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 정의된다. 투명한 웰 (OD650 < 0.1)은 적합한 인큐베이션 기간 후의 억제를 입증한다.
실시예 5
배경: 슈도모나스 애루기노사 (Ps) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staph)는 조직 및 이식된 기면상에 바이오필름을 형성하여, 바이오필름-특이적 내성 메카니즘으로 인해 항생제 치료에 빈번히 무반응적인 지속적 감염을 초래한다. 바이오필름 감염에 대한 항균 치료제를 선택하기 위해 MIC를 이용하는 것인 일반적으로 적합하지 않다. MBEC® 검정법을 이용하여 단일 제제 및 조합 제제에 대한 바이오필름 및 부유 박테리아의 항균 민감도를 평가하였다.
방법: Ps (낭포성 섬유증 환자로부터의 12개 분리물) 및 Staph (장치 관련 감염으로부터의 12개 분리물)의 바이오필름을 MBEC® 검정 리드의 핀상에 형성시켰다. 그 후, 바이오필름 및 부유 박테리아를 다양한 항생제 및 항생제 조합에 24시간 동안 노출시켰다 (표 1a 및 1b). 검정법에 의해 단독의 또는 복합된 항균제에 대한 바이오필름 및 부유 유기체로서의 각 분리물의 정성적 민감도를 제공하였다.
결과:
표 1a. 개별적 항생제 및 항생제 조합에 대한 Staph 내성
Figure pat00001

표 1b. 개별적 항생제 및 항생제 조합에 대한 Ps 내성
Figure pat00002
결론: 내성 패턴은 각 균주에 있어서 독특하였다. Ps 및 Staph 균주는 부유 형성물로서는 다수의 항생제에 민감하였으며, 바이오필름으로서는 현저하게 더욱 내성을 띠었다. 특정 항생제는 개별적 제제에서 보다 복합물로서 더욱 효과적이었다. MBEC® 검정법은 바이오필름 관련 감염의 치료를 위한 항생제의 선택에 유용할 수 있다.
실시예 6
바이오필름 PA 항균제 민감성 시스템
바이오필름 패널을 부유성 및 바이오필름 슈도모나스 애루기노사 둘 모두의 항균제 민감도를 측정하는데 사용하도록 설계하였다.
요약 및 원리
본 브로쓰 희석 항균제 민감성 테스트는, 클리니칼 앤 라보라토리 스탠다드 인스티튜트 TM (Clinical and Laboratory Standard Institute TM: CLSI)에 의해 규정된 명확한 브레이크포인트 농도에서 양이온 조절된 뮬러-힌톤 브로쓰 (Mueller-Hinton broth (CAMHB))에서 희석된 다양한 항균제를 단독으로, 그리고 조합된 형태로 갖는다. 패널 웰을 95 페그 접종 리드를 사용하여 부유성 및 바이오필름 슈도모나스 애루기노사로 접종하였다. 그 후, 패널 및 페깅된 리드를 최소 16시간 동안 35℃에서 인큐베이션하였다. 부유형 민감도 및 내성은 35℃에서 16-24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 향균제의 존재하에 억제 및 성장을 측정함으로써 결정된다. 항균제에 노출된 바이오필름 박테리아를 함유하는 페깅된 리드를 96 웰 플레이트에서 단지 CAMHB를 함유하는 회수 배지에 위치시켰다. 바이오필름의 민감도 및 내성은 추가로 16-24시간 동안 35℃에서 인큐베이션시킨 후에 억제 및 성장을 측정함으로써 결정된다.
공정 재료
바이오필름 PA 브로이크포인트 패널
*리드가 구비된 멸균 회수 패널
멸균 MBECTM 95 페깅된 접종 리드
멸균 MBECTM 트레이 (접종물 성장용)
멸균 린스 패널
0.5 맥파랜드 바륨 설페이트 혼탁도 기준
접종수
접종 브로쓰 (트립틱 소이 브로쓰; Tryptic Soy Broth)
테스트 및 회수 브로쓰, 양이온 조절된 뮬러 힌톤 브로쓰 (CAMHB)
일회용 팁이 구비된 100㎕ 피펫
다중채널 마이크로피펫 (12개 채널을 갖는 50-300㎕가 권고됨)
진동 프랫폼 (9°경사각)
인큐베이터
25ml 피펫
스크류 탑이 구비된 50ml 멸균 튜브
특성 조절 유기체 (슈도모나스 애루기노사, ATCC 27853)
특성 조절 보고 형태 (Quality control report forms)
96 웰 미세적정 플레이트 (페그 세척용 1개 및 회수 플레이트용 1개)
볼텍스
공정 개요
A. 접종물 제조
CLSI는 콜로니를 계수함으로써 주기적으로 접종물 밀도를 체크할 것을 권고하였다. 슈도모나스 애루기노사 ATCC 27853에 대해 예측되는 결과는 약 5 x 105 CFU/ml2,3에 근접해야 한다.
1. 일차 접종 방법
혼탁도 표준 기법이 슈도모나스 애루기노사의 직접 접종에 권고된다.
a. 멸균된 목재의 어플리케이터 스틱 또는 박테리아용 루프를 사용하여, 18-24시간 비억제성 아가 플레이트로부터 4-5개의 크거나 5-10개의 작은 유사형 형태의 잘 분리된 콜로니의 표면을 접촉하였다.
b. 3ml 접종수 (오토클래이브 증류수)중에 유화시키고, 0.5 맥파랜드 기준과 비교하였다.
c. 2-3초간 현탁물을 볼텍스하였다.
d. 88 g/l의 표준화된 현탁액을 22ml의 멸균 트립틱 소이 브로쓰 (TSB)로 피펫팅하였다. 단단히 마개를 닫았다. 샘플을 8-10회 흔들거나 수초동안 볼텍스하여 혼합하였다.
2. 바이오필름 PA 접종 페그 리드의 준비
a. 패키지로부터 95 페깅된 리드와 MBECTM 트레이를 제거하였다 (페키징의 무결성이 손상되었면 사용하지 말것).
b. 트레이로부터 페깅된 리드를 제거하였다.
c. 22ml의 TBS중의 슈도모나스 애루기노사 현탁액 (1d 참조)을 끼워진 트레이로 피펫팅하였다.
d. 95 페깅된 접종 리드를 트레이상에 위치시켰다 (페깅된 리드가 트레이 위로 단단히 맞춰졌는지를 체크해야 한다).
e. 조립된 페깅된 리드와 트레이를 약 9°경사의 진동 플랫폼에 위치시켰다. 트로프를 진동 방향과 평행하게 정렬시켰다. 분당 3-4회 진동시키면서 35℃에서 인큐베이션하였다. 경사각이 더무 크거나 플랫폼 진동이 비대칭이기 때문에 일부 진동기는 바이오필름 PA 검정에 적합하지 않다. 작동자는 진동기가 이러한 검정의 필요 요건에 부합하는지를 체크해야 한다.
f. 4-6시간 동안 인큐베이션하였다. 이는 약 105 cfu/peg의 바이오필름을 생성시키는데 충분하다.
B. 패널 준비
1. 냉동 보관으로부터 사용될 패널을 제거하였다. 주머니를 잘라서, 패널을 제거하고, 30 내지 60분 동안 실온과 동일해지게 하였다.
C. 부유형의 향균제 민감도 시험
1. 해동된 바이오필름 PA 패널상에 MBECTM 95 페깅된 리드를 위치시켰다.
2. 3-7 x 105 CFU/ml의 부유형 슈도모나스 애루기노사의 최종 웰 농도가 달성되어야 한다2.
3. 혈액 아가 플레이트상에 접종물을 스트리킹하고, 16-20시간 동안 인큐베이션시켜 순수 플래이트가 준비되어야 한다. 하나 초과의 콜로니 형태가 순수 플레이트상에 존재하는 경우, 시험 콜로니를 재분리하고 패널을 재시험하는 것이 권고된다.
