CN103394081A

CN103394081A - 利用wave波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法

Info

Publication number: CN103394081A
Application number: CN2013103489778A
Authority: CN
Inventors: 乔云龙; 张娇娇; 李山峰; 李立莉; 李静
Original assignee: HEILONGJIANG BAIZHOU BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: HEILONGJIANG BAIZHOU BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN103394081B

Abstract

本发明公开了一种利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体、洗涤培养的细胞，接种禽流感病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到禽流感疫苗。本发明方法优化了波浪生物反应器培养MDCK细胞的各工艺参数，有效提升了MDCK细胞的培养效率，最终显著提高了禽流感疫苗的生产效能。免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的禽流感疫苗对于家禽有确切的免疫保护效力。

Description

利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种禽流感疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法，属于禽流感疫苗的生产领域。

背景技术

当前，禽流感疫苗主要由鸡胚来生产，这种传统的生产方法存在劳动强度大、鸡胚来源不稳定、需要繁琐的纯化工艺去除鸡胚蛋白减少过敏反应，同时还存在着难以避免的细菌污染和外源病毒的感染等诸多问题，而用生物反应器替代鸡胚生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的禽流感疫苗生产技术之一。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器，其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。采用WAVE波浪生物反应器培养细胞，主要优点有：1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于禽流感疫苗的生产效率有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高禽流感疫苗的生产效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了禽流感疫苗的生产效率。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将MDCK细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种禽流感病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到禽流感疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度7°、摆动速度为16rpm。

采用WAVE波浪生物反应器培养MDCK细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度7°、摆动速度为16rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。

此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响也密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体（Cytodex1）含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。从实验结果可见，随着微载体含量的增加，细胞密度会有所增加，但细胞扩增倍数较低。当微载体含量为2g/L时，不仅细胞密度高，细胞扩增倍数也较高。

在确定了微载体最适宜用量的基础上，本发明为2g/L的微载体用量，分别以不同的接种密度接种细胞，每天取样分析，以筛选最适宜的细胞接种密度。从实验结果可见，从表3可以看出，当微载体含量相等，不同的接种密度对MDCK细胞生长影响较大。以5×10⁴、1×10⁵个/mL接种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL接种时接种密度高，MDCK细胞在接种后第2天进入稳定生长期；随着细胞接种密度的增高，MDCK细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当MDCK细胞接种密度为2×10⁵个/mL时，MDCK细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用2×10⁵个/mL的接种量接种MDCK细胞。

本发明方法优化了波浪生物反应器培养MDCK细胞的各工艺参数，有效提升了MDCK细胞的培养效率，最终显著提高了禽流感疫苗的生产效能；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的禽流感疫苗对于家禽有确切的免疫保护效力。

具体实施方式

下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料及仪器

1.1、生物反应器：美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。

1.2、微载体：Cytodex-1（购自美国通用电气医疗集团生命科学部）。

1.3、禽流感病毒：禽流感H9亚型WD株购自北京市农林科学研究院。

实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗

1.细胞的培养

1.1微载体处理：按培养的终体积称取微载体（Cytodex-1）适量，用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS高压灭菌（115℃、10psi、15min）。

1.2细胞复苏培养：用方瓶培养从液氮罐中复苏的MDCK细胞，培养条件包括：pH值7.2、温度37℃；培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于波浪生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为DMEM，血清为胎牛血清，使用量为10%。

1.3微载体培养：用EDTA-胰酶细胞消化液制备MDCK细胞悬液，细胞计数后按2×10⁵个/mL的密度接种到细胞培养袋中的微载体上进行培养。培养的方法参数为：微载体浓度为2g/L、DO值50%、温度37℃﹑摆动角度7°、摆动速度16次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数（Cytodex1上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核），当细胞的密度达到1×10⁶-2×10⁶个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。

2.病毒液的增殖

当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入禽流感病毒-DMEM溶液进行病毒（禽流感（H9亚型）（WD株）接种，其中病毒接种剂量为0.02MOI、TPCK-胰酶的浓度为0.3μg/mL，病毒增值的培养基为不含血清的DMEM，培养时间为48-72h。收获病毒液，测定病毒含量HA大于2⁹，-20℃保存备用。

3.病毒液灭活及乳化制成疫苗

收获病毒液用甲醛溶液灭活，甲醛溶液终浓度0.1%，37℃灭活24h；先把两份油相进行灭菌处理，然后把一份完全灭活的禽流感病毒液缓慢倒入搅拌中的油相，乳化制得禽流感疫苗。

实验例1微载体含量的优化实验

细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系；为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。

在每克微载体接种相同MDCK细胞数的前提下，考察Cytodex1含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时MDCK细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。

实验结果见表1和表2。从表1和表2可以看出，随着微载体含量的增加，MDCK细胞密度会有所增加，但MDCK细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为2g/L时，其扩增倍数为32.8，略低于微载体含量为1g/L时的扩增倍数（微载体含量为1g/L时的扩增倍数为34），但远远高出其它微载体含量的扩增倍数；此外，微载体含量为2g/L时，MDCK细胞生长较快，MDCK细胞密度较高；当微载体含量高于2g/L时，MDCK细胞生长的增加速度不显著。综合MDCK细胞生长速度和细胞扩增倍数较，当微载体含量高于2g/L时，不仅有高的细胞密度，且能较快和高效的培养细胞，因此，本发明在细胞培养袋中培养MDCK细胞时，所加入的微载体的含量优选为2g/L。

