CN103877573A - 伪狂犬病活疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病活疫苗的制备方法，该方法包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体、洗涤培养的细胞，接种伪狂犬病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合，得到活疫苗。本发明方法优化了波浪生物反应器培养ST细胞的各工艺参数，有效提升了ST细胞的培养效率，最终显著提高了伪狂犬病活疫苗的生产效能以及免疫保护效力。免疫保护效力实验证实，本发明活疫苗对于猪、牛及绵羊有良好的免疫保护效果，免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的疫苗。

Description

伪狂犬病活疫苗的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种伪狂犬病活疫苗的制备方法，尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，属于伪狂犬病活疫苗的生产领域。

背景技术

伪狂犬病（pseudorabies，PR）又称Aujeszky氏病，是由猪疱疹病毒I型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主症的一种急性传染病。通常引起妊娠母猪流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔；初生仔猪出现腹泻及神经症状、感染率和死亡率可达100%；母猪出现返情屡配不孕；育肥猪感染后不发病，多呈隐性感染，耐过猪，主要表现生长发育迟缓，饲料报酬率降低等，并可长期带毒、排毒，成为最危险的传染源。该病最早发现于美国，后由匈牙利学者Aujeszky首次分离到该病毒，故又称为奥耶斯基病(Aujeszkysdisease)。据报道，全世界已有50多个国家和地区爆发过该病，对养猪业的发展构成了严重威胁。本病尚无有效治疗药物，疫苗免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。

目前，伪狂犬病活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式，进而增殖伪狂犬病毒。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件，如pH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致生产的产品质量稳定性不够，批间差较大。另外提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决伪狂犬病毒活疫苗产业化的当务之急。而用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足，成为最具有前途的伪狂犬病活疫苗生产技术之一。

WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是，细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内，接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动，精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。本发明采用WAVE波浪生物反应器，主要优点有1）免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2）封闭培养系统，无需固定的管道，简化细胞培养厂房，缩短反应器安装和生产产品转换时间。3）细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上，平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递，产生一个适于细胞生长的完美环境。

采用WAVE波浪生物反应器生产伪狂犬病活疫苗时，所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于伪狂犬病活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响，在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高伪狂犬病活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化，有效提升了伪狂犬病活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种利用WAVE波浪生物反应器生产伪狂犬病活疫苗的方法，包括：（1）细胞的培养：将ST细胞接种到细胞培养袋中的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞，接种伪狂犬病毒毒种，加入病毒增殖培养基培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与适宜稳定剂混合均匀，经冷冻真空干燥得到伪狂犬病活疫苗；其中，所述的摇动条件为摆动角度6°、摆动速度为14rpm。

采用WAVE波浪生物反应器培养ST细胞时，摇动培养参数对于细胞在微载体上的吸附以及细胞生长有非常显著的影响，为了筛选到最适宜的摇动培养参数以最大限度的促进细胞生长，本发明对摇动培养时的摆动角度以及摆动速度等参数进行了优化考察，观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。通过实验发现，在对于细胞培养袋中的细胞进行摇动培养时，摆动角度以及摆动速度对于细胞的生长有非常显著的影响；本发明最终发现，当摇动培养时的培养条件为摆动角度6°、摆动速度为14rpm能够最为显著的促进细胞的生长，该培养条件下的细胞生长速度显著高于其它的培养条件。

此外，细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响也密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系。在每克微载体接种相同细胞数的前提下，本发明考察微载体（Cytodex1）含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。从实验结果可以看出，随着微载体含量的增加，ST细胞密度会有所增加，但ST细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为2g/L时，ST细胞生长较快，培养时间为5天时，ST细胞密度达到了1.86×10⁷g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于2g/L时，ST细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养ST细胞时，所加入的微载体的含量优选为2g/L。因此综合考虑，本实验微载体含量优选为2g/L。