D. 항균제 패널 인큐베이션
1. 3-5개 그룹의 패널을 적층시켜 인큐베이션 동안 균일한 열 분포가 보장되게 하였다.
2. CO2 비함유 인큐베이터에서 35℃에서 16-24시간 동안 패널을 인큐베이션시켰다.
3. 16-24시간 동안 인큐베이션 후 부유형 패널은 판독할 준비가 되었다.
4. 페깅된 리드를 제거하였다 (하기 섹션 E1 참조).
5. 부유형 향균제 민감도 결과를 판독하였다 (하기 F 참조).
E. 바이오필름 항균제 민감도 시험
1. 페깅된 리드를 웰당 200 g/l ± 10 g/l의 접종수를 함유하는 96 웰 플레이트에 약 30초 동안 위치시켰다. 이는 페그로부터 잔여의 항생제를 제거하기 위한 것이다.
2. 페깅된 리드를 각 웰당 200g/l의 CAMHB를 함유하는 96웰 회수 플레이트중에 위치시켰다.
3. 인큐베이션 동안 균일한 열 분포를 위해, 5개 이하의 그룹으로 패널을 적증시켰다.
4. CO2 비함유 인큐베이터에서 35℃에서 16-24시간 동안 패널을 인큐베이션시켰다.
5. 16-24시간 동안 인큐베이션 후 바이오필름 패널은 판독할 준비가 되었다.
6. 페깅된 리드를 제거하여 버렸다.
7. 바이오필름 항균제 민감도 결과를 판독하였다 (하기 F 참조).
F. 부유형 및 바이오필름 민감도에 대한 패널 판독
1. 16-20시간 인큐베이션 후 패널을 제거하였다.
2. 린트(lint) 비함유 티슈로 패널 바닥을 닦아 존재할 수 있는 임의의 응결물 또는 부스러기를 제거하였다.
3. 항균제 웰에서의 성장은 혼탁한 것으로 나타나며, 이는 웰에 걸쳐 탁한 백색을 띠게 하거나, 웰 중앙에 백색 버튼이 생성되거나, 웰에 걸쳐 미세한 과립물이 형성된 것일 수 있다. 불충분하게 성장하거나 성장하지 않은 것은 웰 또는 브로쓰에서 약간의 백색을 띠는 것으로 규정된다.
4. 패널 판독을 위한 주의사항:
a. 성장 웰이 혼탁한 경우에만 패널을 판독해야 한다.
b. 멸균 대조군 웰 (SC)이 혼탁해진 경우, 또는 성장 웰 또는 성장 대조군 (GC)에서 성장이 발생하지 않은 경우 항균제 민감도 웰을 판독하지 말아야 한다.
G. 부유형 항균제 민감도 판독:
표 2a. 부유형 항균제 민감도 판독
Figure pat00003
결과 해석
민감성은 유기체의 브레이크포인트 민감도를 획득가능한 혈액 또는 소변 수준의 향균제와 비교하여 결정하였다. 하기 표 2b는 CLSI 다큐먼트 M100-S9에 기재된 바와 같은 해석용 기준을 나타낸다.
표 2b. CLSI 다큐먼트 M100-S9의 해석용 기준
*CLSI 다큐먼트 M100-S16에 기재된 바와 같은 해석용 브레이크포인트에 기초함.
참조
1. Murray, PR., E.J. Baron, MA Pfaller, F.C. Tenover and R.H. Yolken (eds) 2003. Manual of Clinical Microbiology, 8th Ed. American Society of Microbiology Washington, D. C.
2. Clinical Standard Laboratory Institute TM (2006). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; 6th ed. Approved standard M7-A7.
3. Clinical Standard Laboratory InstituteTM (2006). Performance Standards For Antimicrobial Susceptibility Testing; 16th informational supplement, Wayne, Pennsylvania CLSI document M100-S16, Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Road Suite 1400, Wayne, Pennsylvania
실시예 7
실시예 6에 기술된 실험을 도 10에 도시된 시험 플레이트 형상 및 브레이크포인트를 이용하여 반복하였다.
실시예 8
본 연구에서, 슈도모나스 애루기노사 바이오필름 검정 키트를 사용하여 상이한 농도의 10개의 항생제 및 이러한 항생제의 조합의 효과를 시험하고, 두 균주의 P. 애루기노사 즉, CF 6649 및 CF 6106에 대한 항생제의 효과를 비교하였다.
항생제 및 항생제 조합을 세균 바이오필름에 대한 항생제 조합중 유효성이 입증된 일차 연구 결과에 기초하여 선택하였다.
바이오필름 형성: 혼탁도가 1.0의 맥파랜드 기준 (약 3.0 X 108 cfu/mL)에 부합되도록 TBS중의 유기체 현탁액을 제조하였다. 30mL의 접종물을 107 cfu/mL의 초기 접종물에 대한 1/30 현탁액을 희석함으로써 30mL 접종물을 준비하였다. 22mL의 접종물을 본 발명의 어셈블리의 트로프에 넣고, 페그 리드를 제자리에 놓았다. 트로프를 진동 방향과 평행하게 하면서, 35℃에서 약 9° 경사도 및 분당 3-4회 진동되는 진동 플랫폼에 장치를 위치시켰다. >105 cfu/페그의 바이오필름을 생성시키는 것이 목표였으며; 이는 24시간 미만의 인큐베이션으로 달성되었다.
96-웰 조직 배양 플레이트를 사용하여 시험 플레이트를 준비하였다. 20㎕의 각 시험 항생제를 96-웰 조직 배양 플레이트에 위치시키고, 180㎕의 양이온 조절된 뮬러 힌톤 브로쓰 (CAMHB)를 미세적정 플레이트의 각 웰에 첨가하여 시험 약물의 1:10 희석을 달성하였다. 2개의 웰 (G12 및 H12)을 비우거나, 200㎕의 멸균된 일반 염수를 포함시켰다. G12 및 H12는 멸균 대조군으로써 작용하였다. 유사하게, A12 및 B12는 성장 대조군으로서 작용하였다.
페그를 갖춘 리드를 시험 플레이트상에 위치시키고, 35℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
멸균된 96웰 미세적정 플레이트중의 염수 (웰당 200㎕)의 린스 플레이트(들)를 준비하였다. 또 다른 96 웰 미세적정 플레이트중의 CAMHB (웰당 200㎕)의 회수 플레이트(들)을 또한 준비하였다. 페그를 염수중에 위치시켰다. 페그를 이동시켜 배지를 회수한 후, 5분 동안 하이에서 초음파 처리하여 생존한 바이오필름을 이동시켰다. 그 후, 페그를 35℃에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션시켜 생존한 박테리아가 혼탁하게 성장하게 하였다.
부유형 MIC를 시험 플레이트의 웰중의 혼탁도를 650nm에서의 플레이트 판독기상에서 육안으로 체크하여 측정하였다. 시험 인큐베이션 동안 바이오필름으로부터의 발산된 부유형 박테리아에 대한 각각의 항생제의 MIC (최소 억제 농도)를 측정하였다. MIC는 유기체의 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 정의된다. 투명한 웰 (A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
바이오필름 MBEC (최소 바이오필름 제거 농도)를 회수 플레이트의 혼탁도를 판독함으로써 각 항생제에 대해서 측정하였다. MBEC는 회수 배지중 바이오필름 박테리아의 재성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 정의된다. 투명한 웰 (A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
슈도모나스 애루기노사 MBEC 시험 플레이트: GM = 젠타마이신, AK = 아미카신, CFTZ = 세프타지딤, TMS = 트리메토프림/설파메톡사졸, P+T = 피페라실린/타조박탐 (피페라실린으로서 제공된 농도), AZTR = 아즈트레오남, IMP = 이미페넴, TB = 토브라마이신, CIPRO = 시프로플록사신, GC = 성장 대조군, SC = 멸균 대조군.
