CN103911423A

CN103911423A - 一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103911423A
Application number: CN201410103880.5A
Authority: CN
Inventors: 李钢; 邹辉琴; 温静
Original assignee: Rota Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Rota Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-03-20
Also published as: CN103911423B

Abstract

本发明公开了一种琼脂溶液，它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2～3%（w/v），强碱的浓度不低于0.8mol/L。本发明还提供了包含前述琼脂溶液的检测试剂盒，以及该试剂盒的检测方法。采用本发明试剂盒检测抗菌肽活性，检测结果准确可靠，对实验条件的要求低，操作简便，普通人即可使用，实用性强。

Description

一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽活性检测试剂盒及检测方法。

背景技术

抗菌肽的活性检测通常采用管碟法，管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和待检品两者对指示菌的抑菌圈大小来测定待检品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置牛津杯，杯内放入标准品和待检品的溶液，经16～18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈直径大小与抗生素效价相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。

使用管碟法进行检测时，需要制备新鲜的琼脂溶液，即将琼脂粉加热至95℃以上制成琼脂溶液，灭菌后，降低温度，在适当温度下加入指示菌进行检测。然而，对于试验条件比较差或者完全没有实验操作能力的人员来说，难以有效灭菌，同时，因凝胶溶液降温至40℃以下时形成凝胶，而大部分细菌生长繁殖的适宜温度通常为20～40℃，若在40℃以下加入指示菌，则指示菌与凝胶状的琼脂不能有效混匀，导致指示菌分布不均，致使检测结果不准确，若在40℃以上加入指示菌，将导致指示菌难以有效生长，降低检测效率或者导致检测失败。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的琼脂溶液，以及包含该琼脂溶液的抗菌肽活性检测试剂盒。

本发明琼脂溶液，它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2～3%（w/v），强碱的浓度不低于0.8mol/L。

w/v，即g/ml。

强碱，溶于水能发生完全电离的碱，如，氢氧化钠、氢氧化钾、。

其中，所述琼脂的浓度为3%（w/v）。

其中，所述强碱为氢氧化钠，浓度不低于1.0mol/L。

其中，所述强碱为氢氧化钾，浓度为0.8～1.0mol/L。

本发明还提供了一种制备前述琼脂溶液的方法，步骤如下：按照前述配比取原料，混匀，灭菌，即可。

本发明抗菌活性检测试剂盒，可用于检测品（如，抗菌肽）的抗菌活性，它包括如下组分：

指示菌；

营养液：指示菌的液体培养基；

基质液：前述琼脂溶液；

稀释液：强酸溶液。

强酸，溶于水能发生完全电离的酸，如，磷酸、盐酸或者硝酸、硫酸。

其中，所述指示菌中，活菌数为10⁷～10⁸个/g。

其中，所述指示菌为大肠杆菌时，营养液是LB液体培养基。

LB液体培养基，大肠杆菌常用的培养基，其制备方法：取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast extract)5g、氯化钠(NaCl)10g，定容至1L，调pH7.0，121℃灭菌15分钟，即得。

优选地，所述强酸溶液是磷酸溶液、盐酸溶液或者硝酸溶液。

优选地，所述强酸溶液的浓度为0.3～0.4mol/L。

本发明使用前述试剂盒检测样品（如，抗菌肽）的抗菌活性的方法，包括如下步骤：

（1）取待检样品，制成样品溶液；

（2）取指示菌，加入营养液，制成菌悬液；

（3）在温度大于等于20℃的条件下，往基质液中加入稀释液至溶液pH为5-7，再加入步骤（2）的菌悬液，混匀，倒入培养皿中；

（4）待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤（1）制备的样品溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。

