CN105769874B - 含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法 - Google Patents

含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法。所述兽用混悬液，是将活性成分分散于分散媒中形成的混悬液；所述活性成分为头孢噻呋和黄芩素。每100mL所述混悬液的组成如下：2.5g～10g所述头孢噻呋；2.5g～10g所述黄芩素；余量的所述分散媒。本发明含头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液采用油性溶剂作为制剂的分散媒，并且在油状混悬液中，药物释放缓慢，对于时间依赖性抗生素而言，延长了T>MIC，即延长了有效作用时间，每24h给一次，节省人力物力。本发明含头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液是采用分散法将头孢噻呋、头孢噻呋分散于分散媒中，并加入助悬剂、润湿剂和抗氧剂，利用胶体磨研磨而得，生产工艺简单，降低成本，易于实现产业化。

Description

含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法，属于畜牧药物制剂领域。。
背景技术
金黄色葡萄球菌是重要的人畜共患病的传染源，可引起肺炎、心包炎、骨髓炎以及心内膜炎、败血症等危及生命的疾病。自1961年，英国的Jevons首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus，MRSA)，至今MRSA几乎遍及全世界，已成为院内感染的重要病原菌之一。MRSA具有多重耐药特征，临床分离的90％以上的MRSA菌株都是多重耐药菌株，常表现为对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、林可胺类等多种抗生素同时耐药，且日趋严重。近十年来，世界各地MRSA感染率不断上升，已经成为临床上抗细菌治疗的一大难题。1972年，首次在奶牛乳房炎的样品中分离到了动物源MRSA，随后在家畜、宠物(猪、狗、马、羊、兔、鸡)上分别分离得到，近年来，我国畜牧业集约化和规模化养殖的程度逐渐提高，抗菌药物大量使用，使动物源细菌耐药性水平迅速提高。目前在猪上MRSA的分离率为30～40％，且有不断升高的趋势，而MRSA的出现及流行不仅给动物细菌性疾病的治疗和畜牧业的发展带来不利的影响，而且耐药细菌及耐药性能通过食物链和移动耐药遗传原件传递给人类，威胁公共卫生安全。
头孢噻呋是兽医专用第三代头孢类抗菌素，是第一个动物专用的头孢类抗生素，在治疗畜禽疾病意义重大，头孢噻呋具有抗菌谱广、抗菌活性强等特点，且具有稳定的β-内酰胺环，对于各种能产生β-内酰胺酶的细菌具有良好的杀菌作用，用于治疗畜禽的呼吸道疾病。而头孢噻呋对MRSA菌株的敏感性较低，导致头孢噻呋对由MRSA感染引起的疾病治疗失败。
在人医上使用万古霉素、利奈唑胺等药物治疗MRSA感染，而动物上则无专门的治疗药物。申请号为201310442452.0的中国专利报道了一种药物ZCHH片剂的制备方法及ZCHH与抗生素合用逆转MRSA耐药性的方法；申请号为20058005246.2的中国专利报道了没食子酰化儿茶素和非没食子酰化儿茶素具有增强MRSA对各类抗生素(β-内酰胺类抗生素、四环素类抗生素和氯霉素类抗生素)的敏感性。但国内外尚未见针对治疗动物源MRSA复方药物的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种含头孢噻呋和黄芩素的兽用混悬液及其制备方法，用于治疗由MRSA引起的猪肺炎等疾病；本发明采用体外药效学证明了黄芩素具有增强头孢噻呋对MRSA的抗菌效应，提供的头孢噻呋与黄芩素复方混悬剂，为临床上由MRSA感染引起的猪病提供制剂，且联合用药将缩小耐药突变选择窗(MSW)，有助于减少耐药细菌的产生。
本发明所提供的一种兽用混悬液，是将活性成分分散于分散媒中形成的混悬液；
所述活性成分为头孢噻呋和黄芩素。
上述的兽用混悬液中，每100mL所述混悬液的组成如下：
2.5g～10g所述头孢噻呋；
2.5g～10g所述黄芩素；
余量的所述分散媒。
上述的兽用混悬液中，每100mL所述混悬液的组成具体可为下述1)-3)中任一种：
1)2.5g～5g所述头孢噻呋；
2.5g～5g所述黄芩素；
余量的所述分散媒；
2)2.5g～7.5g所述头孢噻呋；
2.5g～7.5g所述黄芩素；
余量的所述分散媒；
3)7.5g～10g所述头孢噻呋；
7.5g～10g所述黄芩素；
余量的所述分散媒。
上述的兽用混悬液中，所述兽用混悬液具体可为由所述活性成分、助悬剂、润湿剂和抗氧化剂分散于所述分散媒中形成的混悬液。
上述的兽用混悬液中，所述分散媒可选自大豆油(供注射用)、油酸乙酯、三乙酸甘油酯和肉豆蔻酸异丙脂中的一种或两种；
所述助悬剂可选自单硬脂酸铝、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、蜂蜡和氢化蓖麻油中的一种或两种；
所述润湿剂可选自吐温-80、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种；
所述抗氧剂选自维生素E、叔丁基羟基茴香醚和没食子酸丙脂中的一种；
每100mL所述混悬液的组成如下：
2.5g～10g所述头孢噻呋；