개별적 항균제 및 향균제 조합에 대한 P. 애루기노사의 부유형 및 바이오필름 형태의 민감도를 신속하고 재현가능하게 측정할 수 있다 (표 3a). 각 분리물에 있어서 내성 패턴은 독특하였다. P. 애루기노사는 부유 형태로서 다수의 항생제에 대해 민감하였으며, 바이오필름으로서 현저하게 더욱 내성을 띠었다.
표 3a: 개별적 항생제 및 항생제 조합에 대해 내성을 띠는 P. 애루기노사 분리물의 수
Figure pat00005
특정 항생제는 개별 제제로서 보다 조합 형태일 때 더욱 효과적이었다. 검정에 의해 브레이크포인트 농도의 10개의 단일 항생제 및 82개의 조합 항생제를 제공하였다. 이러한 검정은 낭포성 섬유증 환자에 일반적인 바이오필름 관련 감염 치료용 항생제의 선택시 임상의에게 유용할 수 있다.
이러한 실험은 각 균주가 독특한 바이오필름 민감도를 가진다는 것을 입증한다. 이는 부유물 데이타가 분리물중에서 매우 유사하기 때문에 놀랍다. 이러한 결과는 유기체가 이의 성장 조건 (부유형 또는 바이오필름)에 따라 개별적 항생제 또는 항생제 조합에 대해 상이한 민감도를 갖는다는 것을 명백해 나타낸다.
실시예 9 Staph 시험 플레이트 어셈블리
원형의 스타필로코커스 시험 플레이트를 발생시켜 스타필로코커스 감염 치료에 사용될 수 있는 항생제 및 항생제 조합을 평가하였다. 선택된 항생제 및 항생제 조합은 항생제 조합중 세균 바이오필름에 대한 유효성이 입증된 일차 연구 결과에 기초한다. 원형의 96 웰 플레이트는 하기에 기술되어 있다:
스타필로코터스 시험 플레이트: GM = 젠타마이신, CLIN = 클린다마이신; CFZ = 세파졸린, CLOX = 클록사실린; RIF = 리팜핀; VAN = 반코마이신; LIZD = 라인졸리드; AMP = 암피실린 서브락탐즈; Cipro = 시프로플록사신; GC = 성장 대조군, SC = 멸균 대조군.
개별적 항균제 및 향균제 조합에 대한 부유형 및 바이오필름 형태의 스타필로코커스 아우래우스의 민감도를 신속하고 (약 48시간 이내) 재현가능하게 측정할 수 있다 (표 3b). 각 분리물에 있어서 내성 패턴은 독특하였다. 스타필로코커스 아우레우스는 부유 형태로서 다수의 항생제 및 항생제 조합에 대해 민감하였으며, 바이오필름으로서 현저하게 더욱 내성을 띠었다.
표 3b: 개별적 항생제 및 항생제 조합에 대해 내성인 스타필로코커스 아우레우스 분리물의 수
Figure pat00006
특정 항생제는 개별 제제로서 보다 조합 형태일 때 더욱 효과적이었다. 검정에 의해 브레이크포인트 농도의 10개의 단일 항생제 및 82개의 조합 항생제를 제공하였다.
이러한 실험은 각 균주가 독특한 바이오필름 민감도를 가진다는 것을 입증한다. 이는 부유물 데이타가 분리물중에서 매우 유사하기 때문에 놀랍다. 이러한 결과는 유기체가 이의 성장 조건 (부유형 또는 바이오필름)에 따라 개별적 항생제 또는 항생제 조합에 대해 상이한 민감도를 갖는다는 것을 명백해 나타낸다.
실시예 10: 부유형 및 바이오필름 형태의 캔디다 spp . 및 아스퍼길루스 푸미가투스의 항진균제에 대한 민감도 비교
하나의 알비칸 및 2개의 비-알비칸 종을 포함하는 3개의 캔디다 임상 분리물을 본 연구에 사용하였다. C.알비칸스 ATCC 14053을 유니버시티 오브 캘거리 (University of Calgary, Department of Biological Sciences)로부터 입수하였다. C. 트로피칼리스 99916 및 C. 글라브라타 14326은 복막투석 (CAPD) 처리하는 환자의 투석물로부터 수득하였다. 아스퍼길루스 푸미가투스를 또한 시험하였다.
바이오필름 형성 및 캔디다 및 아스퍼길루스 바이오필름의 항균제 민감도 측정을 본 발명의 어셈블리를 이용하여 수행하였다. 장치는 리드상에 분포된 96 페그 또는 돌출부를 갖는 미세적정 플레이트 리드를 특징으로 한다. 각각의 페그는 미생물이 접착하고, 콜론화되고 균일한 바이오필름을 형성할 표면을 제공한다. 페그는 정확하게 표준 96-웰 미세적정 플레이트의 웰로 맞춰진다. 리드는 진균류를 성장시키고, 세척하고 인큐베이션하기 위한 특정 트로프를 갖는 베이스와 함께 사용된다. 캔디다 sp.의 콜론을 사보우라우드 덱스트로스 아가 (Sabouraud Dextrose agar :SDA) (BBL Microbiological Systems, Cockeysville, Md)상의 24시간 배양물로부터 피킹하고, 뮬러-힌톤 브로쓰 (MHB) (Difco Laboratories, Detroit Mich)로 이동시켜, 현탁액이 1.0의 맥파랜드 기준에 부합되게 하였다. 그 후, 이러한 현탁액을 MHB중에 1:30으로 희석하고, 25ml를 베이스의 트로프 챔버로 피펫팅하였다. 밀봉된 어셈블리 (베이스상에 위치한 페그를 갖춘 리드)를 37℃ 인큐베이터중에서 분당 3.5회 플레이트를 진동시키도록 설정된 호퍼 레드 로커 (Hoeffer Red Rocker: VWR, Scientific)에 위치시켰다. C. 알비칸스 및 C. 트로피칼리스를 호기성 인큐베이션시키고, C. 글라브라타를 10% CO2중에서 인큐베이션시켰다. C. 글라브라타가 바이오필름을 형성하기 위해서 10% CO2 대기가 요구된다는 것은 일차 실험에서 측정하였다.
접종 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 22, 23, 24 및 26시간에 장치의 리드로부터 3개의 페그를 무작위로 제거함으로써 각각의 분리물에 대한 성장 곡선을 획득하였다. 제거된 페그를 200㎕의 염수를 함유하는 마이크로퓨즈 튜브에 넣고, 5분 동안 초음파 처리하였다 (Aquasonic sonicator, VWR Scientific). 연속 희석을 수행하고, SDA상에서 생존가능한 캔디다 spp. 세포의 플레이트 계수를 수행하였다. 22시간 캔디디 spp. 바이오필름을 함유하는 추가의 페그를 인산염 완충된 염수 용액 (PBSS)중의 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고, 밤새 공기 건조시키고, 주사 전가 현미경을 위해 준비하였다.
A. 푸미가투스 바이오필름의 형성을 위한 최적의 조건을 일차 연구에서 결정하였다. 페그를 먼저 1% L-리신 (Sigma Chemical Co. St.Louis, Mo)에 담그고, 무균 작업대에서 공기 건조시켰다. 50㎕의 A.푸미가투스 스포어 현탁액을 500ml의 에르린마이어 플라스크 (Erlynmeyer flask)중에서 250ml 트립픽 소이 브로쓰 (TSB)(Difco, Detroit, Mich)에 첨가하였다. 플라스크를 150rpm으로 20시간 동안 37℃에서 쉐이킹하였다. 액체 브로쓰의 정점에서 유리상에 성장한 부착 균사 세포를 멸균된 면봉으로 제거하였다. 이를 4℃로 균형을 이룬 250ml의 새 TBS를 갖는 블랜더 (Waring)에 이동시켰다. 균사를 2분 동안 얼음위에서 중간 속도로 블랜딩하였다. 이를 3회 반복하였다. 그 후, A. 푸미가투스 현탁액 (25ml)을 바이오필름 성장 장치의 트로프로 이동시켰다. 리신-처리된 페그를 함유하는 리드를 현탁액에 위치시키고, 장치를 상기 기술된 바와 같이 레드 로커 (Red Rocker)로 이동시켰다. 플레이트를 25시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 각 페그상에서 생존가능한 바이오필름을 성립시켰다. 24시간 아스퍼길루스 바이오필름을 함유하는 페그의 주사 전자 미세현미경 시험을 수행하였다.
