CN104232564A - 一种st细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基。

Description

一种ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配制和使用方法，更具体的，涉及一种用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基。 

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，它具有高度的传染性和致死性，给养猪业造成了严重的经济损失。目前，接种猪瘟疫苗是控制猪瘟的重要手段。用于制备猪瘟疫苗的细胞有ST细胞、PK-15细胞、SK-6细胞及MPK细胞等。 

猪瘟疫苗的生产工艺目前主要是转瓶培养，进行大规模生产时：(1)需要大量的人力物力，生产效率较低，生产成本较高；(2)转瓶内的培养条件无法做到及时调整，无法确保细胞处在最佳生长状态，获得的细胞密度及猪瘟病毒滴度较低；(3)转瓶中的细胞碎片及杂蛋白多，导致各批次疫苗产品的均一性较差，质量不稳定。 

采用生物反应器的微载体培养细胞制备猪瘟疫苗的研究越来越多。通过生物反应器的灌流培养方式可以实现大规模高密度培养动物细胞。为达到良好的培养效果，生物反应器的参数设置和所选培养基的成分是其中的重要因素。通常生长及维持培养基中通常需要加入10％-20％的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支持蛋白。但是，动物血清也有其明显的缺点：成分不明确，产品批间差异不易控制，价格昂贵，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病毒等。目前，针对生物反应器大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基的研究尚未见报道。 

发明内容

本发明提供了一种适用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法。使用本发明所述的培养基，使ST细胞的大规模高密度培养在低血清浓度条件下进行。接种猪瘟病毒后，使用本发明所述的无血清、低蛋白的培养基用来维持病毒在培养液中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使ST细胞可高效的贴附在微载体上，细胞生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-7d内达到极高密度；接种猪瘟病毒后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液12-17d。 

本发明所述的一种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其组成成分及重量份为： 

上述培养基的组成成分及重量份优选为： 

上述培养基，在使用前加入2％-5％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在大规模高密度培养ST细胞的培养液。 

本发明的一种大规模高密度培养得到ST细胞接入猪瘟病毒后，维持病毒感染时期的培养基，其组成成分及重量份为： 

上述培养基的组成成分及重量份优选为： 

上述培养基还包含如下成分及其重量比例： 

上述培养基包含的添加成分，其重量份的优选比例为： 

所述大规模高密度培养ST细胞所用的生物反应器可使用本领域常用的内部结构支持使用载体的各类生物反应器，例如德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器生物反应器，杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州齐志公司生物反应器。优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器。 

所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA，PGA，多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodexl球形微载体。 

所述ST细胞培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：37℃，溶氧DO为30-60％，按比例通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.0L/min，转速为80rpm。 

接种猪瘟病毒液，使用病毒液维持培养基时，培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：36℃，溶氧DO为40-70％，通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.2L/min，转速为80rpm。 

本发明的有益效果在于：本方法所述的培养基及其使用方法，在生物反应器中大规模高密度的培养ST细胞时使用低浓度血清，在接种猪瘟后，使用无血清、低蛋白的培养基维持病毒增殖，不仅可以有效地减少动物源血清可能带来的风险，而且可显著降低杂蛋白对最终产品的干扰，提高产品的稳定性，同时可在较短时间内，通过灌流培养生产大量的滴度高的病毒液，极大地降低了生产成本，提高了生产效率。 

本方法所述的培养基及其使用方法，适用于制备针对各种猪瘟病毒株的猪瘟疫苗。 

附图说明

图1为ST细胞培养的生长曲线对比图。 

图2为接种猪瘟病毒后病毒滴度曲线对比图。 

具体实施方式

材料与设备 

1材料 

1)MEM培养基，DMEM培养基，GIBCO公司 

2)胎牛血清，GIBCO公司 

3)Cytodexl球形微载体，GE公司 

2主要设备 

1)生物反应器：德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick14L生物反应器(工作体积10L) 

