CN103861096A - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法及其产品，该方法包括：（1）细胞的培养：将Marc-145细胞按照3×10⁵个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合均匀，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。本发明方法优化了波浪生物反应器培养Marc-145细胞的各工艺参数，有效提升了Marc-145细胞的培养效率，显著提高了灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力。

Description

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的方法，属于高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为规模化猪场的主要疫病之一。中国将其列为二类传染病。猪繁殖与呼吸综合征是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是PRRS流行病学的重要特征，PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。猪繁殖与呼吸综合征尚无有效治疗药物，疫苗免疫接种是预防和控制猪繁殖与呼吸综合征病的根本措施。

目前，猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖PRRSV。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如pH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致存在生产的产品质量稳定性不够、批间差较大、产量低等问题。利用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗生产技术之一。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。

采用WAVE波浪生物反应器生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率及其免疫保护效力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合均匀，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；其中，将Marc-145细胞按照3×10⁵个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。

本发明采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器培养Marc-145细胞时，细胞接种密度、微载体含量以及摇动培养条件对于Marc-145细胞在微载体上的吸附以及细胞生长等有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的培养参数以最大限度的促进Marc-145细胞生长，本发明采用正交试验，选择对Marc-145细胞生长影响较大的细胞接种密度、微载体含量和摇动条件作为考察对象，经过实验摸索确定相关水平，并运用极差分析法进行数据处理，对工艺参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。

其中，当细胞接种密度为3×10⁵个/ml、微载体含量为2g/L、摇动培养条件为7°、14rpm时，Marc-145细胞含量远远高于其它的参数，Marc-145细胞的含量达到2.79×10⁷个/毫升。

本发明方法优化了波浪生物反应器培养细胞的各工艺参数，有效提升了细胞的培养效率，显著提高了活疫苗的生产效能以及免疫保护效力；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗对于猪有良好的免疫保护效果，本发明活疫苗的免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的活疫苗对猪的免疫保护效力。本发明的PRRSV生产方法体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势，与传统的摇瓶培养工艺相比，抗原效价提高显著，而且产品质量均一，生产工艺简化，操作简单，提高了生产效率，降低了生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料及仪器

1.1、生物反应器：美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。

1.2、微载体：Cytodex-1（购自美国通用电气医疗集团生命科学部）。

1.3、猪繁殖与呼吸综合征病毒株：从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心分发获得，微生物保藏编号是：CGMCC No.2467。通过任何一种商业途径购买得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒株也能适用于本发明（例如，可以从中国兽医药品监察所购买得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒株）。

实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗

1.细胞的培养

1.1微载体处理：按培养的终体积称取微载体适量，用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS高压灭菌。115℃、10psi、15min。

1.2细胞复苏培养：用方瓶培养从液氮罐中复苏的Marc-145细胞（购自于中国兽医药品监察所），培养条件包括：pH值7.2、温度37℃；培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为8%。

1.3微载体培养：用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按3×10⁵个/mL的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为：微载体浓度为2g/L、DO值50%、温度37℃、摆动角度7°、摆动速度14rpm。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数（Cytodex1上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核），当细胞的密度达到1×10⁶-2×10⁶个/ml时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。

2.病毒液的增殖

当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV，其中病毒接种剂量为5%、病毒增值的培养基为含2%血清的MEM，pH值7.4，温度35℃。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID₅₀，当微载体上的细胞大部分脱落，停止培养，收获病毒液，于-30℃冻融两次，得到猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV液。

2.1病毒含量的测定

利用TCID₅₀方法进行病毒含量的测定。病毒TCID₅₀测定时，以MEM培养液将培养得到的PRRSV液作连续10倍稀释，即10^-1、10^-2……10^-8，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的Marc-145细胞悬液，每孔100μL（细胞含量以3×10⁵/ml左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%CO₂培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2～5日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。同时以相同的方法对用转瓶培养的PRRS病毒液进行TCID₅₀测定。以此作为对照组。

实验结果见表1，由结果表明，利用生物反应器培养的PRRSV液病毒含量不小于转瓶培养的PRRSV液病毒含量。由此可见利用生物反应器培养的病毒要优于转瓶培养的病毒。

表1PRRSV含量测定

2.2病毒维持液血清浓度的确定

分别选择1.5%、2%、2.5%、3%血清浓度维持液，培养结束后，分别对含毒细胞培养液的病毒含量进行测定，以确定最佳血清浓度的维持液。

实验结果见表2，从表2可以看出，血清浓度对病毒的增值有一定的影响，当血清浓度为2%时，病毒含量为10^7.6TCID₅₀/0.1ml，明显高于血清浓度为1.5%时的病毒含量。但与2.5%和3.0%比较时，结果差异不显著，因此选择血清浓度为2%的维持液培养病毒。