최소 바이오필름 박멸 농도 검정
바이오필름 민감도 시험에 24시간 동안 트레이에서 진동시킨 후 형성된 바이오필름을 함유하는 어셈블리의 페깅된 리드를 사용하였다. 리드상의 각 페그를 96-웰 미세적정 플레이트 (Falcon)중의 200㎕ 인산염 완충된 염수액 (PBSS)중에서 1회 부드럽게 세척하였다. 그 후, 페깅된 리드를 RPMI 1640 (Sigma, St.Louis, Mo) 또는 1% DMSO (약물 시험 섹션 참조)를 함유하는 RPMI 1640 200㎕중에 항진균제 2배 희석물을 함유하는 또 다른 96 웰 미세적정 플레이트로 옮겼다. 페그를 24시간 동안 약물에 노출시킨 후, 페깅된 리드를 제거하고, 염수중에 2회 부드럽게 린싱하였다. 그 후, 페깅된 리드를 RPMI 1640 회수 배지를 함유하는 96 웰 프레이트상에 위치시켰다. 페그를 초음파 처리기에서 5분 (캔디다 spp.) 또는 7분 (아스퍼길루스) 동안 초음파처리하여, 부착 세포를 회수 배지로 이동시켰다. 회수 배지중 20㎕의 분취물을 SDA (캔디다 spp) 또는 로스 벤갈 아가 (Rose Bengal Agar: A.푸미가투스)상에 스팟 플레이팅시켜 MBEC를 획득하였다. 또한, 어셈블리를 사용하여 최소 억제 농도 (MIC) 및 최소 살균 농도 (MFC)를 측정하였다. 바이오필름으로부터 발산된 부유 세포 및 항생제를 함유하는 웰의 혼탁도를 650nm에서 측정하여 MIC를 획득하였다. 각 웰로부터의 20㎕ 샘플을 또한, 사보우라우드 덱스트로스 아가 (Sabouraud Dextrose agar: 캔디다 spp) 또는 로스 벤갈 아가 (Rose Bengal Agar: A. 푸미가투스)상으로 스팟 플레이팅시켜 MFC를 획득하였다.
캔디다 spp . 및 A. 푸미가투스 부유형의 민감도
최소 억제 농도 (MIC) 및 최소 살균 농도 (MFC)를 네셔널 커미트 퍼 클리니칼 라보라토리 스탠다드 (National Committee for Clinical laboratory Standards: NCCLS)에 따라 측정하였다. 간단하게는, 캔디다 sp.를 플레이팅할 때 까지 -70℃에서 폴리스트렌 영역상에서 유지시켰다. 이들 유기체를 시험 시작 24시간 전에 사보우라우드 덱스트로스 아가 (Microbiologie) 플레이트상에 스트리킹시켰다. 24시간 콜론을 아가 플레이트로부터 피킹하고, 혼탁도가 0.5의 맥파랜드 기준에 부합하도록 뮬러-힌톤 브로쓰 (MHB, Microbiologie)에 위치시켰다. 그 후, 이를 MHB로 1:10 희석시켜 약 1x105 내지 5x105 CFU/ml의 현탁액을 수득하였다. 이러한 현탁액 5㎕를 96 웰 미세적정 플레이트 (Nunclon)에서 RPMI 1640 배지 (Sigma)로 연속 희석된 200㎕ 항진균제를 함유하는 웰에 첨가하였다. A. 푸미가투스를 시험할 때 까지 4℃에서 스포어 현탁액으로서 유지시켰다. 스포어 현탁액 (50㎕)을 250ml의 TSB로 희석하고, 이러한 현탁액 5㎕를 상기와 같은 항진균제 희석물을 함유하는 각각의 시험 웰에 첨가하였다.
그 후, 시험 웰을 항진균제와 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 미세적정 플레이트 판독기 (Softmax, VWR)상에서 650nm에서 혼탁도를 판독함으로써 캔디다에 대한 MIC를 획득하였다. 각 웰의 20㎕ 분취물을 또한 플레이팅 시키고 (SDA), 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 이들로부터 MFC를 획득하였다. 각 웰로부터 100㎕를 로스 벤갈 아가상으로 플레이팅 시킨 후, 멸균 유리 스프레더로 스프레딩시킴으로써 아스퍼길루스에 대한 MFC를 측정하였다. 플레이팅된 유기체를 콜로니 계수 전에 3일 동안 25℃에서 유지시켰다.
약물을 시험하였다. 이트라코나졸, 플루코나졸 및 케토코나졸을 잔센 파마슈티칼스 (Janssen Pharmaceuticals, Brussels, Belgium)로부터 획득하였다. 니스타틴 5-플루오로시토신, 그리세오풀빈 (Griseofulvin), 암포테리신 B 및 폴리믹신 B를 시그마 케미칼 씨오.(Sigma Cemical Co, St.Louis, Mo)로부터 획득하였다. 5-플루오로시토신, 폴리믹신 B 설페이트 및 니스타틴을 이중 증류수중에 10.24mg/ml의 농도로 용해시키고, RPMI중에서 1024㎍/ml 내지 0.125㎍/ml의 범위에 걸쳐 시험 웰중에서 희석시켰다. 암포테리신 B를 51.2mg/ml의 최대 농도로 순수한 디메틸설폭손 (DMSO)중에 용해시켰다. 이를 연속 희석하여 시험 웰에서 1% DMSO 및 RPMI 1640 (Sigma, St.Louis Mo)중의 암포테리신 B 512㎍/ml 내지 0.016㎍/ml를 수득하였다. 플루코나졸, 이트라코나졸, 케토코나졸 및 그리세오풀빈을 순수 DMSO중에 102.4mg/ml의 농도로 용해시키고, 추가로 희석하여 시험 웰에서 1% DMSO 및 RPMI 1640중의 1024㎍/ml 내지 0.032㎍/ml 약물 범위를 수득하였다.
진균 세포에 대한 1% DMSO의 효과를 측정하기 위해, RPMI 1640중에 1% DMSO를 함유하며 약물을 함유하지 않는 대조군 웰을 DMSO를 함유하는 모든 시험 웰과 나란히 시험하였다. 또한, 모든 시험은 접종되지 않은 멸균의 대조군 웰과 항균제를 함유하지 않은 성장 대조군 웰을 포함한다.
장치 표면상에서의 바이오필름 성장: 각각의 캔디다 종은 장치의 각 페그상에서 바이오필름을 형성하여 접종 22시간 후 105 내지 106 CFU/페그를 수득하였다. C.글라브라타가 가장 배양조건이 까다로웠으며, 이는 바이오필름을 형성하기 위해 10% CO2가 필요하다. 호기성 인큐베이션시키는 경우, 20시간 후, C. 글라브라타는 약 5 x 103 CFU/페그로 성장한 반면, 10% CO2에서는 평균 4.1 x 104 CFU/페그로 성장하였다. 아스퍼길루스 바이오필름이 페그에 더욱 단단하게 부착되는 것으로 보여진다. 아스퍼길루스는 접종 24시간 인큐베이션 후 105 CFU/페그로 성장하였다 (데이타 미도시).