2.5g～10g所述黄芩素；
0.1g～2g所述助悬剂；
0.2g～2g所述润湿剂；
0.01g～1g所述抗氧化剂；
余量的所述分散媒。
本发明提供的兽用混悬液具体可为下述1)-9)中任一种：
1)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
2.5g所述头孢噻呋；2.5g所述黄芩素；
1.5g氢化蓖麻油；1g司盘-80；0.05g维生素E；余量的大豆油(供注射用)；
2)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
5g所述头孢噻呋；5g所述黄芩素；
0.1g氢化蓖麻油；0.5g司盘-80；0.05g维生素E；余量的大豆油(供注射用)；
3)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
5g所述头孢噻呋；5g所述黄芩素；
0.2g氢化蓖麻油；2g吐温-80；0.1g没食子酸丙酯；余量的三乙酸甘油酯；
4)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
5g所述头孢噻呋；5g所述黄芩素；
0.13g氢化蓖麻油；1.5g吐温-80；0.1g没食子酸丙酯；余量的三乙酸甘油酯和大豆油(供注射用)；
5)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g所述头孢噻呋；7.5g所述黄芩素；
1g蜂蜡；1g卵磷脂；0.1g吐温-80；0.1g叔丁基羟基茴香醚；余量的三乙酸甘油酯；
6)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g所述头孢噻呋；7.5g所述黄芩素；
0.7g蜂蜡；0.7g卵磷脂；0.5g司盘-80；0.1g维生素E；余量的油酸乙酯和大豆油(供注射用)；
7)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g所述头孢噻呋；7.5g所述黄芩素；
1g聚乙烯吡咯烷酮；1g环氧乙烯-40氢化蓖麻油；0.1g维生素E；余量的三乙酸甘油酯和大豆油(供注射用)；
8)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
10g所述头孢噻呋；10g所述黄芩素；
1.5g氢化蓖麻油；0.5g司盘-80；0.1g维生素E；余量的肉豆蔻酸异丙酯；
9)每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
10g所述头孢噻呋；10g所述黄芩素；
0.5g氢化蓖麻油；0.5g蜂蜡；1g环氧乙烯-40氢化蓖麻油；0.1g叔丁基羟基茴香醚；余量的三乙酸甘油酯。
本发明进一步提供了所述兽用混悬液的制备方法，包括如下(1)或(2)的步骤：
(1)将所述头孢噻呋和所述黄芩素先后加入至所述分散媒中进行研磨，即得所述混悬液；
(2)
1)将所述助悬剂和所述抗氧化剂加入部分的所述分散媒中，并使之溶解，得到液体A；
2)将所述头孢噻呋、所述润湿剂和所述液体A先后加入部分的所述分散媒中进行研磨；
3)继续向步骤2)的体系中加入所述黄芩素，并利用所述分散媒进行定容，经研磨即得所述混悬液。
上述的制备方法中，步骤(1)和步骤(2)2)和3)中所述研磨均在胶体磨中进行；
步骤(2)2)中，所述分散媒的体积加入量不小于其总量的80％，如80％。
步骤(2)2)中，加入所述头孢噻呋之后研磨5～10min，具体可为5min，加入所述润湿剂和所述液体A之后研磨15～20min，具体可为15min。
步骤(2)3)中，定容完毕后继续研磨15～30min左右。
本发明提供的兽用混悬液能够用于防治猪肺炎等疾病。
所述猪肺炎由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起。
所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具体可为猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。
本发明同时提供了一种防治猪肺炎的产品或金黄色葡糖球菌生长抑制剂，其活性成分为所述兽用混悬液；
所述猪肺炎由所述金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus)引起；
所述金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus)为猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。
本发明提供的头孢噻呋黄芩素复方混悬液，为黄色油状混悬剂，药物粒径分布均匀，粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，满足混悬剂的要求。
本发明具有如下优点：
1)黄芩素具有增强头孢噻呋对MRSA敏感性的特性，联合使用具有明显的协同抗菌作用；另外，黄芩素还具有解热、抗炎和抗过敏等作用，畜牧业上由MRSA感染引起的疾病提供治疗的制剂。
2)黄芩素与头孢噻呋联用能降低金黄色葡萄球菌耐药的发生率，缓解当前的金黄色葡萄球菌的耐药问题。
3)本发明含头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液采用油性溶剂作为制剂的分散媒，并且在油状混悬液中，药物释放缓慢，对于时间依赖性抗生素而言，延长了T>MIC，即延长了有效作用时间，每24h给一次，节省人力物力。
