CN109517800A - 一株补强胆固醇内源性合成的重构st细胞及其构建方法和用途 - Google Patents

一株补强胆固醇内源性合成的重构st细胞及其构建方法和用途 Download PDF

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    • C12N2770/24351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/24352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及细胞株的改造、构建领域，更为具体的说是涉及一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞及其构建方法和用途。该细胞株于2018年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.16694。本发明公开的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株能够在无血清培养基培养条件下正常代谢生长。经实验，其与含有10％血清条件下正常培养的ST细胞胞内总胆固醇含量无显著性差异，这为无血清培养条件下相关病毒增殖奠定了基础。同时，以猪瘟病毒为例，该重构ST细胞的病毒增殖效价远高于非重构的原始ST细胞。

Description

一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞及其构建方法和 用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及细胞株的改造、构建领域，更为具体的说是涉及一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞及其构建方法和用途。
背景技术
ST细胞即猪睾丸细胞(swine testis)是目前用于猪瘟病毒(classical swinefever virus,CSFV)细胞毒疫苗生产的主要生产细胞株。
一般的，ST细胞是在含有10％牛血清的营养条件下通过贴壁培养的方式培养，接毒后的病毒增殖液中仍然含有2～3％的牛血清。由于牛血清中可能含有牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗原以及抗体，而该抗原及抗体会直接影响CSFV疫苗的质量以及产量，所以无血清培养技术在ST细胞培养领域具有重要的意义和应用前景。
胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物，在动物组织、细胞中是不可缺少的重要物质，不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。在细胞膜结构中，有一种特化的脂质结构，富含鞘脂及胆固醇，与各种蛋白质一起形成脂筏结构。这类脂筏结构选择性富集的各类蛋白质多为重要的信号分子和免疫受体，在膜运输、细胞增殖迁移、病毒侵染、病毒组装、病毒释放等各种生理、病理活动中起到关键作用。
因此，对于体外培养的动物细胞来说，保证胞内胆固醇的含量是保证动物细胞病毒增殖等功能的重要因素。
但是，在无血清的培养条件下，仅添加外源脂溶性的胆固醇，细胞利用率并不高。因此，在现有技术中本领域的技术人员在实际培养过程中还需要在培养基中添加各种脂蛋白，以及脂类复合物等等，这无疑会造成培养基成本的进一步提高。
我们知道，对于体外培养的动物细胞，胞内胆固醇的来源有两种，第一种是由细胞表面受体介导的血清中低密度脂蛋白复合物的摄取，通过携带血清中外源胆固醇进入胞内，并在胞内完成酯化储存或参与生理代谢活动；第二种来源是细胞自身的胆固醇从头合成途径，从最简单的中间代谢产物乙酰辅酶A开始，自主合成内源性胆固醇。
基于上述理论基础，发明人提出采用基因工程方法对动物细胞，特别是ST细胞的胆固醇胞内从头合成途径进行补强重构，从而提高ST细胞在无血清培养条件下内源性胆固醇合成，这对于ST细胞无血清培养中细胞培养、病毒增殖具有重要的意义，同时，对于无血清ST细胞培养技术的推广也具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供这一补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞的构建方法。
本发明所要解决的最后一个技术问题是提供这一补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞的具体的应用领域和方式。
为了解决本发明所要解决的第一个技术问题，本发明公开了一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞，该细胞株于2018年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.16694，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：ST-cholesterol细胞。
该补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株可过表达猪HMGCoAR、ACLY、MVK和LSS这4种蛋白质。
该补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞的构建方法包括以下步骤：
(1)分别构建含有不同编码基因的真核表达载体；
(2)筛选目标细胞克隆；
(3)敲除标签蛋白；
获得具有补强胆固醇内源性合成效果的重构ST细胞；
其中步骤(1)中是指构建含有HMGCoAR编码基因、ACLY编码基因、MVK编码基因和LSS编码基因。
进一步优选的，所述步骤(1)中构建的真核表达载体为pHMGCoAR-MVK-RFP-Neor和pLSS-ACLY-GFP-Puror。
其中RFP为红色荧光蛋白，GFP为绿色荧光蛋白；Neor为新霉素抗性基因，Puror为潮霉素抗性基因。
最后，本发明还公开了该补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株的应用。
其应用一是，该重构ST细胞株在无血清细胞培养中的应用。
其应用二是，该重构ST细胞株在CSFV增殖中的应用。
进一步的，是指重构ST细胞株在无血清条件下进行CSFV增殖中的应用。
本发明公开的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株能够在无血清培养基培养条件下正常代谢生长。经实验，其与含有10％血清条件下正常培养的ST细胞胞内总胆固醇含量无显著性差异，这为无血清培养条件下相关病毒增殖奠定了基础。同时，以猪瘟病毒为例，该重构ST细胞的病毒增殖效价远高于非重组的正常ST细胞。
附图说明
图1为猪HMG-CoA reductase和MVK双表达载体示意图。
图2为猪LSS和ACLY双表达载体示意图。
图3为重构ST细胞的无血清单细胞悬浮生长形态图。
图4为重构ST细胞及原始ST细胞的胞内总胆固醇含量比较结果示意图。
图5为无血清条件下重构ST细胞与原始ST细胞的CSFV增殖比较结果示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1重组表达载体的构建
根据GenBank中猪HMGCoAR(Genbank,NM_001122988.1)，ACLY(Genbank,NM_001257276.1)，MVK(Genbank,XM_001929184.6)，LSS(Genbank,NM_021082500.1)的编码序列，设计用于扩增各基因ORF序列的引物，具体如表1所示：