MBEC 장치의 페그상에 형성된 바이오필름은 모든 종의 캔디다에 있어서 유사하였다. 전체 페그를 균일하게 코팅하고 쌓여진 캔디다 세포는 광대한 엑소폴리사카라이드 매트릭스이다. 캔디다 세포는 특정 영역에서 긴 세포의 봉긋한 덩어리로서 성장하였다. 아스퍼길루스 바이오필름은 24시간 후 전체 페그 위를 가득채운 유기체화된 코니디오포어(conidiophores)로 구성된다. 엑소폴리사카라이드는 페그 표면에 부착하여 각 아스퍼길루스 코니디오포어를 둘러싼다.
항진균제 민감성: 부유 세포를 억제하기 위해 요구되는 항생제의 농도(MIC), 부유 세포를 사멸시키기 위해 요구되는 항생제의 농도(MFC), 및 바이오필름 진균류를 사멸시키기 위해 요구되는 항생제의 농도(MBEC)는 도12)에 요약되어 있다. 장치 페그 상에 형성된 바이오필름으로부터 방출된 부유 세포 및 NCCLS 프로토콜로부터 수득된 MIC 및 MFC 값은 유사하거나 동일하였다. 장치로부터 얻어진 MIC 및 MFC는 매우 재현가능하였다. 진균 바이오필름은 보편적으로 부유 세포 보다 더욱 제거하기 어렵다(도 12).
유사한 결과를 시험된 캔디다의 모든 종으로부터 얻었다. 대개 MBEC는 MIC 또는 MFC를 수배 정도로 초과하였다. 암포테라신 B, 니스타틴, 5-플루로시토신, 플루코나졸, 이트라코나졸 및 케토코나졸은 부유형 캔디다 세포를 사멸시키는데 모두 효과적이지만, 니스타틴 만이 바이오필름으로서 성장하는 동일한 캔디다에 대해 효과적이었다. 예를 들어, 폴리엔 항진균 약물인 암포테리신 B는 C. 알비칸스(C. albicans)의 부유 배양물에 대해 사용할 때, 0.09 ㎍/ml의 평균 MIC 및 0.02 ㎍/ml의 평균 MFC를 갖는 것으로 확인되었다. 반대로, 평균 12 ㎍/ml의 동일한 약물은 C. 알비칸스의 바이오필름 세포를 사멸시키는데 요구되었다. 그리세오풀빈 및 폴리믹신 B는 부유형 및 고착형 캔디다에 대해 효과적이지 않았다.
아스퍼길루스 푸미가투스의 MIC는 플레이트 판독기에 의한 분석을 부정확하게 하는 96 웰 미세적정 플레이트에서의 아스퍼길루스 세포 응집(clumping)으로 인해 얻을 수 없었다. MFC 값(로스 벤갈 아가상에 100 ㎕의 웰 내용물을 스팟 플레이팅하여 얻어짐)은 암포테리신 B, 이트라코나졸, 케토코나졸, 및 니스타틴에 대한 부유형 아스퍼길루스의 민감성을 나타낸 것이다(도 12)). 대조적으로, 어떠한 항진균제도 시험된 가장 높은 농도에서도 A. 푸미가투스 바이오필름에 대해 효과적이지 않았다.
아졸 약물은 바이오필름을 억제하지만, 매우 높은 농도에서도 바이오필름 세포를 사멸시키지 못하였다. 생존가능한 세포의 생존은 약물 치료 후에 바람직한 결과를 나타내지 않으며, 캔디다의 아졸-내성 균주의 증가에 기여할 수 있다(8). 이러한 약물로의 바이오필름 제거 실패는 이들이 활동적으로 세포에 의해 흡수된다는 것을 예상할 수 있다. 이러한 바이오필름 유기체에 의한 엑소폴리사카라이드의 억제 또는 약물 흡수의 감소율은 약물이 이의 표적 효소에 도달하는 것을 억제할 수 있다. 캔디다 종에 대한 8 ㎍/ml 이하의 플루코나졸 MIC는 캔디다 종이 약물에 대해 민감하다는 것을 시사한다(16). 시험된 C. 알비칸스 및 C. 트로피칼리스(C. tropicalis) 균주는 이러한 기준에 따라 플루코나졸에 대해 민감한 것으로 분류될 것이다. 그러나, 플루코나졸 및 이트라코나졸의 MBEC 값(>1024 ㎍/ml)은 이러한 분리물 모두에 대해 64 ㎍/ml의 브레이크포인트를 초과하였으며, 이는 바이오필름 세포가 내성임을 나타내는 것이다. 플루코나졸 및 이트라코나졸은 이러한 임시의 브레이크포인트를 설정하기 위한 약물이지만, 동일한 경향이 케토코나졸 및 5-플루오로시토신에 대해서도 관찰되었다. 이는 아졸이 만성 캔디다증 및 이식된 장치와 관련된 캔디다증의 일부 경우를 치료하는데 종종 효과적이지 않은 이유를 설명해 줄 수 있다 (4, 5, 12).
폴리엔, 니스타틴 및 암포테리신 B는 캔디다 바이오필름의 제거에서 가장 효과적인 제제이다. 그러나, 암포테리신 B에 대한 16 ㎍/ml의 MBEC는 임상 상황하에서 달성되지 않을 수 있으며, 최대 허용가능한 인간 혈청 농도는 2 ㎍/ml이다. 세포로의 흡수를 요구하지 않고 진균의 혈장막 상에서 작용하는 폴리엔의 능력은 바이오필름 세포에 대해 시험된 약물 중에서 이들의 상대적 유효성을 설명할 수 있다.
L-리신과 같은 단백질 표면이 제공되면, 아스퍼길루스는 페그의 표면 상에 유기체화된 바이오필름을 용이하게 형성하였다. 아스퍼길루스 바이오필름의 형태학적 특징은 조직내 및 의료 장치 상에서 발생하는 것과 다르지 않다. 바이오필름이 신속하게 형성되지만, 시험된 모든 약물에 대해 여전히 내성을 갖는다. 캔디다 바이오필름과 함께, 성장률은 내성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타난다. 광범위한 엑소폴리사카라이드는 아스퍼길루스 바이오필름에서 관찰되었으며, 이는 내성에 있어서 중요할 수 있다. 침습성 폐, 공동 및 뇌 아스퍼길루스증을 위한 암포테라신 B로 치료된 환자의 초기 사망률은 각각 86%, 66% 및 99%인 것으로 보고되었다. 이러한 경우 중 54% 만이 치료 후 14일까지 임의의 반응을 나타낸다. 폴리엔이 아스퍼길루스에 대해 시험관내 효능을 나타내지만, 이들은 침습성 아스퍼길루스의 치료에 있어서 크게 전염성을 갖는다. MBEC 검정의 결과는 이러한 치료 실패를 예측할 것이다. 최근에 A. 푸미가투스의 제거를 위한 대체 화학치료제가 존재하지 않지만, 어셈블리는 앞으로 치료법을 위해 잠재적으로 개발될 수 있는 스크리닝 제제용으로 사용될 수 있다.
시험관내에서의 약물의 성공이 치료법의 성공으로 추정될 수 없지만, 시험관내에서의 약물의 실패는 치료학적 실폐를 예측할 것으로 입증된다. 이러한 연구로부터, 아졸, 5-플루오로시토신, 그리세오풀빈 및 폴리믹신 B는 바이오필름 캔디다 감염증의 치료시에 성공적이지 않을 것으로 예측되며, 폴리엔은 효과적이거나 효과적이지 않을 수 있다.
이러한 연구로부터 명확한 것은 캔디다 및 아스퍼길루스 종이 플라스틱에 접착하고, 바이오필름의 형성은 이러한 유기체가 회분 배양에서 성장한 동일한 종 보다 수배 큰 농도로 항생제에 대한 노출에 견딜 수 있도록 한다는 것이다. 이들이 바이오필름에서 성장할 수 있는 경우, 회분 배양물중의 유기체에 대한 항진균제를 특성 결정하는 것은 더이상 만족스럽지 못하다. 바이오필름 유기체의 감염증을 치료하기 위한 특정 제제의 능력을 정확하게 평가하기 위해서, 세포가 숙주 또는 천연 상태로, 즉 매우 변경된 생리 기능을 나타내고 보호성 엑소폴리사카라이드 매트릭스에 둘러싸여 있는 것으로 밝혀졌기 때문에 민감성 시험은 이러한 세포 상에서 수행되어야 한다.
