CN103861097A - 猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法及其产品,该方法包括:(1)细胞的培养:将Vero细胞按照3×105个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上,加入细胞培养基,摇动细胞培养袋培养细胞;(2)病毒液的增殖:沉降微载体,洗涤培养的细胞,接种猪流行性腹泻病毒毒种,加入病毒增殖培养基培养细胞,收获病毒液;(3)将病毒液灭活后,乳化,得到猪流行性腹泻灭活疫苗。本发明方法优化了波浪生物反应器培养Vero细胞的各工艺参数,有效提升了Vero细胞的培养效率,显著提高了猪流行性腹泻灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力。
Description
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻灭活疫苗的生产方法,尤其涉及一种利用WAVE波浪生物反应器生产预防或治疗猪流行性腹泻灭活疫苗的方法,属于猪流行性腹泻灭活疫苗的生产领域。
背景技术
猪流行性腹泻(PED)是由病毒引起的仔猪和育肥猪的一种急性肠道传染病。本病与传染性胃肠炎很相似,是一种高度接触性传染性,以呕吐、严重腹泻、脱水,致两周龄内仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病。在中国多发生在每年12月份至翌年1~2月,夏季也有发病的报道。可发生于任何年龄的猪,年龄越小,症状越重,死亡率高。本病尚无有效治疗药物,疫苗免疫接种是预防和控制猪流行性腹泻病的根本措施。
目前,猪流行性腹泻灭活疫苗的生产主要是转瓶细胞培养的传统培养方式,进而增殖PEDV。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中对细胞和病毒的培养条件,如PH、溶氧、糖耗等难以监控和适时补给,无法提供最佳的培养条件,造成该方法自动化程度低,劳动强度大,并因为转瓶细胞培养环境的不可控性,导致生产的产品质量稳定性不够,批间差较大,效价低,产量低等问题。而用生物反应器替代转瓶生产疫苗株则克服了上述所述不足,成为最具有前途的猪流行性腹泻灭活疫苗生产技术之一。
WAVE波浪生物反应器是采用抛弃型生产技术进行细胞培养的一种新型反应器。其工作方式是,细胞接种于可抛弃的细胞培养袋内,接种细胞的培养袋固定在托盘上以一定的方式摇动,精密控制的摇动保证了培养体系的有效混合和传氧效率。
采用WAVE波浪生物反应器生产猪流行性腹泻灭活疫苗时,所加入微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养袋的摇动参数等生产条件对于猪流行性腹泻灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力的高低等有非常显著的影响,在生产实践中需要对这些条件进行优化才能有效提高猪流行性腹泻灭活疫苗的生产效率及其免疫保护效力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用WAVE波浪生物反应器生产猪流行性腹泻灭活疫苗的方法,该方法对微载体的含量、细胞接种密度、细胞培养条件等参数进行了优化,有效提升了猪流行性腹泻灭活疫苗的生产效率以及免疫保护效力。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
一种猪流行性腹泻灭活疫苗的生产方法,包括:(1)细胞的培养:将细胞接种到细胞培养袋中的微载体上,加入细胞培养基,摇动细胞培养袋培养细胞;(2)病毒液的增殖:沉降微载体,洗涤培养的细胞,接种猪流行性腹泻病毒毒种,加入病毒增殖培养基培养细胞,收获病毒液;(3)将病毒液灭活后,乳化,得到猪流行性腹泻灭活疫苗;其中,将Vero细胞按照3×105个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。
本发明采用WAVE波浪生物反应器,主要优点有1)免除生物反应器清洗、消毒及其相关认证。2)封闭培养系统,无需固定的管道,简化细胞培养厂房,缩短反应器安装和生产产品转换时间。3)细胞培养袋Cellbag放在特殊设计的摇动平台上,平台的摇动在培养液中产生波浪提供培养物混合和氧气传递,产生一个适于细胞生长的完美环境。
采用WAVE波浪生物反应器培养Vero细胞时,细胞接种密度、微载体含量以及摇动培养条件对于Vero细胞在微载体上的吸附以及细胞生长等有非常显著的影响,为了筛选到最适宜的培养参数以最大限度的促进Vero细胞生长,本发明采用正交试验,选择对Vero细胞生长影响较大的细胞接种密度、微载体含量和摇动条件作为考察对象,经过实验摸索确定相关水平,并运用极差分析法进行数据处理,对工艺参数进行了优化考察,观察不同的培养条件对于细胞的生长所带来的影响。