4)本发明含头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液是采用分散法将头孢噻呋、头孢噻呋分散于分散媒中，并加入助悬剂、润湿剂和抗氧剂，利用胶体磨研磨而得，生产工艺简单，降低成本，易于实现产业化。
附图说明
图1为本发明实施例10中头孢噻呋与黄芩素单用及联合应用的时间-杀菌曲线
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油加至0.5L的大豆油中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L大豆油倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入司盘-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素和维生素E，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例2、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油加至0.5L的大豆油中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L大豆油倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入司盘-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素和维生素E，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例3、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油、没食子酸丙酯加至0.5L的三乙酸甘油酯中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L三乙酸甘油酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入吐温-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例4、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油、没食子酸丙酯加至0.5L的大豆油中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取4L大豆油和4L三乙酸甘油酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入吐温-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例5、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的蜂蜡、卵磷脂和叔丁基羟基茴香醚加至0.5L的三乙酸甘油酯中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L三乙酸甘油酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入吐温-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素，加三乙酸甘油酯至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例6、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的蜂蜡和卵磷脂加至0.5L的大豆油中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取4L大豆油和4L油酸乙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入司盘-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素和维生素E，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例7、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的聚乙烯吡咯烷酮加至0.5L的大豆油中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取4L大豆油和4L三乙酸甘油酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入环氧乙烯-40氢化蓖麻油和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素和维生素E，加大豆油至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例8、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油加至0.5L的肉