本发明琼脂溶液pH值高，不易染菌，可以长时间放置，用于抗菌肽检测时，无需灭菌，对实验条件和实验者操作技巧的要求低，同时，其在温度为20℃时，即呈液态，在较低温度（20℃）下加入指示菌也可以充分混匀，能够在保证指示菌与琼脂溶液混匀的同时维持指示菌的正常生长。采用本发明试剂盒检测抗菌肽活性，无需配制新鲜琼脂溶液，对实验条件的要求低，操作简便，普通人即可使用，实用性强，检测结果准确可靠，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明检测方法可靠性的结果图

具体实施方式

实施例1本发明琼脂溶液的制备

取琼脂粉，制成浓度为2%（g/ml）的琼脂溶液，加入氢氧化钾至浓度为0.8mol/L，混匀，灭菌，即可。

实施例2本发明琼脂溶液的制备

取琼脂粉，制成浓度为2%（g/ml）的琼脂溶液，加入氢氧化钠至浓度为1mol/L，混匀，灭菌，即可。

实施例3本发明琼脂溶液的制备

取琼脂粉，制成浓度为3%（g/ml）的琼脂溶液，加入氢氧化钾、氢氧化钠至浓度分别为0.8mol/L和1mol/L，混匀，灭菌，即可。

实施例4本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法

1、检测试剂盒的组成

指示菌：活菌数为10⁷～10⁸个/g大肠杆菌制剂。

营养液：指示菌的液体培养基，如，LB液体培养基，制备方法：将胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast extract)5g、氯化钠(NaCl)10g，定容至1L，调pH7.0，121℃灭菌15分钟。

基质液：实施例1的琼脂溶液；

稀释液：硝酸溶液，浓度为0.4mol/L。

2、检测方法

（1）取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；

（2）取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；

（4）待培养皿中的溶液凝固后，倒置培养，放入牛津杯，在牛津杯中加入步骤（1）制备的抗菌肽溶液，培养，观察抑菌圈大小，即可。

实施例5本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法

1、检测试剂盒的组成

指示菌：活菌数为10⁷～10⁸个/g大肠杆菌制剂。

营养液：指示菌的液体培养基，如，牛肉膏蛋白胨培养基，制备方法：取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，定容至1L，调pH7.4～7.6，121℃灭菌15分钟。

基质液：实施例2的琼脂溶液；

稀释液：磷酸溶液，浓度为0.3mol/L。

2、检测方法

（1）取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；

（2）取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；

实施例6本发明抗菌肽检测试剂盒的组成及检测方法

1、检测试剂盒的组成

指示菌：活菌数为107～108个/g大肠杆菌制剂。

基质液：实施例3的琼脂溶液；

稀释液：盐酸溶液，浓度为0.4mol/L。

2、检测方法

（1）取待检抗菌肽，制成抗菌肽溶液；

（2）取菌制剂，加入营养液，制成菌悬液；

实施例7本发明试剂盒中的基质液（琼脂溶液）的组成筛选试验

一、强碱的种类和用量选择

1、试验方法

将2%浓度的琼脂溶液中加入不同浓度梯度的NaOH或KOH溶液，混合均匀后，待冷却至15℃或20℃下时观察琼脂的凝固状态，然后将处理后的琼脂再放入90℃的水中水浴加，观察琼脂熔化状态。

2、试验结果

实验结果如表1所示：

表1不同浓度的强碱处理后的琼脂凝固状态

实验结果显示，琼脂溶液中，KOH浓度大于等于0.8mol/L时，溶液在20℃条件下呈液态，NaOH浓度大于等于1mol/L时，在20℃条件下呈液态，

实验结果说明，为了维持琼脂溶液在低温下呈液态，本发明琼脂溶液中的KOH浓度选择大于等于0.8mol/L，优选为0.8mol/L，NaOH浓度选择大于等于1mol/L，优选为1mol/L。

二、琼脂浓度的选择

制备20ml含不同浓度的琼脂和0.8mol/LKOH的溶液，加入31ml浓度为0.3mol/L的硝酸溶液中和，再加入指示菌：大肠埃希氏菌和抗菌肽（浓度为0.3g/ml）。