在确定了微载体最适宜用量的基础上，本发明为2g/L的微载体用量，分别以不同的接种密度接种细胞，每天取样分析，以筛选最适宜的细胞接种密度。从实验结果可见，当微载体含量相等，不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。以5×10⁴、1×10⁵个/mL接种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL接种时接种密度高，ST细胞在接种后第2天进入稳定生长期；从实验结果可见，随着细胞接种密度的增高，ST细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当ST细胞接种密度为2×10⁵个/mL时，ST细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用2×10⁵个/mL的接种量接种ST细胞。

本发明方法优化了波浪生物反应器培养ST细胞的各工艺参数，有效提升了ST细胞的培养效率，最终显著提高了伪狂犬病活疫苗的生产效能以及免疫保护效力；免疫保护效力实验证实，本发明方法所制备的伪狂犬病活疫苗对于家畜有确切的免疫保护效力；本发明方法可用于大规模工业化生产伪狂犬病活疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

生物材料及仪器

1.1、生物反应器：美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。

1.2、微载体：Cytodex-1（购自美国通用电气医疗集团生命科学部）。

1.3、伪狂犬病毒（Bartha-K61株）购自中国兽医药品监察所；通过其它途径获得伪狂犬病毒株也可适用于本发明；例如，从中国典型培养物保藏中心分发获得的保藏编号为CCTCC No.V201114的伪狂犬病毒株也能适用于本发明。

实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产伪狂犬病活疫苗

1.细胞的培养

1.1微载体处理：按培养的终体积称取微载体（Cytodex-1）适量，用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS室温浸泡过夜，弃去PBS，再用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS高压灭菌（115℃、10psi、15min）。

1.2细胞复苏培养：用方瓶培养从液氮罐中复苏的ST细胞，培养条件包括：pH值7.2、温度37℃；培养48-72h，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为8%。

1.3微载体培养：用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按2×10⁵个/mL的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为：微载体浓度为2g/L、DO值50%、温度37℃﹑摆动角度6°、摆动速度14次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生，同时在不同的节点上细胞计数（Cytodex1上的细胞计数先用PBS漂洗2次，经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色，用血球计数板计数细胞核），当细胞的密度达到1×10⁶-2×10⁶个/mL时开始灌注，依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2个工作体积的速度，以维持细胞的生成。

2.病毒液的增殖

当细胞培养到达第四天时沉降微载体，排出细胞培养袋中液体，加入PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，加入病毒维持液并接种伪狂犬病病毒，其中病毒接种剂量为3%、病毒增值的培养基为含1%血清的MEM，pH值7.4，温度35℃。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50，当微载体上的细胞大部分脱落，停止培养，收获病毒液，于-20℃冻融两次，得到伪狂犬病毒液。

2.1病毒含量的测定

利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时，以MEM培养液将培养得到的伪狂犬病毒液作连续10倍稀释，即10^-1、10^-2……10^-8，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST细胞悬液，每孔100μL（细胞含量以3×10⁵/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%CO₂培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2～4日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶培养的伪狂犬病毒液进行TCID50测定。以此作为对照组。

实验结果见表1，由结果表明，利用生物反应器培养的伪狂犬病毒液病毒含量不小于转瓶培养的伪狂犬病毒液病毒含量。由此可见利用生物反应器培养的病毒要明显优于转瓶培养的病毒。

表1伪狂犬病毒含量

2.2病毒维持液血清浓度的确定

分别选择0.5%、1%、1.5%、2%血清浓度维持液，培养结束后，分别对含毒细胞培养液的病毒含量进行测定，以确定最佳血清浓度的维持液。

实验结果见表2，从表5可以看出，血清浓度对病毒的增值有一定的影响，当血清浓度为1%时，病毒含量为10^7.6TCID50/0.1ml，明显高于血清浓度为0.5%时的病毒含量。但与1.5%和2%比较时，结果差异不显著，因此选择血清浓度为1%的维持液培养病毒。