表2不同血清浓度维持液对病毒增值的影响

血清含量（%）	1.5	2	2.5	3
					TCID50/0.1ml	107.2	107.6	107.6	107.6

3配苗及分装

3.1制苗用病毒液的准备将无菌检验和病毒含量测定合格的各瓶病毒液，于室温条件下融化混合。

3.2保护剂的配制保护剂为含8%明胶、40%蔗糖的水溶液。经118℃高压灭菌40分钟后，保存备用。

3.3配苗经病毒液：保护剂按7:1的比例混合均匀，即为疫苗原液。

3.4.分装无菌定量分装。

4冻干

分装后迅速进行冷冻真空干燥，制成活疫苗。

实验例1细胞接种密度、微载体含量、摇动条件的优化实验

正交试验影响因子与水平的确定：选择对细胞生长影响较大的细胞接种密度、微载体含量和摇动条件作为考察对象，经过实验摸索确定相关水平，并运用极差分析法进行数据处理。

表3

采用6因子，5水平的正交试验L25（5⁶），共需25项试验。

表4

极差分析表明A>B>C；从表2可以看出当A3B2C4组合时为最佳组合，即当细胞接种密度为3×10⁵、微载体含量为2g/L、摇动条件为7°、14rpm，细胞含量最高，达到2.79×10⁷个/ml。

实验例2高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的安全性试验

1、供试疫苗：实施例1制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。

2、实验方法及结果：用4～6周龄的健康易感仔猪5头，接种前观察2～3日，每日定时测定体温1次，取其平均值作为基础体温。每头猪颈部肌肉注射疫苗10头份，接种后每日定时测定体温1次，连续观察14日。与接种前相比，精神、食欲无明显变化，体温升高不超过1℃，说明本发明所制备的活疫苗安全性良好。

实验例3高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫原性实验

一、疫苗

1、供试疫苗：实施例1制备的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；

二、实验方法

免疫攻毒测定：用5～6周龄健康易感仔猪15头，随机分为3组，每组5头。一组用供试疫苗进行免疫保护，另一组用转瓶苗进行保护；两组试验猪各颈部肌肉注射疫苗1头份。第三组不接种疫苗，作为对照，在相同条件下隔离饲养。28日后，所有猪各肌肉注射检验用强毒HuN4株的病毒培养液（10^4.0TCID₅₀/ml）1ml，每头滴鼻2ml，每日测温并观察21日。对照猪全部发病，4头死亡，免疫猪一组5头保护，二组4头保护。

由表5的结果可以看出，本发明生产的活疫苗保护率在90%，而转瓶生产的疫苗保护率为70%，因此本发明生产的活疫苗比转瓶生产的疫苗有更好的保护效果。

表5　活疫苗对ＰＲＲＳＶ强毒攻击的保护力

由此可以看出，本发明所制备的活疫苗对于猪有良好的免疫保护效果，且本发明活疫苗的免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的灭活疫苗对猪的免疫保护效力。发明的PRRSV生产方法，体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势，与传统的转瓶培养工艺相比，抗原效价提高显著，而且产品质量均一；生产工艺简化，操作简单，提高了生产效率，降低了生产成本。

Claims (10)

1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗的生产方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种猪繁殖与呼吸综合征病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗；其中，将细胞按照3×10⁵个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。

2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的细胞是Marc-145细胞。

3.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：细胞培养袋中的微载体含量为2g/L。

4.按照权利要求1或3所述的生产方法，其特征在于：所述的微载体是Cytodex-1。

5.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述摇动细胞培养袋培养细胞的摇动培养条件为摆动角度为7°、摆动转速为14rpm。

6.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述保护剂为含8%明胶、40%蔗糖的水溶液。

7.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：将病毒液与保护剂按照7:1的体积比混合均匀。

8.由权利要求1-7任何一项所述方法制备得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。

9.权利要求8所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗在制备预防或治疗由猪繁殖与呼吸综合征病毒所导致疾病药物中的用途。

10.一种预防或治疗由猪繁殖与呼吸综合征病毒所导致疾病的药物组合物，其特征在于：含有预防或治疗上有效量的权利要求8所述的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。