CN116769832B - 一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法，包括以下步骤：细胞培养：取密度为7‑9×106cells/ml的传代细胞培养液，离心，重悬细胞，重悬后的细胞密度为4.8‑5.6×105cells/ml，培养44‑52h；细胞转染：取培养后的细胞悬液，分别向其中添加质量体积比为1:3‑1:6的质粒DNA和PEI溶液，质粒DNA的添加量为0.6‑1.5μg DNA/106cells，PEI溶液浓度为0.5‑1.5mg/ml。本发明在细胞接种阶段进行细胞的重悬换液，提高细胞接种密度，在接种后48小时左右，直接转染，无需换液，降低培养基消耗；调整DNA:PEI的转染比例，使目标蛋白表达量明显提高。
Description
技术领域
本发明属于基因转染的技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法。
背景技术
瞬时转染（transient transfection）是将外源DNA导入真核细胞一种方式，在瞬时转染中，外源DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。相比稳定转染，转染的外源DNA不必整合到宿主染色体，操作简易，周期短。CHO瞬时表达系统在2~3周内即可获得毫克到克级的蛋白，在抗体药物的早期研发，毒理样品制备中有广泛的应用。同时在突发的传染性疾病发生时，CHO瞬时表达系统也可在短期内快速大量的生产中和抗体。
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是目前工业化、大规模瞬时转染表达重组蛋白使用最广泛的转染试剂，PEI 能将 DNA 包裹成带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。通过调整转染时PEI和DNA的比例，可以提高转染效率。
当前的瞬时转染方法，都在转染前3~4天接种细胞，使其在转染当天长至目标密度（约8×106cells/ml），然后离心用新鲜培养基重悬细胞至转染所需的密度（约4×106cells/ml），以去除影响转染效率的细胞代谢产物。如果需要做50L规模的转染，那么需要在转染当天完成25L细胞培养液的离心及重悬，这极大的限制了瞬时转染规模的扩大，是整个生产流程中最耗时耗力的。
发明内容
本发明的目的，是提供一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法。本发明通过尝试不同的细胞培养工艺，调整PEI用量，摸索出了一种在转染前无需重悬更换大量培养基的CHO细胞瞬时转染方法，同时优化了转染时PEI和DNA的比例，使蛋白表达量得到了提升。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法，包括以下步骤：
S1：细胞培养：取密度为7×106-9×106cells/ml的传代细胞培养液，离心，向离心后的细胞沉淀中加入新鲜培养基重悬细胞，使重悬后的细胞密度为4.8×105-5.6×105cells/ml，培养44-52 h；
S2：细胞转染：取S1中培养44-52 h后的细胞悬液，分别向其中添加质粒DNA和PEI溶液，所述质粒DNA的添加量为0.6-1.5 μg DNA/106 cells，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:3-1:6（这里的质量比指mg/mg），所述PEI溶液中PEI的浓度为0.5-1.5mg/ml，转染后进行细胞培养。
作为优选实施方式，在所述S2步骤之后还包括，
S3：分别在细胞转染后培养的第3天、第7天添加补料培养基；
S4：转染后的细胞持续培养9-11天，然后取细胞上清并检测目的蛋白的表达量。
作为优选实施方式，在S2步骤中，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:4-1:6。
作为优选实施方式，在S2步骤中，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:5。
作为优选实施方式，所述S1的步骤为：
细胞培养：取密度为7.9×106cells/ml的传代细胞培养液，离心，向离心后的细胞沉淀中加入新鲜培养基重悬细胞，使重悬后的细胞密度为5.2×105cells/ml，培养48 h。
作为优选实施方式，所述S2的步骤为：
细胞转染：取S1中培养48 h后的细胞悬液，分别向其中添加质粒DNA和PEI溶液，所述质粒DNA的添加量为1 μg DNA/106 cells，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:5，所述PEI溶液中PEI的浓度为1mg/ml，转染后进行细胞培养。