表1：四种蛋白编码序列的扩增引物
以猪肝脏cDNA文库为模版，经PCR反应扩增出上述HMG-CoA reductase、MVK、ACLY、LSS的完整ORF片段后，按照图1和图2设计，将HMG-CoA reductase、MVK的ORF片段克隆至表达载体中，该载体pHMGCoAR-MVK-RFP-Neor具备红色荧光蛋白及新霉素抗性。将LSS、ACLY的ORF片段克隆至表达载体中，该载体pLSS-ACLY-GFP-Puror具备绿色荧光蛋白及潮霉素抗性。
PCR反应条件：
实施例2重构ST细胞株的筛选及细胞定型
接种初始细胞密度为1×106cells/ml的ST细胞于6孔板中培养过夜。转染前培养基更换为Opti-MEM培养基(购自Invitrogen公司)孵育10分钟。将100ulPEI试剂(购自Sigma公司)加入至1ml的Opti-MEM中混匀，将1～10ug的pHMGCoAR-MVK-RFP-Neor、pLSS-ACLY-GFP-Puror载体加入至1ml的Opti-MEM中混匀，室温下孵育5分钟。孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PEI-DNA转染复合物。采用逐滴加入的方式将上述2ml转染复合物(PEI-DNA转染复合物)加入至6孔板中的ST细胞中进行转染。转染后8小时，去除转染复合物(PEI-DNA转染复合物)，更换成ST细胞的正常培养基继续培养24小时。
转染后72小时的ST细胞经消化分散、离心回收以及PBS清洗后用于流式细胞仪的细胞分选。分选前细胞经无菌600目筛网过滤后上流式细胞仪进行分选操作，将同时带有绿色荧光和红色荧光的细胞分选至24孔板中。细胞培养基中添加10ug/ml潮酶素和14ug/ml新霉素。经连续传代培养10代，获得转染成功的重组ST细胞。
利用CRISPR/Cas9系统将重组表达4种蛋白质的ST细胞中的荧光及抗性编码序列敲除。将pCAG-Cas9载体、sgRNA-1载体、sgRNA-2载体、sgRNA-3载体(其中sgRNA载体的构建引物如表2)转染至重组ST细胞中，转染后24小时经消化分散、离心回收以及PBS清洗后用于流式细胞仪的细胞分选。收集没有绿色和红色荧光的重组ST细胞至24孔板中，做连续传代培养，敲除荧光及抗性编码序列的重构ST细胞作为最终细胞，并冻存保藏。
表2：识别GFP、RFP敲除位点的sgRNA载体构建引物
编码序列 F-引物序列(上游引物序列) R-引物序列(下游引物序列)
sgRNA-1： caccgtgtgcagctcctccacgcgg aaacccgcgtggaggagctgcacac
sgRNA-2： caccgcaccaggtgcgcggtccttc aaacgaaggaccgcgcacctggtgc
sgRNA-3： caccggccaagctgaaggtgaccaa aaacttggtcaccttcagcttggcc
实施例3重构ST细胞株在无血清培养条件下生长驯化以及胞内总胆固醇含量测定
重构ST细胞复苏培养及恢复生长后更换为无血清培养基培养，并更换培养方式从贴壁静置培养转变为振荡悬浮培养。经连续悬浮培养适应传代10代、30代后用于测定胞内总胆固醇含量，以正常含有10％血清培养的原始ST细胞、无血清培养条件下的原始ST细胞(ST SFM)作为检测对照。重构ST细胞在无血清培养液中单细胞悬浮生长形态如图3所示，胞内总胆固醇含量检测结果如图4所示，其中ST cells为正常含有10％血清培养的原始ST细胞，ST SFM为在无血清培养条件下的原始ST细胞，rST SFM P10为重构ST细胞在无血清悬浮培养条件下第10代细胞，rST SFM 30为重构ST细胞在无血清悬浮培养条件下第30代细胞。重构ST细胞在无血清悬浮培养条件下第10代，其胞内胆固醇含量可达到0.549umol/mgprotein，第30代胞内胆固醇含量达到0.688umol/mg protein。可以看出，重构ST细胞与在10％血清条件下正常培养的ST细胞比较，胞内总胆固醇含量无显著性差异，说明经过胆固醇从头合成途径补强改造后，重构ST细胞可以在无血清条件下正常代谢生长，为相关病毒增殖奠定基础。
实施例4悬浮生长的重构ST细胞株在无血清条件下增殖CSFV的效果测定
重构ST细胞在无血清条件下进行CSFV的增殖，以无血清培养条件下的原始ST细胞作为增殖对照，CSFV效价以间接免疫荧光方法进行检测。实验结果如图5所示，其中ST-SFM为原始ST细胞，rST-SFM为重构ST细胞。由图5可以看出重构ST细胞悬浮增殖的CSFV除第一批次病毒增殖效价与对照原始ST细胞无显著差异外，第2批～第5批的CSFV增殖效价均显著高于对照细胞。而对照原始ST细胞仅能进行3个批次的CSFV增殖，且病毒增殖效价水平远低于重构ST细胞的增殖水平。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞及其构建方法和用途
<130> 201810259
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctcgagac cgccatgttg tcaagactct tccg 34
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggaattctc aagctgcctt cttagtgc 28
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggatccac cgccatgttg tctcaagtcc tgct 34
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtctagact aggggcccag ttccaccc 28
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggatccac cgccatgtcg gccaaggcga tttc 34
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtctagatt acatgctcat gtgttccg 28
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctcgagac cgccatgacc gagggcacgt gtct 34
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggaattctc aagggcagcc ggcgaggg 28
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caccgtgtgc agctcctcca cgcgg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacccgcgt ggaggagctg cacac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccgcacca ggtgcgcggt ccttc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaacgaagga ccgcgcacct ggtgc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caccggccaa gctgaaggtg accaa 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacttggtc accttcagct tggcc 25