在同一处理条件下，观察不同的浓度琼脂溶液中抑菌圈的扩散情况，结果如表2。

表2不同浓度琼脂对抑菌圈扩散的影响程度

如表2所示，琼脂浓度为2～3%时，用于抗菌肽检测的抑菌圈边缘清晰，易观测，而在该范围以外，则边缘模糊，或者呈半凝固态，难以检测。

实验结果说明，本发明琼脂溶液中，琼脂的浓度选择为2～3%，优选为3%。

实施例8本发明试剂盒中稀释液的筛选试验

1、实验方法

1.1中和后的液化琼脂对微生物生长的影响

高浓度的碱液对微生物生长是有害的，因此需要通过酸中和，同时为了方便操作我们选择固定体积和浓度的酸直接与固定体积的液化琼脂混合的方式，

选择不同的酸与20ml0.8mol/L的KOH液化琼脂滴定中和，以大肠埃希氏菌生长pH值5-7作为滴定终点，确定酸的最适体积。

然后再将1mL浓度为2.0OD600的大肠埃希氏菌与6mL10倍浓度的浓缩LB培养基存储液与约54mL中和后的液体琼脂混合，倾倒平板，培养并观察细菌生长情况。

1.2根据以上结果筛选最终确定用磷酸、盐酸、硝酸为中和液，分别中和0.8mol/L的KOH做抑菌圈实验，在同一处理条件下，指示菌用大肠埃希氏菌，样品用抗菌肽（浓度0.3g/mL），观察抑菌圈扩散情况。

2、试验结果

结果如表3和表4所示：

表3混合后的营养琼脂情况及菌落长势情况

酸及浓度	柠檬酸0.5M	冰乙酸1M	磷酸0.4M	盐酸0.4M	硝酸0.3M
						琼脂pH值	5—7	5—7	5—7	5—7	5—7
琼脂状态	完全凝固	完全凝固	完全凝固	完全凝固	完全凝固
						菌生长情况	无菌生长	无菌生长	有菌落生长	有菌落生长	有菌落生长

表4不同酸碱中和抑菌圈的扩散情况

酸种类	磷酸中和	盐酸中和	硝酸中和
				抑菌圈	边缘模糊不易测量	边缘清晰易测量	边缘清晰易测量

由表3和表4可以看出，采用强酸溶液，如，磷酸、盐酸和硝酸中和后琼脂溶液后，加入的指示菌生长可以正常生长，其中，采用盐酸和硝酸中和后形成的抑菌圈边缘清晰易测量，而加入弱酸溶液则会影响指示菌的生长。

实验结果说明，本发明稀释液可以是强酸溶液，如，磷酸溶液、盐酸溶液或硝酸溶液，浓度为0.3～0.4mol/L，优选为盐酸溶液或硝酸溶液，考虑安全因素，最优选硝酸溶液。

以下通过试验例的方式，说明本发明试剂盒和方法可以准确检测：

试验例1采用本发明试剂盒检测

采用实施例4所述检测试剂盒，按照如下步骤检测：

1、检测方法

（1）指示菌的活化

取出1g指示菌（大肠杆菌），用枪头吸取1mL无菌水加入其中并充分混匀，最后用枪头转接1mL指示菌菌悬液液于30ml营养液中，放入摇床，200rpm，30℃，培养18h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用无菌蒸馏水调零，测定其OD值（如果OD值在1.5—2.0之间，菌悬液的加入量为40微升每10mL活性检测培养基，如果OD值在2.0—2.5之间，菌悬液加入量为35微升每10mL活性检测培养基。）

（2）各样品液及标准品液的制备

硫酸粘杆菌素标准液：称取硫酸粘杆菌素标准品(含量22156U/mg)0.03g，溶于10mL磷酸缓冲液（制备方法：取K₂HPO₄2.0g，KH₂PO₄8.0g，加蒸馏水定容至1000mL，滤过，115℃，30min，即可。下同）中，混匀，2000rpm，离心10min，留上清液备用。实验时，以原液作为高剂量浓度，以用磷酸缓冲液稀释1倍的溶液为低剂量浓度，每个浓度设5个平行样。