豆蔻酸异丙酯中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L肉豆蔻酸异丙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入司盘-80和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素和维生素E，加肉豆蔻酸异丙酯至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度：粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，结果符合要求，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本实施例的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例9、制备含有头孢噻呋黄芩素的复方混悬液
其配方如下：
具体制备方法如下：
1)取配方量的氢化蓖麻油蜂蜡和叔丁基羟基茴香醚加至0.5L的三乙酸甘油酯中，加热搅拌使其完全溶解得到A液，备用；
2)取8L肉豆蔻酸异丙酯倒入胶体磨中，启动胶体磨，缓慢加入处方量的头孢噻呋，研磨约5min，缓慢加入环氧乙烯-40氢化蓖麻油和A液，继续研磨约15min。
3)缓慢加入处方量的黄芩素，加三乙酸甘油酯至10L，继续研磨15min。
4)检查颗粒细度，粒径15μm以下的颗粒不少于90％，20μm以下的颗粒不少于95％，无超过50μm的颗粒，停止研磨，混匀，灌装，密封，灭菌，得到本发明的含有头孢噻呋黄芩素的兽用混悬液。
实施例10、头孢噻呋与黄芩素联合对金黄色葡萄球菌的抑菌及杀菌作用
本发明为了研究头孢噻呋与黄芩素联合应用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的疗效，本发明以猪源MRSA临床菌株为研究对象，进行了两种药的体外联合抗菌试验。
一、材料与仪器
1、供试药品
盐酸头孢噻呋(Cef)对照品，含量为86.3％，中国兽药监察所；黄芩素(B)，含量为97.8％，批号111595-201306，中国食品药品检定研究院。
2、受试菌株
分离菌株：猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)20株；质控菌株：MRSA标准菌株ATCC33591和金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213，均购自中国兽药监察所。
3、培养基
MH肉汤培养基，批号20071102，MH琼脂培养基，批号20071103，北京奥博星生物技术责任有限公司，BHI肉汤和BHI琼脂购自北京陆桥技术有限责任公司，科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基，郑州市博赛生物技术股份有限公司。
4、主要仪器
(1)微量棋盘稀释法联合药敏试验板：天津金章科技开发有限公司。
(2)连续微量加样器、八道微量加样器：美国Eppendorf公司。
(3)超净工作台，苏州净化设备有限公司
(4)自动式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂
(5)台式空气恒温摇床，北京北方同生物技术发展公司
二、试验方法
1、药物原液的配制及保存
头孢噻呋原液：用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)将头孢噻呋配成浓度为5120μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至2mL离心管中，置-80℃冰箱中保存，待用。
黄芩素原液：用DMSO(二甲基亚砜)配成5120μg/mL的药物原液，用高压灭菌过的0.2μm孔径滤头过滤，分装至2mL离心管中，置-20℃冰箱中保存，待用。
2、菌液的制备
2.1金葡球菌菌液的制备
用无菌接种环蘸取少量甘油菌，划线于科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基上，置于35℃中培养24h，挑取桃红色、边缘光滑的菌落于MH肉汤培养液中，在35℃培养18h，待用。
3、最小抑菌浓度(MIC)的测定
3.1头孢噻呋对金黄色葡萄球菌的MIC试验
根据美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的肉汤微量稀释法，测定头孢噻呋和黄芩素对39株金黄色葡萄球菌的单药MIC和联合MIC。
在96孔板中，用MH肉汤将黄芩素和头孢噻呋依次倍比稀释256-0.5μg/mL，每孔50μL，用MH肉汤将每个测试菌株稀释呈105CFU/mL,在每孔前10孔加入菌液50μL，第11孔加入空白MH肉汤作为阴性对照，第12孔加入50μL菌液作为阳性对照。每种药物做2个平行，每次试验，均须添加ATCC 29213和ATCC 33591作为质控菌。35℃培养24h后，按照CLSI要求读取结果，以没有肉眼可见的细菌生长的最低抗菌药物浓度作为该药的MIC。
3.2联合药敏试验