Claims (8)

1.一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞，该细胞株于2018年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16694。
2.根据权利要求1所述的一株补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞，其特征在于：所述补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株中过表达猪HMGCoAR、ACLY、MVK和LSS这四种蛋白。
3.权利要求1或2所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞的构建方法包括以下步骤：
(1)分别构建不同编码基因的真核表达载体；
(2)筛选目标细胞克隆；
(3)敲除标签蛋白；
从而获得具有补强胆固醇内源性合成效果的重构ST细胞；
其中步骤(1)中是指构建含有HMGCoAR编码基因、ACLY编码基因、MVK编码基因和LSS编码基因。
4.根据权利要求3所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中构建的真核表达载体为pHMGCoAR-MVK-RFP-Neor和pLSS-ACLY-GFP-Puror。
5.权利要求1或2所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株在无血清细胞培养中的应用。
6.权利要求1或2所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株在CSFV增殖中的应用。
7.根据权利要求6所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株在CSFV增殖中的应用，其特征在于：重构ST细胞株在无血清条件下进行CSFV增殖中的应用。
8.根据权利要求5或7所述的补强胆固醇内源性合成的重构ST细胞株在CSFV增殖中的应用，其特征在于：重构ST细胞为单细胞悬浮生长状态。
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CN114958757A (zh) * 2020-12-22 2022-08-30 江苏省农业科学院 能够稳定表达TreT的重组ST细胞及其构建方法和应用
CN114958757B (zh) * 2020-12-22 2023-10-24 江苏省农业科学院 能够稳定表达TreT的重组ST细胞及其构建方法和应用

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