作为优选实施方式，所述细胞为CHO细胞。
作为优选实施方式，所述细胞的培养基为：CD-CHO培养基中添加3.5-4.5mM谷氨酰胺的培养基。
作为优选实施方式，所述细胞的培养基为：CD-CHO培养基中添加4mM谷氨酰胺的培养基。
作为优选实施方式，所述质粒选自以pcDNA3.0为载体构建的表达帕妥珠单抗的质粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1. 本发明在细胞接种阶段进行细胞的重悬换液，同时提高细胞接种密度，让细胞在接种后48小时左右即到达转染所需密度，然后直接进行转染，无需重悬换液。
2. 本发明提供的方法，大大降低培养基的消耗。以重悬前细胞密度8.0×106cells/ml，转染细胞目标密度4.0×106cells/ml，转染50L为例，现有方法需要在转染当天进行25L细胞的重悬换液；而使用本发明的方法，仅需要在接种当天进行3.25L细胞的重悬换液，重悬体积仅为现有方法的约八分之一，大大降低了工作量，解决了CHO细胞瞬时转染规模扩大过程中的最大制约因素。另外，现有方法在接种阶段消耗培养基25L，转染阶段消耗培养基50L，一共消耗培养基75L，采用本发明的方法仅在接种阶段消耗培养基50L，培养基消耗减少了三分之一。
3. 本发明通过调整DNA:PEI的转染比例，发现适合本发明转染工艺方法的最佳DNA:PEI比例，使目标蛋白表达量得到明显提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
本发明实施例中采用的CHO细胞是驯化后的无血清培养基培养的悬浮细胞，所用CHO细胞系为CHO-K1。所用的质粒为以pcDNA3.0为载体构建的表达帕妥珠单抗的质粒。
实施例1：细胞传代及扩增
取1L细胞摇瓶，加入283.2mL CD-CHO+4mM谷氨酰胺的培养基，再加入16.8mL细胞密度为8.2×106cells/ml的CHO-K1传代细胞，细胞传代密度4.6×105cells/ml，于36.5℃、6% CO2 、225rpm摇床中培养3天。3天后用Vi-Cell细胞计数仪测得细胞密度为7.9×106cells/ml，按以下三组进行传代扩增培养：
（1）对照组：取1L细胞摇瓶，加入275.5mL CD-CHO+4mM谷氨酰胺的培养基，再加入17.5mL细胞密度7.9×106cells/ml的传代细胞，细胞接种密度4.6×105cells/ml，于36.5℃、6% CO2、225rpm摇床中培养3天。
（2）对照组3：取19.7mL密度为7.9×106cells/ml的传代细胞接种于1L摇瓶，加入280mL新鲜的CD-CHO+4mM谷氨酰胺培养基使细胞密度为5.2×105cells/ml，36.5℃、6% CO2、225rpm摇床中培养2天。
（3）实验组：取30mL密度为7.9×106cells/ml的传代细胞于50mL离心管，200g室温离心5分钟，然后用新鲜的CD-CHO+4mM谷氨酰胺的培养基455.8mL重悬细胞，使细胞密度为5.2×105cells/ml，取300mL重悬后的细胞于1L细胞摇瓶，36.5℃、6% CO2 、225rpm摇床中培养2天。
实施例2：细胞转染
1、细胞转染前准备
转染当天，用Vi-Cell细胞计数仪测得实施例1中对照组培养3天后的细胞密度为8.3×106cells/ml，实施例1中对照组3培养2天后的细胞密度为4.0 ×106cells/ml，实施例1中实验组培养2天后的细胞密度为4.1×106cells/ml；按以下四组进行待转染细胞准备：
（1）对照组1：取144.6mL对照组的细胞分装于50mL离心管，200g室温离心5分钟，然后用新鲜的CD-CHO+4mM谷氨酰胺的培养基300mL重悬细胞于1L摇瓶，使细胞密度为4.0×106cells/ml；各取100mL细胞悬液于两个300mL摇瓶，待转染。
（2）对照组2：144.6mL对照组的细胞于1L摇瓶，加入155.4mL新鲜的CD-CHO+4mM谷氨酰胺的培养，使细胞密度为4.0×106cells/ml；各取100mL细胞悬液于两个300mL摇瓶，待转染。
（3）对照组3：各取100mL对照组3中的细胞悬液于两个300mL摇瓶，待转染。
（4）实验组：各取100mL实验组中的细胞悬液于两个300mL摇瓶，待转染。
2、细胞转染
对照组1-3和实验组，均采用相同的工艺进行转染，其中，转染用质粒DNA的浓度为100μg/mL, 用量为1 μg DNA/106 cells; 转染用PEI的浓度为1mg/mL；对照组1-3和实验组都分别用质粒DNA:PEI质量比为1:3(w/w)和1:5(w/w)两种比例进行转染，具体操作如下：