从实验结果的极差分析可以看出,影响Vero细胞含量的各因子的强弱顺序依次为细胞接种密度>微载体含量>摇动培养条件;其中,当Vero细胞接种密度为3×105个/ml、微载体含量为3g/L、摇动培养条件为7°、16rpm时,Vero细胞含量远远高于其它的参数,Vero细胞的含量达到2.96×107个/毫升。
本发明方法优化了波浪生物反应器培养细胞的各工艺参数,有效提升了细胞的培养效率,显著提高了灭活疫苗的生产效能以及免疫保护效力;免疫保护效力实验证实,本发明方法所制备的猪流行性腹泻灭活疫苗对于猪有良好的免疫保护效果,本发明灭活疫苗的免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的灭活疫苗对猪的免疫保护效力。本发明的灭活疫苗生产方法体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势,与传统的摇瓶培养工艺相比,抗原效价提高显著,而且产品质量均一,生产工艺简化,操作简单,提高了生产效率,降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施方案来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
生物材料及仪器
1.1、生物反应器:美国Wave Biotech公司WAVE波浪生物反应器。
1.2、微载体:Cytodex-1(购自美国通用电气医疗集团生命科学部)。
1.3、猪流行性腹泻病毒株:微生物保藏编号为CCTCC-V200608(中国典型培养物保藏中心);此外,通过任何一种商业途径购买得到的猪流行性腹泻病毒株均能适用于本发明。
实施例1利用WAVE波浪生物反应器生产猪流行性腹泻灭活疫苗
1.细胞的培养
1.1细胞复苏培养
用方瓶培养从液氮罐中复苏的Vero细胞,培养条件包括:pH值7.2、温度37℃;培养48-72h,形成良好细胞单层时,用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养;该过程中使用的培养基为MEM,血清为胎牛血清,使用量为8%。
1.2微载体处理
按培养的终体积称取微载体适量,用无Ca2+、Mg2+-PBS室温浸泡过夜,弃去PBS,再用无Ca2+、Mg2+-PBS洗一次,弃去,最后加入无Ca2+、Mg2+-PBS高压灭菌。115℃、10psi、15min。
1.3微载体培养
用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液,细胞计数后按3×105个/ml的密度接种到细胞培养袋中进行培养。培养的方法参数为:微载体浓度为3g/L、DO值50%、温度37℃﹑摆动角度7°、摆动速度16次/min。在培养过程中监控细胞培养袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的产生,同时在不同的节点上细胞计数(Cytodex1上的细胞计数先用PBS漂洗2次,经0.1%结晶紫的柠檬酸溶液染色,用血球计数板计数细胞核),当细胞的密度达到1×106-2×106个/ml时开始灌注,依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2个工作体积的速度,以维持细胞的生成。
2病毒液的增殖
当细胞培养到达第四天时沉降微载体,排出细胞培养袋中液体,加入PBS洗涤细胞,重复洗涤3次,加入病毒维持液并接种猪流行性腹泻病毒(PEDV),其中病毒接种剂量为5%、病毒增值的培养基为含2%血清的MEM,pH值7.4,温度35℃。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体,用显微镜观察细胞病变情况,并检测样品TCID50,当微载体上的细胞大部分脱落,停止培养,收获病毒液,于-40℃冻融三次,得到猪流行性腹泻病毒(PEDV)液。
3病毒含量的测定
利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时,以MEM培养液将培养得到的PEDV液作连续10倍稀释,即10-1、10-2……10-8,每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中,随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的Vero细胞悬液,每孔100μL(细胞含量以3×105/ml左右为宜),每个稀释度作8个重复,并设正常细胞培养对照,置5%CO2培养箱中,37℃培养,逐日观察细胞病变和对照,共观察2~5日,并记录细胞病变的孔数,按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶培养的PEDV液进行TCID50测定。以此作为对照组。
实验结果见表1,表1的结果表明,利用生物反应器培养的PEDV液病毒含量不小于转瓶培养的PEDV液病毒含量。由此可见利用生物反应器培养的病毒要优于转瓶培养的病毒。