表2不同血清浓度维持液对病毒增值的影响

3.病毒液制成活疫苗：将收获病毒液按7份加入稳定剂1份，混合均匀，定量分装，每头份不低于5000TCID50，迅速进行冷冻真空干燥。

实验例1微载体含量的优化实验

细胞接种密度与微载体含量对细胞生长的影响密切相关，其中重要的标志是接种时要保证合适的细胞密度与载体的比例关系；为了生产高滴度的病毒，需要细胞密度较高，同时，为了较快和高效的培养细胞，又要求细胞的细胞扩增倍数较高。

在每克微载体接种相同ST细胞数的前提下，考察Cytodex1含量为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L时ST细胞生长情况，用来确定合适的载体用量。

从表3可以看出，随着微载体含量的增加，ST细胞密度会有所增加，但ST细胞扩增倍数却有所降低。微载体含量为2g/L时，ST细胞生长较快，培养时间为5天时，ST细胞密度达到了1.68×10⁷g/L，非常显著的高于其它的微载体的细胞密度；此外，当微载体含量高于2g/L时，ST细胞生长的增加速度不显著。因此，本发明在细胞培养袋中培养ST细胞时，所加入的微载体的含量优选为2g/L。因此综合考虑，本实验微载体含量采用2g/L。

表3不同微载体含量细胞生长情况（单位个/mL）

实验例2ST细胞接种密度的筛选实验

当微载体的用量为2g/L，分别以5×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL的接种密度接种ST细胞，每天取样分析，细胞生长情况如表1所示。

从表4可以看出，当微载体含量相等，不同的接种密度对ST细胞生长影响较大。以5×10⁴、1×10⁵个/mL接种时，接种密度低接种后5天仍在缓慢生长，没有进入稳定生长期的明显标志；以2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵个/mL接种时接种密度高，ST细胞在接种后第2天进入稳定生长期；从表2的数据的可见，随着细胞接种密度的增高，ST细胞生长速度的增加并不与细胞接种密度增加保持同步；当ST细胞接种密度为2×10⁵个/mL时，ST细胞在第4天和第5天后的生长速度要明显高于其它接种密度的生长速度，因此，本发明优选采用2×10⁵个/mL的接种量接种ST细胞。

表4不同接种密度细胞生长情况（单位个/mL）

实验例3摇动条件的优化实验

以2g/L的含量加入微载体，以2×10⁵个/mL密度接种ST细胞，加入细胞培养基培养，摆动角度分别为5°、6°、7°、8°、9°；摆动速度分别为12rpm、14rpm、16rpm、18rpm，每天取样，观察微载体上细胞吸附和生长情况，考察摇动条件对细胞培养的影响。

实验结果见表5。从表5可以看出，整个培养过程，摇动条件对细胞的密度影响较大。从实验结果可见，当摇动条件为摆动角度6°、摆动速度14rpm时，在此摇动条件下细胞的生长速度要远远高于其它的摇动条件（差异显著）。因此，本发明的摇动条件优选为摆动角度6°、摆动速度14rpm。