采用微量棋盘稀释法测定头孢噻呋与黄芩素的协同抗菌作用。根据单药的MIC结果，将头孢噻呋稀释成6个不同的工作浓度，按照棋盘法设计，将两药先后分别加入到96孔板的每个孔中，每孔中每种抗菌药物取50μL，使各孔中的每种药物最终浓度分别为其单药的1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC，并分别设两药的单药对照、细菌生长对照和空白对照。再将106CFU/mL的菌液100μL加入各孔中，使各孔中细菌的终浓度为5×105CFU/mL，35℃培养24h，观察并记录结果。每菌株重复棋盘试验3次。通过计算部分抑菌浓度指数(FIC)判断联合抗菌作用，其计算公式如下：
FIC指数≤0.5，协同作用；>0.5～1，相加作用；>1～2，无关作用；>2，拮抗作用。
4、最小杀菌浓度(MBC)的测定
以ATCC 33591为研究对象，基于单独及联合药物药敏试验，取最小抑菌浓度及前面3孔的100μL培养液，接种于空白琼脂培养皿，至于35℃培养24h，以菌落数＜5个时药物的最低浓度为MBC。
5、时间杀菌曲线的测定
以ATCC 33591为研究对象，绘制头孢噻呋与黄芩素单用和联用的时间杀菌曲线，进一步验证两者联合应用的协同效果。
用无菌棉签蘸取平皿上少量菌体置于2mL的无菌生理盐水中，用麦氏比浊仪调制麦氏比浊为0.5，即制成约含有1.5×108CFU/mL的菌悬液，取100μL加入2.9mL含有不同药物浓度的肉汤中，菌悬液约含有5×105CFU/mL，置于35℃恒温200rpm摇床中培养。分别于0、4、8、12、24h取100μL，用无菌PBS液进行不同倍数稀释，接种于琼脂培养皿上，置于35℃恒温培养箱培养24h后进行菌落计数，以时间为横坐标，以Log10CFU/mL为纵坐标做曲线。
三、试验结果
1、最小抑菌浓度(MIC)
头孢噻呋与黄芩素单用及联用时对猪源MRSA和PRSA的体外药敏试验结果如表1中所示。
表1头孢噻呋单用及与黄芩素联用对MRSA的MIC测定
注：Cef：头孢噻呋；B：黄芩素；MIC：最小抑菌浓度；MIC50：能抑制50％受试菌所需的MIC；FICI：联合抗菌指数；黄芩素对上述所有菌的MIC均为128μg/mL。
根据联合药敏试验可知，头孢噻呋对MRSA临床菌株均MIC≥4μg/mL，与16μg/mL的黄芩素(1/8MIC)对标准质控菌株ATCC 33591的MIC由128μg/mL降至2μg/mL，而两者联用后，临床MRSA菌株对头孢噻呋的MIC为单药时的1/32-1/2，MIC值明显下降，其联合抗药指数0.38-0.14，小于0.5，说明两者之间具有很好的协同作用。而与黄芩素联用后，对标准质控菌株ATCC 29213的MIC由0.25μg/mL降至0.125μg/mL，呈现相加作用。
分别与32、16、8μg/mL的黄芩素联用后，临床金黄色葡萄球菌菌株的MIC50由64μg/mL均降至4μg/mL，CLSI规定将4μg/mL定为头孢噻呋对金黄色葡萄球菌的敏感折点(即MIC大于4μg/mL的菌为耐药，小于4μg/mL为敏感)，由实验结果可知，与黄芩素联用后，部分耐药菌株恢复了对头孢噻呋敏感性。
由以上结果可知，头孢噻呋与黄芩素联合用后对临床猪源MRSA菌株呈现明显的协同作用。
2、最小杀菌浓度(MBC)
头孢噻呋与黄芩素单用及联用时对ATCC 33591的MBC结果如表2所示。
表2头孢噻呋与黄芩素单用及联合应用的MBC测定结果
单药及联合药物 MBC(ug/ml)
Cef 512
B 256
Cef+B(128ug/ml) <2
Cef+B(64ug/ml) 16
Cef+B(32ug/ml) 16
Cef+B(16ug/ml) 32
Cef+B(8ug/ml) 32
Cef+B(4ug/ml) 64
注：Cef：头孢噻呋；B：黄芩素。
3.3时间—杀菌曲线
头孢噻呋与黄芩素单用及联用时对ATCC 33591的时间杀菌曲线如图1所示。由图1可以看出，单独使用头孢噻呋或者黄芩素时，细菌浓度随着时间增加而增多，但两者联合后，在4h即可看见细菌数量的减少，并且随着时间增加，细菌数量显著减少，32μg/mL的头孢噻呋与64μg/mL的黄芩素联合作用至24h细菌全部死亡，与单独使用头孢噻呋(32μg/mL)和黄芩素(64μg/mL)分别降低了约1011CFU/mL和109CFU/mL，说明黄芩素与头孢噻呋联用对ATCC 33591具有明显的协同杀菌作用。
四、结论
由MIC、MBC的测定及时间—杀菌曲线结果，说明将头孢噻呋与黄芩素对临床猪源MRSA呈现明显的协同作用，黄芩素具有增强头孢噻呋对MRSA的敏感性，甚至具有逆转MRSA对头孢噻呋耐药的趋势，为临床上两者的联用提供理论依据。
实施例11、头孢噻呋/黄芩素复方混悬剂的质量考察
质量考察主要包括本制剂的性状、沉降体积比、颗粒细度、重分散性和主要成分阿莫西林、黄芩素的含量。
一、材料与仪器
1、药品
盐酸头孢噻呋(Cef)对照品，含量为86.3％，中国兽药监察所；黄芩素(B)，含量为97.8％，批号111595-201306，中国食品药品检定研究院。中试产品含头孢噻呋5％，黄芩素5％，共三批(由北京中农大动物保健集团湘潭兽药厂生产)。
2、主要仪器
(1)Waters 2695HPLC色谱仪，配备PDA紫外检测器：美国Waters公司
(2)激光粒度测定仪：英国马尔文公司
二、试验方法
1、沉降体积比
按兽药典要求方法，取样品置于50ml具塞量筒内，密塞，用力振摇1min，记下混悬液的原始高度H0，静置3h后，记下混悬液的最终高度H，按公式沉降体积比F＝H/H0，计算其沉降体积比F。
2、重分散性
取样品置于100ml具塞量筒内，密塞，防止沉降24h，将量筒倒置后再翻正过来(一反一正算一次，翻动时用力均匀)，观察量筒底部的沉降物是否消失。以量筒底部的沉降物消失所需翻动的次数为评价指标，翻动次数越少越好，表明重分散性越好。