表1 PEDV含量
4病毒接种量的确定
分别选择1%、2%、3%、4%、5%病毒量接种,培养结束后,分别对含毒细胞培养液的病毒含量进行测定,以确定最佳病毒接种量。
实验结果见表2,从表2可以看出,当病毒种量为5%时,测繁殖后的病毒含量最高,因此选择接种5%的病毒量培养病毒,病毒含量最高。
表2不同病毒接种量繁殖结果
病毒含量(%) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
TCID50/0.1ml | 106.2 | 106.6 | 107.0 | 107.0 | 107.6 |
5病毒液灭活
PEDV病毒液按总量的0.15%加入甲醛溶液,振摇5分钟后置37℃下灭活24h,期间振摇2次,每次3分钟。灭活液于2~8℃保存。
6疫苗的配制
将灭活检验合格的病毒液与等量的含量为20%的灭菌氢氧化铝胶盐水稀释液均匀混合,在室温下沉淀24小时,即制成猪流行性腹泻灭活疫苗。
实验例1细胞接种密度、微载体含量、摇动条件的优化实验
正交试验影响因子与水平的确定:选择对猪流行性腹泻细胞生长影响较大的细胞接种密度、微载体含量和摇动条件作为考察对象,经过实验摸索确定相关水平,并运用极差分析法进行数据处理。
表3
采用6因子,5水平的正交试验L25(56),共需25项试验。
表4
极差分析表明A>B>C;从表2可以看出当A3B2C4组合时为最佳组合,即当细胞接种密度为3×105、微载体含量为3g/L、摇动条件为7°、16 rpm,细胞含量最高,达到2.96×107个/ml。
实验例2 猪流行性腹泻灭活疫苗的安全性试验
1、供试疫苗:按照实施例1制备的猪流行性腹泻灭活疫苗的方法制备3批疫苗,批疫苗分别作安全性试验。
2、实验方法及结果
取PEDV抗体阴性母猪产的3日龄哺乳仔猪10头,于后海穴(即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位)注射疫苗(进针深度约为0.5cm,进针时保持与直肠平行或稍偏上),其中2头,各注射2头份(2ml);其余8头,各注射1头份(1ml),观察14日。
经14d观察均无异常临床反应。试验结果证明,本发明的灭活疫苗安全性良好。
实验例3 猪流行性腹泻灭活疫苗免疫原性实验
一、疫苗
1、供试疫苗:实施例1制备的猪流行性腹泻灭活疫苗;
2、对照疫苗:转瓶生产的猪流行性腹泻灭活疫苗。
二、实验方法
取TGEV抗体阴性母猪产的3日龄哺乳仔猪15头,分为3组,Ⅰ组于后海穴(即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位)注射供试疫苗(进针深度约为0.5cm,进针时保持与直肠平行或稍偏上)1ml;Ⅱ组注射转瓶疫苗1ml; Ⅲ组为空白对照组。于免疫后14d所有仔猪以10-4稀释的猪流行性腹泻病毒强毒口服攻毒,观察7日。结果见表5。
从结果可以看出,接种疫苗猪于接种后14日,反应器疫苗和转瓶疫苗均能产生抗体应答反应,但反应器疫苗产生中和抗体效价较转瓶疫苗的高,反应器疫苗的保护率要高于转瓶疫苗。由此可以看出,反应器培养的猪流行性腹泻灭活疫苗的免疫效果要好于传统转瓶生产的疫苗。
表5疫苗对仔猪保护试验比较
综上所述,本发明所制备的灭活疫苗对于猪有良好的免疫保护效果,且本发明灭活疫苗的免疫保护效力要显著优于传统转瓶制备的灭活疫苗对猪的免疫保护效力。发明的PEDV生产方法,体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势,与传统的转瓶培养工艺相比,抗原效价提高显著,而且产品质量均一;生产工艺简化,操作简单,提高了生产效率,降低了生产成本。
Claims (8)
1.一种猪流行性腹泻灭活疫苗的生产方法,包括:(1)细胞的培养:将细胞接种到细胞培养袋中的微载体上,加入细胞培养基,摇动细胞培养袋培养细胞;(2)病毒液的增殖:沉降微载体,洗涤培养的细胞,接种猪流行性腹泻病毒毒种,加入病毒增殖培养基培养细胞,收获病毒液;(3)将病毒液灭活后,乳化,得到猪流行性腹泻灭活疫苗;其中,将细胞按照3×105个/ml的接种密度接种到细胞培养袋中的微载体上。
2.按照权利要求1所述的生产方法,其特征在于:所述的细胞是Vero细胞。
3.按照权利要求1所述的生产方法,其特征在于:细胞培养袋中的微载体含量为3g/L。
4.按照权利要求1或3所述的生产方法,其特征在于:所述的微载体是Cytodex-1。
5.按照权利要求1所述的生产方法,其特征在于:所述摇动细胞培养袋培养细胞的摇动培养条件为摆动角度为7°、摆动转速为16rpm。
6.由权利要求1-5任何一项所述方法制备得到的猪流行性腹泻灭活疫苗。
7.权利要求7所述的猪流行性腹泻灭活疫苗在制备预防或治疗由猪流行性腹泻病毒所导致疾病药物中的用途。
8.一种预防或治疗由猪流行性腹泻病毒所导致疾病的药物组合物,其特征在于:含有预防或治疗上有效量的权利要求6所述的猪流行性腹泻灭活疫苗。
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