表1不同微载体含量MDCK细胞生长情况（单位个/mL）

表2不同微载体含量时MDCK细胞扩增倍数

微载体含量（g/L）	1	2	3	4	5	6	7	8
									扩增倍数	34	32.8	20.6	18.5	17.2	15	13.5	11.6

注：细胞扩增倍数=最高细胞密度/接种细胞密度

实验例2MDCK细胞接种密度的筛选实验

当微载体的用量为2g/L，分别以5×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL的接种密度接种MDCK细胞，每天取样分析，MDCK细胞生长情况如表3所示。

表3不同接种密度MDCK细胞生长情况（单位个/mL）

从表3可以看出，当微载体含量相等，不同的接种密度对MDCK细胞生长影响较大。以5×10⁴、1×10⁵个/mL接种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL接种时接种密度高，MDCK细胞在接种后第2天进入稳定生长期；从表3的数据的可见，随着细胞接种密度的增高，MDCK细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当MDCK细胞接种密度为2×10⁵个/mL时，MDCK细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用2×10⁵个/mL的接种量接种MDCK细胞。

实验例3摇动条件的优化实验

以2g/L的含量加入微载体，以2×10⁵个/mL密度接种MDCK细胞，加入细胞培养基培养，摆动角度分别为6°、7°、8°；摆动速度分别为12rpm、14rpm、16rpm、18rpm，每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，考察摇动条件对细胞培养的影响。

实验结果见表4。从表4可以看出，整个培养过程，摇动条件对细胞的密度影响较大。从实验结果可见，当摇动条件为摆动角度7°、摆动速度16rpm时，在此摇动条件下细胞的生长速度要远远高于其它的摇动条件（差异显著）。因此，本发明的摇动条件优选为摆动角度7°、摆动速度16rpm。

表4不同摇动条件下MDCK细胞生长情况（单位：个/mL）

0（天）

1（天）

2（天）

3（天）

4（天）

5（天）

6°、12rpm

2×10⁵

4.9×10⁵

1.6×10⁶

3.8×10⁶

5.7×10⁶

6°、14rpm

2×10⁵

4.8×10⁵

1.7×10⁶

3.9×10⁶

5.9×10⁶

5.8×10⁶

6°、16rpm

2×10⁵

5.0×10⁵

1.8×10⁶

4.0×10⁶

6.1×10⁶

6°、18rpm

2×10⁵

5.1×10⁵

1.9×10⁶

4.2×10⁶

6.4×10⁶

6.2×10⁶

7°、12rpm

2×10⁵

5.0×10⁵

1.8×10⁶

4.0×10⁶

6.2×10⁶

6.3×10⁶

7°、14rpm

2×10⁵

5.1×10⁵

1.8×10⁶

4.1×10⁶

6.3×10⁶

6.5×10⁶

7°、16rpm

2×10⁵

6.1×10⁵

2.9×10⁶

5.6×10⁶

7.5×10⁶

8.7×10⁶

7°、18rpm

2×10⁵

5.0×10⁵

1.6×10⁶

3.8×10⁶

6.0×10⁶

6.1×10⁶

8°、12rpm

2×10⁵

4.9×10⁵

1.4×10⁶

3.5×10⁶

5.6×10⁶

5.5×10⁶

8°、14rpm

2×10⁵

4.7×10⁵

1.3×10⁶

3.1×10⁶

5.4×10⁶

8°、16rpm

2×10⁵

4.6×10⁵

1.2×10⁶

3.3×10⁶

4.7×10⁶

8°、18rpm

2×10⁵

4.6×10⁵

1.0×10⁶

1.9×10⁶

4.5×10⁶

4.6×10⁶

实验例5禽流感疫苗的免疫保护效力实验

1、供试疫苗：实施例1所制备的禽流感疫苗（细胞苗）。

2、实验方法：实施例制备的禽流感疫苗免疫21日龄SPF鸡，颈部皮下注射0.3mL，免疫后14天、21天、28天分别采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体，同时设立对照组，对照组为禽流感疫苗鸡胚苗。计算HI抗体效价的几何平均值（GMT）。

3、实验结果

实验结果见表5。

表5禽流感疫苗的免疫保护效力实验

从实验结果可见，本发明所制备的禽流感疫苗对于鸡有确切的免疫保护效力。

Claims

1.一种利用WAVE波浪生物反应器生产禽流感疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞；接种禽流感病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液灭活后，乳化，得到禽流感疫苗；其特征在于：步骤（1）中所述的摇动参数为摆动角度7°、摆动速度为16rpm。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的细胞是MDCK细胞。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微载体是Cytodex-1。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微载体在细胞培养袋中的含量是2g/L。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将细胞按照2×10⁵个/mL的接种量接种到细胞培养袋的微载体上。

6.由权利要求1-5任何一项所述方法制备得到的禽流感疫苗。

7.权利要求7所述的禽流感疫苗在制备预防或治疗禽流感药物中的用途。

8.一种预防或治疗禽流感的药物组合物，其特征在于：含有预防或治疗上有效量的权利要求6所述的禽流感疫苗。