실시예 11
상술된 바와 같이, 본 발명의 장치는 하나 이상의 항-바이오필름 제제로 로딩될 수 있다. 가능한 안티-바이오필름 제제의 완전하지 않은 대표적인 리스트는 하기 부류 및 부류내의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항생제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 아미노글리코시드, 예를 들어 젠타마이신, 토브라마이신, 네틸마이신, 아미카신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 네오마이신, 퀴놀론/플루오로퀴놀론, 날리딕산, 시녹사신, 노르플록사신, 시프로플록사신, 퍼플록사신, 오플록사신, 에녹사신, 플레록사신, 및 레보플록사신; 항슈도모나스, 예를 들어 카르베니실린, 카르베니실린 인다닐, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 피페라실린 세팔로스포린스, 세팔로틴, 세파프린, 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파졸린 세파만돌, 세폭시틴, 세파클로르, 세푸록심, 세포테탄, 세포라니드, 세푸록신 악세틸, 세포니시드 세포탁심, 목살락탐, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 기타 세팔로스포린, 예를 들어 세팔로리딘, 및 세프술로딘; 기타 베타-락탐; 항생제, 예를 들어 이미페넴, 아즈트레오남 베타-락타마제 억제제 클라불란산, 아우그멘틴, 술박탐; 술폰아미드, 예를 들어 술파닐라미드, 술파메톡사졸, 술파세타미드, 술파디아진, 술피속사졸, 술파시틴, 술파독신, 마페니드, p-아미노벤조산, 트리메토프림-술파메톡사졸; 비뇨기관 소독제, 예를 들어 메텐아민, 니트로푸란토인, 페나조피리딘 및 기타 나프피리딘; 페니실린, 예를 들어 페니실린 G 및 페니실린 V, 페니실리나제 내성 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 그람-네거티브에 대한 디클록사실린 페니실린/아미노 페니실린 암피실린(폴리마이신), 아목실린, 시클라실린, 바캄피실린; 테트라시클린, 예를 들어 테트라시클린, 클로르테트라시클린, 데메시클로시클린, 메타시클린, 독시시클린, 미노시클린; 기타 항생제, 예를 들어 클로람페니콜(클로르미세틴), 에리트로마이신, 린코마이신, 클린다마이신, 스펙티노마이신, 플로믹신 B(콜리스틴), 반코마이신, 바시트라신; 결핵 약물, 예를 들어 이소니아지드, 리팜핀, 에탐부톨, 피라진아미드, 에티노아미드, 아미노살리실산, 시클로세린; 항진균제, 예를 들어 암포테리신 B, 시클로스포린, 플루시토신 이미다졸 및 트리아졸 케토코나졸, 미코나자올, 이트라코나졸, 플루코나졸, 그리세오풀빈; 국소 항진균제, 예를 들어 클로트리마졸, 에코나졸, 미코나졸, 테르코나졸, 부토코나졸, 옥시코나졸, 술코나졸, 시클로피록스 올아민, 할로프로긴, 톨나프테이트, 나프티핀, 폴리엔, 암포테리신 B, 나타마이신.
실시예 12
96- 페그 리드 및 트로프를 이용한 고처리량 스크리닝( HTP )을 위한 검정
제공된 과정은 본 발명의 장치 및 방법을 이용하여 바이오필름 및 부유 박테리아에 대한 화합물의 항균 활성을 측정하기 위한 방법의 예이다.
재료 목록:
멸균 리드 및 트로프 (1)
멸균 96 웰 조직 배양 플레이트 (3)
플랫폼 진동기(경사각 대략 9°)
초음파 처리기
바늘코 집게(임의적)
공정 설명
바이오필름의 형성:
1. 혼탁도가 새로운 오버나이트 스트리크 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하여 다른 적합한 배지 또는 TSB중에서 1.0(약 3.0×108 cfu/ml)의 맥파랜드 기준에 부합하도록 유기체의 현탁액을 제조하였다. 107 cfu/ml의 초기 접종물에 대해 현탁액을 1/30으로 희석시켜 30 ml의 접종물을 제조하였다. 배양조건이 까다로운 유기체에는 브로쓰에 성장을 위한 보충 배지가 요구될 수 있다.
2. 멸균 성장 어셈블리를 개봉하였다. 22ml의 접종물을 트로프에 첨가하고, 페그 리드를 재배치하였다. 장치를 35℃, 대략 9°경사 및 분당 3 내지 4회 진동하는 진동 플랫폼상에 트로프를 진동 방향과 평행하게 하여 진동 플랫폼 상에 위치시켰다. 목표는 >105 cfu/페그의 바이오필름을 발생시키기 위한 것이며, 대개 24 시간 인큐베이션이 충분하다.
주의: 일부 진동기는 경사각이 너무 크거나 플랫폼 진동이 비대칭적이기 때문에 검정용으로 적절하지 않다. 작동자는 진동기가 이러한 검정을 위한 필수적인 요구사항을 만족시키는지를 확인하기 위해 체크해야 한다.
3. 접종물의 샘플을 희석시키고 스팟 플레이팅하여 접종물의 수를 체크하고(대략 1×107 cfu/ml를 함유할 것임), 배양물 중 오염에 대해 체크하였다.
4. 멸균 대조군(임의적). 알코올 불에 쬐여진 집게를 사용하여, 박테리아가 접착되어 더 이상 돌출되지 않도록 페그 A1, B1, C1 및 D1를 뜯어내었다. 이러한 위치는 검정법을 위한 멸균 대조군으로서 제공할 것이다.
2일째: 항생제 스톡 용액:
항생제 스톡 용액을 미리 제조하여 -70℃에서 보관하였다. 탈이온수 또는 적절한 용매를 사용하여 5120 ㎍/ml의 활성제에서 스톡 용액을 제조하였다. 사용될 용매 및 희석제에 대한 상세 내용은 NCCLS 다큐먼트 M100-S8을 참조하였다. 250㎕ 분취액(2개의 시험 플레이트에 대해 충분함)에 스톡 용액을 저장하였다. 대부분의 항생제의 스톡 용액은 -70℃에서 최소 6 개월 동안 안정하다.
2일째: 항생제 시험 플레이트의 제조:
1. 96-웰 조직 배양 플레이트를 사용하여 시험 플레이트를 제조하였다. 검정에서 시험될 항생제를 지정하고 횡렬 A에서 H까지 이를 할당하였다. 이러한 플레이트 셋-업에 의해 10개의 농도의 8개의 상이한 항생제를 시험할 수 있을 것이다.
주의: MBEC 플레이트는 96-웰 플레이트(예를 들어, Nunc)에 적합하지만 모든 96-웰 플레이트가 호환되는 것은 아니다.
2. 두 횡렬에 대해 충분한 작업 용액을 제공한 800㎕의 양이온 조절된 뮬러 힌톤 브로쓰(CAMHB)에 200㎕의 5120㎍/ml 스톡을 첨가하여 1024 ㎍/ml의 작업 용액을 제조하였다. 작업 용액은 이들이 제조되는 날에 사용되어야 한다.
3. 시험 플레이트가 제조될 수 있는 방법의 예는 하기와 같다:
200㎕ CAMHB를 웰 A1, B1, C1 및 D1에 첨가하였다. 이는 멸균 대조군일 것이다.
200㎕ CAMHB를 컬럼 #2의 웰 A-H에 첨가하였다. 이는 성장 대조군일 것이다.
100㎕ CAMHB를 컬럼 4-12의 모든 웰에 첨가하였다, 이는 항생제의 작업 농도를 희석시키는데 사용될 것이다.