2)二氧化碳培养箱，日本三洋公司 

3)高速离心机，Beckman公司 

4)超速离心机，Beckman公司 

5)4℃和-20℃冰箱，日本三洋公司 

6)分光光度计，德国Eppendorf(艾本德)公司 

生产过程主要参数 

以下实施例在实施过程中的主要参数均设置为同样数值，仅在培养基的使用上有所区别，具体成分见实施例1，实施例2，实施例3，实施例4，实施例5。 

1灭菌和预处理 

按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用Cytodexl微载体进行浸泡和灭菌准备。按15g/L培养基加入微载体，每台14L生物反应器(工作体积10L)加入150g经预处理的Cytodexl微载体。 

2ST细胞培养的条件是本领域中常规技术的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。细胞接种密度为8×10⁵cells/mL。在全部实施例中，ST细胞大规模培养时的参数设置为：温度37℃，溶氧DO为40％，按70％，20％，5％，5％的比例分别通入空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.0L/min，转速为80rpm。 

3以灌流方式培养ST细胞6天。用台盼蓝法检测细胞浓度和活性。将生物反应器中的培养基更换为病毒液维持培养基，具体成分见实施例1，实施例2，实施例3，实施例4，实施例5。按照合适的比例接种猪瘟病毒液。培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。在全部实施例中，接入猪瘟病毒液后的参数设置为：温度36℃，溶氧DO为55％，按47％，45％，7％，1％的比例分别通入空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.2L/min，转速为80rpm。 

4以灌流方式维持病毒液15天，将15天内收集得到的全部病毒液经β-丙内酯灭活，纯化，稀释，加入佐剂，制成猪瘟疫苗。 

实施例1 

使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基中加入2％的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 

使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重量份的比例如下： 

实验结果见表1，表2中“实施例1”的数据。 

实施例2 

使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基中加入2％的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 

使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重量份的比例如下： 

实验结果见表1，表2中“实施例2”的数据。 

实施例3 

使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基中加入2％的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 

使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重量份的比例如下： 

实验结果见表1，表2中“实施例3”的数据。 

实施例4 

使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基中加入2％的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 

使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，维持病毒增殖的培养液，其重量份的比例如下： 

实验结果见表1，表2中“实施例4”的数据。 

实施例5 

使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基中加入2％的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 

使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下： 

在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重量份的比例如下： 

实验结果见表1，表2中“实施例5”的数据。 

在同样条件下，使用本发明所述生长培养基与普通市售MEM、DMEM培养基+10％胎牛血清的细胞生长曲线对比如表1： 

表1ST细胞生长曲线对比表 

                                          单位：10⁵cells/mL 

在同样条件下，接种猪瘟种毒液后，使用本发明所述维持病毒增殖的培养基与普通市售MEM、DMEM+2％FBS有血清培养基的病毒滴度对比如表2： 

表2猪瘟液滴度对比表 

                                          单位：TCLD₅₀/ml 

Claims (10)

1.一种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其特征在于，培养基的组成成分及重量份为：

2.如权利要求1所述的大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其特征在于，上述培养基的组成成分及重量份优选为：

3.如权利要求1或2所述的培养基，使用前加入2％-5％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成大规模高密度培养ST细胞的培养液。

4.一种大规模高密度培养得到ST细胞并接入猪瘟病毒后，维持病毒感染时期的培养基，其特征在于，培养基的组成成分及重量份为：

5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，上述培养基的组成成分及重量份优选为：

6.如权利要求4或5所述的培养基，其特征在于，上述培养基还包含如下成分及其重量比例：

7.如权利要求6所述的培养基，其特征在于，上述培养基包含的添加成分，其重量份的优选比例为：

8.一种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养方法，其特征在于，使用权利要求1-3所述的培养基，在生物反应器中以灌流培养的方式大规模高密度培养ST细胞；使用权利要求4-7所述的培养基，接种猪瘟病毒种毒液，以灌流培养的方式维持猪瘟病毒的增殖，直到收获病毒液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，使用本方法所述的培养基和低浓度的血清，在生物反应器中大规模高密度的培养ST细胞；在接种猪瘟病毒后，使用本方法所述的无血清、低蛋白的培养基维持病毒增殖。

10.如权利要求9所述的方法，其特征还在于，适用于制备针对各种猪瘟病毒株的猪瘟疫苗。