2.1 向上述对照组1-3和实验组的各含100ml待转染细胞（细胞密度约为4.0×106cells/ml）的两个摇瓶中，共8瓶待转染细胞，分别滴加4 mL浓度为100μg/mL的 DNA溶液，边滴加边轻轻摇晃细胞；
2.2 向上述2.1步骤中对照组1-3和实验组的各两摇瓶的任意一瓶中 ，分别滴加1.2mL(DNA:PEI=1:3(w/w)) 浓度为1mg/mL的PEI溶液；再分别向上述各组的剩余一摇瓶中滴加2mL（DNA:PEI=1:5(w/w)）浓度为1mg/mL的PEI溶液，边滴加边轻轻摇晃细胞；
2.3将转染后的细胞放入36.5℃、6% CO2、110rpm的摇床中培养，于转染后3天，7天进行补料，转染后第10天取细胞上清进行帕妥珠单抗表达量检测。
实施例3：蛋白表达量检测
分别取各实验组和对照组1-3的细胞上清500uL，12000g离心10分钟后，用0.22um针头滤器过滤，然后用HPCL-proA方法检测帕妥珠单抗蛋白表达量。
表1
帕妥珠单抗蛋白表达量结果如表1所示，在接种和转染阶段均不进行离心换液的对照组2和对照组3，其表达量显著低于在转染阶段进行离心换液的对照组1和在接种阶段进行离心换液的实验组。
当DNA:PEI转染比例为1:3（w/w）时，采用本发明的方法进行转染的实验组的表达量与现有方法中在转染阶段进行离心换液的对照组1的表达量相当；当DNA:PEI转染比例调整至 1:5（w/w）时，采用本发明方法进行转染的实验组表达量提高了17.2%，而对照组1的表达量无明显变化。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (7)
1.一种哺乳动物细胞的瞬时转染方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：细胞培养：取密度为7×106-9×106cells/ml的传代细胞培养液，离心，向离心后的细胞沉淀中加入新鲜培养基重悬细胞，使重悬后的细胞密度为4.8×105-5.6×105cells/ml，培养44-52 h；
S2：细胞转染：取S1中培养44-52 h后的细胞悬液，分别向其中依次添加质粒DNA和PEI溶液，所述质粒DNA的添加量为0.6-1.5 μg DNA/106 cells，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:5，所述PEI溶液中PEI的浓度为 0.5-1.5 mg/ml，转染后进行细胞培养；
S3：分别在细胞转染后培养的第3天、第7天添加补料培养基；
S4：转染后的细胞持续培养9-11天，然后取细胞上清并检测目的蛋白的表达量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1的步骤为：
细胞培养：取密度为7.9×106cells/ml的传代细胞培养液，离心，向离心后的细胞沉淀中加入新鲜培养基重悬细胞，使重悬后的细胞密度为5.2×105cells/ml，培养48 h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2的步骤为：
细胞转染：取S1中培养48 h后的细胞悬液，分别向其中依次添加质粒DNA和PEI溶液，所述质粒DNA的添加量为1 μg DNA/106 cells，所述质粒DNA和PEI溶液的质量比为1:5，所述PEI溶液中PEI的浓度为1mg/ml，转染后进行细胞培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞的培养基为：CD-CHO培养基中添加3.5-4.5mM谷氨酰胺的培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞的培养基为：CD-CHO培养基中添加4mM谷氨酰胺的培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒选自以pcDNA3.0为载体构建的表达帕妥珠单抗的质粒。
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| A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications;Céline Raymond等;Methods;第55卷;第44-51页 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116769832A (zh) | 2023-09-19 |
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