表5不同摇动条件下细胞生长情况（单位：个/mL）

0（天）

1（天）

2（天）

3（天）

4（天）

5（天）

6°、12rpm

2×105

5.2×105

4.16×106

9.52×106

1.17×107

1.77×107

6°、14rpm

2×105

7.8×105

6.61×106

1.82×107

2.16×107

2.98×107

6°、16rpm

2×105

6.3×105

4.48×106

9.71×106

1.09×107

1.79×107

6°、18rpm

2×105

5.8×105

4.39×106

9.62×106

1.14×107

1.68×107

7°、12rpm

2×105

5.3×105

4.21×106

9.67×106

1.19×107

1.81×107

7°、14rpm

2×105

6.92×105

4.58×106

9.79×106

1.22×107

1.92×107

7°、16rpm

2×105

6.8×105

4.55×106

9.98×106

1.27×107

1.86×107

7°、18rpm

2×105

5.5×105

4.27×106

9.62×106

1.12×107

1.71×107

8°、12rpm

2×105

5.9×105

4.44×106

9.75×106

1.16×107

1.84×107

8°、14rpm

2×105

6.6×105

4.13×106

9.73×106

1.18×107

1.16×107

8°、16rpm

2×105

6.8×105

4.51×106

9.81×106

1.26×107

1.87×107

8°、18rpm

2×105

6.3×105

4.30×106

9.59×106

1.17×107

1.78×107

9°、12rpm

2×105

6.46×105

4.30×106

9.61×106

1.12×107

1.72×107

9°、14rpm

2×105

6.69×105

4.30×106

9.82×106

1.23×107

1.81×107

9°16rpm

2×105

6.51×105

4.30×106

9.78×106

1.15×107

1.69×107

9°、18rpm

2×105

6.58×105

4.30×106

9.69×106

1.06×107

1.57×107

实验例4疫苗的安全性实验

一、供试疫苗：实施例1制备的活疫苗。

二、实验方法及结果

按瓶签注明头份用PBS稀释为每5mL含14头份，肌肉注射6-18月龄、无伪狂犬病毒中和抗体的绵羊2只，每只5mL，观察14日，无临床反应。证明供试疫苗安全性良好。

实验例5疫苗的免疫原性比较实验

一、实验材料

1、供试疫苗：实施例1制备的活疫苗。

2、对照疫苗：采用现有的常规转瓶方法制备的转瓶苗。

二、实验方法及结果

免疫攻毒法：按瓶签注明头份用PBS稀释为每lmL含0.2头份，肌肉注射6-18月龄、无伪狂犬病毒中和抗体的绵羊4只，每只lmL，14日后，连同条件相同的对照绵羊3只，每只肌肉注射强毒lmL(含1000LD50)，观察14日，反应器苗和转瓶苗同时做平行对比试验。

结果见表6。

表6疫苗对伪狂犬病毒强毒攻击的保护力

由表6中的数据可以看出供试疫苗对伪狂犬病毒强毒攻击的保护力要好于转瓶制备的疫苗。由此可以看出，本发明所制备的疫苗对于家畜有良好的免疫保护效果。

疫苗病毒含量测定：将供试疫苗用PBS做10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度各接种ST细胞4小瓶，每瓶0.1mL，补充维持液0.9mL，使之总量为1mL。观察记录细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶制备的伪狂犬病活疫苗进行TCID50测定。以此作为对照组。实验结果见表7。

由实验结果可见，利用生物反应器培养的伪狂犬病毒液病毒含量不小于转瓶制备的疫苗的病毒含量。由此可见利用生物反应器培养的病毒要明显优于转瓶培养的病毒。

表7伪狂犬病毒含量

Claims (8)

1.一种伪狂犬病活疫苗的制备方法，包括：（1）细胞的培养：将细胞接种到细胞培养袋的微载体上，加入细胞培养基，摇动细胞培养袋培养细胞；（2）病毒液的增殖：沉降微载体，洗涤培养的细胞；接种伪狂犬病毒毒种，加入病毒增殖培养基继续培养细胞，收获病毒液；（3）将病毒液与保护剂混合，得到伪狂犬病活疫苗；其特征在于：步骤（1）中所述的摇动参数为摆动角度6°、摆动速度为14rpm。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的细胞是ST细胞。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微载体是Cytodex-1。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微载体在细胞培养袋中的含量是2g/L。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将细胞按照2×10⁵个/mL的接种量接种到细胞培养袋的微载体上。

6.由权利要求1-5任何一项所述方法制备得到的伪狂犬病活疫苗。

7.权利要求7所述的伪狂犬病活疫苗在制备预防或治疗由伪狂犬病毒所导致疾病药物中的用途。

8.一种预防或治疗由伪狂犬病毒所导致疾病的药物组合物，其特征在于：含有预防或治疗上有效量的权利要求6所述的伪狂犬病活疫苗。