200㎕의 지정된 항생제의 작업 용액을 컬럼 3의 웰에 첨가하였다.
100㎕의 항생제의 작업 용액을 컬럼 4 및 5의 웰에 첨가하였다.
컬럼들 간에 팁을 바꾸어가면서 8-채널 피펫을 사용하여 희석액을 제조하였다: 웰 #5: 100㎕를 혼합하고 웰 #6에 이동시켰다; 웰 #6: 100㎕를 혼합하고 웰 #7에 이동시키고, 웰 #12까지 계속 진행하였다; 웰 #12: 100㎕를 혼합하고 폐기하였다.
100㎕의 CAMHB를 컬럼 5-12의 웰에 첨가하여 모든 웰의 부피를 200㎕가 되도록 하였다. 이러한 희석 방식은 컬럼 3에서의 1024 ㎍/ml에서 컬럼 12에서의 2 ㎍/ml로 항생제 농도를 낮아지게 할 것이다. 따라서 이러한 농도는 연구의 필요성에 적합하도록 조절될 수 있다.
바이오필름의 항생제 시험:
1. 0.9% 염수의 린스 플레이트를 준비하였다(웰 당 200㎕). 페그를 린스 플레이트에 대략 1 분 동안 위치시켜 페그로부터 부유 박테리아를 린싱하였다.
2. 바이오필름 접종물 체크(임의적): 불에 쬐여진 집게를 사용하여 페그 E1, F1, G1 및 H1을 제거하여, 희석 플레이트에서의 200㎕ 염수 중에 각각 배치시켰다. 샘플 페그 E1-H1을 5분 동안 하이(high)에서 초음파처리하여 바이오필름 박테리아를 제거한 후 10-7로 순차적으로 희석시키고 TSA(또는 적절한 매질) 상에 스팟 플레이팅하고, 하룻밤 동안 인큐베이션시켜 cfu/페그를 결정하였다.
3. 나머지 페그를 지닌 리드를 시험 플레이트로 옮기고 35℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
생존한 바이오필름 회수
1. 멸균 96-웰 미세적정 플레이트에 염수의 린스 플레이트를 준비하였다(웰 당 200㎕).
2. 또 다른 96-웰 미세적정 플레이트에 CAMHB의 회수 플레이트를 준비하였다(웰 당 200㎕).
3. 염수로 페그를 약 1분 동안 린싱하였다. 시험 플레이트를 폐기하지 않아야 한다. 페그를 회수 배지로 옮긴 후 5분 동안 강하에 초음파처리하여 생존한 바이오필름을 제거하였다. 페그 리드를 폐기하고 회수 플레이트를 덮었다. 35℃에서 20 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켜 생존한 박테리아가 혼탁도를 증대시키도록 하였다. 각 웰에 대한 생존 cfu/페그 데이타가 요망되는 경우, 초음파 처리단계 직후에 회수 플레이트의 각 웰로부터 50 ㎕를 제거할 수 있으며 희석 플레이트로 옮기고 염수에서 순차적으로 희석시키고, 적합한 배지상에서 스팟 플레이팅시켰다(100 내지 107).
부유형 MIC의 측정
1. 시험 플레이트의 웰에서 (육안으로) 또는 650 nm에서의 플레이트 판독기 상에서 혼탁도를 체크하였다.
2. 시험 인큐베이션 동안 바이오필름으로부터 발산된 부유 박테리아용 각 항생제에 대한 MIC를 측정하였다. MIC는 유기체의 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 규정된다. 투명한 웰(A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
3. 각 항생제에 대한 MIC 값을 기록하였다.
바이오필름 MBEC의 측정
1. 회수 플레이트의 혼탁도를 판독하여 각 항생제에 대한 MBEC를 측정하였다. MBEC는 회수 배지에서 바이오필름 박테리아의 재성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 규정된다. 투명한 웰(A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
2. 각 항생제에 대한 MBEC 값을 기록하였다.
실시예 13
96-웰 미세적정 플레이트를 사용한 생리학 및 유전학적(P&G) 검정
96-웰 미세적정 플레이트를 사용하여, 상이한 유기체의 다중 바이오필름 또는 동일한 유기체의 균등한 바이오필름을 형성시킬 수 있다. 바이오필름 형성 또는 항균성 시험에서 변이성을 연구하기 위하여 이러한 과정이 사용될 수 있다. 이러한 검정법은 바이오필름 포맷에서 유전적 돌연변이를 스크린하고, 박테리아의 종 또는 상이한 분리물의 MBEC 값을 비교하고, 바이오필름으로서 성장한 상이한 분리물에서 또는 상이한 분리물의 바이오필름이 요구되는 수많은 다른 포맷에서의 유전적 발현을 비교하기 위해 사용될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
하기 기술된 과정은 바이오필름으로서 성장한 다중 유기체를 단일 항균제에 대해 시험하기 위한 검정법을 기술한 것이다.
재료 목록:
멸균 리드 및 트레이
멸균 96 웰 조직 배양 플레이트(3)
선회 진탕기
초음파 처리기
바늘코 집게(임의적)
공정 설명
1일째: 바이오필름 형성:
1. 혼탁도가 새로운 오버나이트 스트리크 플레이트로부터 단일 콜로니를 사용하여 TSB 또는 다른 적절한 배지중에서 1.0의 맥파랜드 기준(대략 3.0 × 108 cfu/ml)에 부합되도록 각 유기체에 대한 현탁액(플레이트 당 최대 12개)을 준비하였다.
2. 1/30으로 희석시켜 107 cfu/ml의 접종물을 수득하였다. 지정된 컬럼에 각 유기체에 대한 출발 접종물을 시험 웰 당 150 ㎕ 위치시켰다. 컬럼을 최대 8개의 분리물을 시험하기 위하여, 성장 대조군과 및 11개의 항생제 농도 또는 12개의 분리물에 대해 1 웰, 성장 대조군 및 7개의 항생제 농도에 대해 1 웰을 갖도록 셋팅할 수 있다(하나의 컬럼은 요망되는 경우 멸균 대조군용으로 지정될 수 있다).
3. 멸균 어셈블리를 개봉하였다. 박테리아 접종물을 함유하는 96 웰 미세적정 플레이트상에 리드를 배치시켰다. 35℃ 및 대략 150 rpm의 선회 플랫폼 상에 장치를 위치시켰다. 일부 종은 보다 낮은 인큐베이션 온도 또는 상승된 CO2를 요구할 수 있다. 목표는 >105 cfu/페그의 바이오필름을 발생시키기 위한 것이며; 대개 24 시간 인큐베이션이 충분하다.
4. 접종물의 샘플을 희석시키고 스팟 플레이팅시켜 접종물 수를 체크하고(약 1×107 cfu/ml를 함유함), 배양물 중의 오염을 체크하였다.
2일째: 항생제 스톡 용액:
항생제 스톡 용액을 미리 제조하여 -70℃로 보관하였다. 탈이온수 또는 적합한 용매를 사용하여 5120 g/ml의 활성제의 스톡 용액을 제조하였다. 사용하는 용매 및 희석제에 대한 상세 내용은 NCCLS 다큐먼트 M100-S8을 참조하였다. 대부분의 항생제의 스톡 용액은 -70℃에서 최소 6개월 동안 안정하다.
2일째: 항생제 시험 플레이트의 제조:
1. 96-웰 조직 배양 플레이트를 사용하여 시험 플레이트를 준비하였다.
주의: 이러한 플레이트는 96 웰 플레이트에 적합하지만 모든 96 웰 플레이트가 호환가능한 것은 아니다.
2. 양이온 조절된 뮬러 힌톤 브로쓰(CAMHB)에서 이루어진 각 시험 항생제 농도를 미세적정 플레이트의 한 레인에서 필요한 범위에서 항생제의 2배 희석액으로 두었다(웰 당 총 200 ㎕ 부피).