3、粒径测定
取少量混悬液样品，以肉豆蔻酸异丙酯为分散剂稀释后置于激光粒度测定仪中进行测定。测定条件为：样品池：静态；样品折射率：1.48；介质折射率：1.33；遮光比：0.1％；截断下、上限分别为：0.05和300.00。
4、含量测定
4.1HPLC检测制剂中CEF的含量
4.1.1色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钾溶液调节pH至5.0)-乙腈(97.5:2.5)为流动相；检测波长为254nm。
4.1.2提取方法
精密量取摇匀后的供试品适量(约相当于头孢噻呋50mg)，置于100ml容量瓶中，加甲醇15ml，超声15min，取出，加甲醇稀释至刻度，摇匀，样品稀释10倍后，滤过，取滤液20μL进行检测；另取头孢噻呋对照品50mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，同法测定。
4.2HPLC检测制剂中B的含量
4.2.1色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.3％甲酸水：乙腈(55:45)为流动相，检测波长为276nm。
4.2.2提取方法
精密量取摇匀后的供试品适量(约相当于黄芩素50mg)，置于100ml容量瓶中，加甲醇15ml，超声15min，取出，加甲醇稀释至刻度，摇匀，样品稀释10倍后，滤过，取滤液20μL进行检测；另取黄芩素对照品50mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，同法测定。
三、试验结果
三批中试产品(20150408、20150409、20150410)的外观、沉降比、重分散性、粒径和含量等结果如表3中所示，各项指标均符合中国兽药典(2010版)混悬液的要求。
表3本发明含头孢噻呋和黄芩素的混悬液的各指标
注：Cef：头孢噻呋；B：黄芩素。
四、结论
本发明提供的头孢噻呋/黄芩素的复方混悬剂的沉降比、重分散性、粒径等指标符合中国兽药典要求，可用于动物注射。

Claims (4)

1.一种兽用混悬液，为由活性成分、助悬剂、润湿剂和抗氧化剂分散于分散媒中形成的混悬液；
所述活性成分为头孢噻呋和黄芩素；
所述分散媒选自大豆油、油酸乙酯、三乙酸甘油酯和肉豆蔻酸异丙酯中的一种或两种；
所述助悬剂为卵磷脂与蜂蜡的混合物、氢化蓖麻油与蜂蜡的混合物、聚乙烯吡咯烷酮或氢化蓖麻油；
所述润湿剂选自吐温-80、司盘-80和环氧乙烯-40-氢化蓖麻油中的一种；
所述抗氧剂选自维生素E、硫脲、叔丁基羟基茴香醚、偏重亚硫酸钠和没食子酸丙酯中的一种；
所述兽用混悬液为下述1）-5）中任一种：
1）每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g 所述头孢噻呋；7.5g 所述黄芩素；
1g 蜂蜡；1g 卵磷脂；0.1g 吐温-80；0.1g叔丁基羟基茴香醚；余量的三乙酸甘油酯；
2）每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g 所述头孢噻呋；7.5g 所述黄芩素；
0.7g 蜂蜡；0.7g 卵磷脂；0.5g 司盘-80；0.1g维生素E；余量的油酸乙酯和大豆油；
3）每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
7.5g 所述头孢噻呋；7.5g 所述黄芩素；
1g聚乙烯吡咯烷酮；1g环氧乙烯-40氢化蓖麻油；0.1g维生素E；余量的三乙酸甘油酯和大豆油；
4）每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
10g 所述头孢噻呋；10g 所述黄芩素；
1.5g氢化蓖麻油；0.5g 司盘-80；0.1g维生素E；余量的肉豆蔻酸异丙酯；
5）每100mL所述兽用混悬液的组成如下：
10g 所述头孢噻呋；10g 所述黄芩素；
0.5g氢化蓖麻油；0.5g 蜂蜡；1g 环氧乙烯-40氢化蓖麻油；0.1g叔丁基羟基茴香醚；余量的三乙酸甘油酯。
2.权利要求1所述兽用混悬液的制备方法，包括如下步骤：
1）将所述助悬剂和所述抗氧化剂加入部分的所述分散媒中，并使之溶解，得到液体A；
2）将所述头孢噻呋、所述润湿剂和所述液体A先后加入部分的所述分散媒中进行研磨；
3）继续向步骤2）的体系中加入所述黄芩素，并利用所述分散媒进行定容，经研磨即得所述混悬液。
3.权利要求1所述兽用混悬液在制备防治猪肺炎的产品中的应用；
所述应用表现为抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生长；
所述金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）。
4.一种防治猪肺炎的产品或金黄色葡糖球菌生长抑制剂，其活性成分为权利要求1所述兽用混悬液；
所述猪肺炎由所述金黄色葡糖球菌（Staphylococcus aureus）引起；
所述金黄色葡糖球菌（Staphylococcus aureus）为猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）。
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