抗菌肽供试品：称取抗菌肽样品(含量49851U/g)1.6g，溶于8.4mL磷酸缓冲液，混匀，2000rpm，离心10min，留上清液备用。以原液作为高剂量浓度，以用磷酸缓冲液稀释1倍的溶液为低剂量浓度，每个浓度设5个平行样。

（3）平板的制备

在温度为30℃的条件下，取15ml基质液，加入稀释液至溶液pH为5-7，加入大肠杆菌悬液，摇匀后用无菌移液管（10mL）每次精确移取10mL注入含平板下层培养基的平板上，迅速轻放于于水平操作台上至冷却，保证琼脂胶凝后效价测定培养基平面的平整度，再在30～37℃下倒置培养至少1h。

（4）上样

用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离均匀安置牛津杯4个（二剂量法）。样品和标准品的高低剂量分别以对角形式加入，加入量为160微升。上样完成后，放入培养箱，用陶瓦盖代替平板上盖盖好平板，37℃，培养6h。

（5）测量及结果计算

6h后，将平板取出，倒出牛津杯，将平板放置在一个黑色背景的平台上，用游标卡尺测量各抑菌圈的大小，并做好记录。数据结果处理及分析可以采用《中国药典》生物检定统计法中的（2.2）法，也可以通过二剂量法生物效价测定软件计算（如蓝宙工作室推出的药学专业软件）。

2、检测结果

抑菌圈检测结果如下表5所示：

抑菌圈大小检测结果

如表5所示，各个组别内，不同平行样之间的抑菌圈大小差距小，不同剂量的标准品或样品之间的差距大，说明本发明方法可以有效检测样品的抑菌效果。

为了进一步说明本发明方法的可靠性，用二剂量法生物效价测定软件计算其可靠性，实验结果如图1所示。由图1可以看出，效价可行限率小于5%，说明本发明检测方法是可靠的。

实验结果说明，本发明试剂盒和检测方法可以有效检测待检样品的抑菌效果。

综上，本发明试剂盒包含液态琼脂溶液，其pH高，不易染菌，可以长时间保存，使用时无需重新灭菌，同时，其在低温条件下（20℃）呈液态，有利于检测菌的混匀和生长。采用本发明试剂盒检测抗菌活性，无需配制新鲜琼脂液，对实验条件的要求低，操作简便，普通人即可使用，实用性强，并且，检测结果准确可靠。

Claims

1.一种琼脂溶液，其特征在于：它包括琼脂与强碱，其中，琼脂的浓度为2～3%（w/v），强碱的浓度不低于0.8mol/L。

2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于：所述琼脂的浓度为3%（w/v）。

3.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于：所述强碱为氢氧化钠，浓度不低于1.0mol/L。

4.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于：所述强碱为氢氧化钾，浓度为0.8～1.0mol/L。

5.一种制备权利要求1～4任意一项所述琼脂溶液的方法，其特征在于：步骤如下：按照权利要求1～4任意一项所述配比取原料，混匀，灭菌，即可。

6.一种检测抗菌活性的试剂盒，其特征在于：它包括如下组分：

指示菌；

营养液：指示菌的液体培养基；

基质液：权利要求1～4任意一项所述的琼脂溶液；

稀释液：强酸溶液。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述指示菌中，活菌数为10⁷～10⁸个/g；

所述指示菌为大肠杆菌时，营养液是LB液体培养基。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述强酸溶液是磷酸溶液、盐酸溶液或者硝酸溶液。

9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述强酸溶液的浓度为0.3～0.4mol/L。

10.一种使用权利要求6～9任意一项所述试剂盒检测抗菌活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取待检样品，制成样品溶液；

（2）取指示菌，加入营养液，制成菌悬液；