2일째: 바이오필름의 항생제 시험:
1. 0.9% 염수의 린스 플레이트를 준비하였다(웰 당 200㎕). 페그를 린스 플레이트에 약 1분 동안 배치시켜 페그로부터 부유 박테리아를 린싱하였다.
2. 페그 리드를 시험 플레이트로 옮기고 35℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
3일째: 생존한 바이오필름의 회수
1. 멸균 96 웰 미세적정 플레이트에 염수의 린스 플레이트(웰 당 200㎕)를 준비하였다.
2. 다른 96 웰 미세적정 플레이트에 CAMHB의 회수 플레이트(웰 당 200㎕)를 준비하였다.
3. 염수에서 페그를 대략 1 분 동안 린싱하였다. 시험 플레이트를 폐기하지 않아야 한다. 페그를 회수 매질로 옮긴 후 5분 동안 하이에서 초음파처리하여 생존한 바이오필름을 이동시켰다. 페그 리드를 제거하고 회수 플레이트를 덮었다. 35℃에서 20 내지 24 시간 동안 인큐베이션시켜 생존한 박테리아가 혼탁도를 증가시키도록 하였다.
주의: 각 웰에 대한 생존 cfu/페그 데이타가 요구되는 경우, 초음파처리 단계 직후에 회수 플레이트의 각 웰로부터 50 ㎕를 제거하고, 희석 플레이트로 옮기고 염수에서 순차적으로 희석시키고 적절한 배지상에서 스팟 플레이팅하였다(100 내지 107).
3일째: 부유형 MIC의 측정
1. 시험 플레이트의 웰에서 (육안으로) 또는 650 nm에서의 플레이트 판독기 상에서 혼탁도를 체크하였다.
2. 시험 인큐베이션 동안 바이오필름으로부터 분산된 부유형 박테리아에 대한 각 항생제의 MIC(최소 억제 농도)를 측정하였다. MIC는 유기체의 성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 규정된다. 투명한 웰(A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
3. 각 항생제에 대한 MIC 값을 기록하였다.
4일째: 바이오필름 MBEC의 측정
1. 회수 플레이트의 혼탁도를 판독하여 각 항생제에 대한 MBEC(최소 바이오필름 제거 농도)를 측정하였다. MBEC는 회수 배질에서 바이오필름 박테리아의 재성장을 억제하는 항생제의 최소 농도로서 규정된다. 투명한 웰(A650 < 0.1)은 억제의 증거이다.
2. 각 항생제에 대한 MBEC 값을 기록하였다.
몇몇 바람직한 구체예가 기술되어 있지만, 당업자에게는 여러 변경 및 개질이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것으로 인식될 것이다. 전술된 명세서에서의 용어 및 표현은 본원에서 제한하지 않는 설명의 용어들로서 사용되었으며, 나타내고 기술된 특징 및 이의 부분의 균등물을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용이 의도되지 않으며 본 발명의 범위가 하기의 청구항에 의해서만 규정되고 제한되는 것으로서 인식된다.

Claims (20)

  1. 미생물 질병(microbial disease)를 치료하기 위한 진단 또는 감수성 선택 프로토콜(a diagnostic or susceptibility selection protocol)을 개발하는 방법으로서, 상기 프로토콜이 특정 검체에 대하여 특이적이며, 하기 단계:
    a) 검체로부터 샘플을 채취하는 단계;
    b) 바이오필름 형성 장치 내에서, 샘플 내에 미생물을 성장시켜, 바이오필름 감수성 장치 내에서 적정화된 바이오필름 샘플을 형성하는 단계;
    c) 바이오필름 감수성 장치 내에서 적정화된 바이오필름 샘플을 처리하여, 하나 이상의 적정화된 바이오필름 샘플이 하나 이상의 항-미생물 활성제(anti-microbial active agent)에 노출되게 하는 단계;
    d) 최소 억제 농도 (minimal inhibitory concentration : MIC) 값, 최소 바이오필름 박멸 농도 (minimum biofilm eradication concentration: MBEC) 값, 및 최소 살균 농도 (minimum biocidal concentration: MBC) 값을 측정함으로써, 노출된 바이오필름 샘플을 분석하는 단계;
    e) MIC, MBEC, 및 MBC 값에 기초하여 바이오필름에 대해 효과가 있는 하나 이상의 활성제를 선택하며, 상기 하나 이상의 활성제가 특정 검체에 대해 특이적인 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 검체가 사람 또는 동물인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 미생물 질병이 사람 또는 동물 질병 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 사람 또는 동물 질병이 바이오필름에 의해 매개(mediate)되는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 바이오필름이 박테리아, 진균류, 조류, 바이러스 또는 기생충으로부터 형성되거나; 형성되는 바이오필름 내에 혼입되는 미생물로부터 형성되거나; 또는 이들의 혼합 형태로 부터 형성되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 최적 성장 조건을 설정하는 것(establishing optimum growing condition)이 적어도 하나의 특정 미생물에 대하여 성장 조건을 맞추는 것(tailoring growing condition)을 포함하며, 상기 조건이 기질의 표면 조성, 기질에 대한 셀 부착 촉진, 록킹 또는 오비탈 모션의 속도, 온도, 배양 시간, 접종원(inoculum) 크기, 성장 매질, 오염의 감소, 및 비대칭 성장 패턴에 대한 바이오필름 성장 평가를 포함하는 하나 이상의 군을 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 미생물을 성장시키는 것이 호스트 물질을 함유하는 성장 매질 내에서 미생물을 성장시키는 것을 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 감수성 시험을 위한 최적 조건을 설정하는 것이, 적어도 하나의 특정 미생물에 대하여 감수성 시험 조건을 맞추는 것을 포함하며, 상기 조건이, 상기 조건이 평균 셀 카운트, 노출 시간, 회수 매질, 재생가능한 셀 밀도, 헹굼 매질, 적정 고주파 분해 시간, 및 적정 고주파 분해 시간을 포함하는 하나 이상의 군을 포함하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 바이오필름을 하나 이상의 활성제에 노출하는 것이, 미생물에 대해 가능한 활성도를 위해 특별히 선택된 활성제 패널에 바이오필름을 노출하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 활성제 패널이 단일 활성제 또는 적어도 하나의 제2 활성제와의 조합으로 되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 시험되는 활성제의 농도가 혈청 MIC 중지점(breakpoint) 레벨인 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 조합 내의 각 활성제 량이, 활성제 조합에 대한 혈청 MIC 중지점 레벨인 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 미생물이 적어도 하나의 그램 네가티브 박테리아 및 이들의 조합 또는 혼합물; 적어도 하나의 그램 포지티브 박테리아 및 이들의 조합 또는 혼합물; 그램 포지티브 박테리아 및 그램 네가티브 박테리아의 조합 또는 혼합물; 및 적어도 하나의 균류로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 미생물이 슈도모나스 spp.(Pseudomonas spp.), 스타필로코커스 spp. (Staphylococcus spp.), 캔디다 spp. (Candida spp.) 및 애스퍼길루스 spp. (Aspergilus spp.) 및, 이들의 혼합물 또는 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 미생물 유전자 시프트, 항생제 내성, 유전자 변이, 또는 이들의 조합을 감정하기 위하여, MIC, MBEC, 및 MBC 값을 이용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 항-미생물 제제가 동결, 리요필리제이션(lyophilization), 동결-건조 또는 진공-건조되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 동결, 리요필리제이션, 동결-건조 또는 진공-건조된 제제가 재-수화(re-hydrated)되는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 활성 제제를 선택하는 것이 미생물에 대해 특이한 약제학적 조성물을 개발하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 활성 제제를 선택하는 것이 검체에 대해 특이한 약제학적 조성물을 개발하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 바이오필름 감수성 장치가, 특정 미생물에 대해 공지의 효능을 위해 각각 선택되는 활성제 패널 또는 라이브러리를 포함하는 방법.
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