JP2023503849A - 接種物を生産するためのプロセスおよびシステム - Google Patents

Abstract

下流の細胞生産のための接種物を生産するためのプロセスおよびシステムが開示される。接種物は、灌流バイオリアクタで生産され、灌流バイオリアクタでは、バイオリアクタ内のバイオマス濃度が増加するにつれて栄養培地の供給が増加する。バイオマスセンサは、バイオマス濃度を定期的または継続的に監視するために使用することができる。この情報は、細胞密度が増加した接種物の生成に正比例する方法で、栄養培地供給速度を自動的に増加させるためのコントローラに提供することができる。プロセスおよびシステムはまた、プロセス中に灌流バイオリアクタ内で一定の体積レベルを維持するための自動化されたサブシステムを含むことができる。【選択図】図１

Description

［背景技術］
バイオリアクタは、生物学的反応または生物学的プロセスを実験室または工業規模で実施することができる装置であり、バイオ医薬品業界で広く使用されている。バイオリアクタは、あらゆる種類のバイオ製品を生産するために使用することができる。バイオ製品としては、例えば、細胞培養物、および飲料、バイオ燃料、バイオエネルギー、生化学物質、抗生物質、アミノ酸、酵素、モノクローナル抗体、モノマー、タンパク質、食品培養物、生体高分子、アルコール、香味料、香料などといった、細胞培養物由来の材料を挙げることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細胞治療のために増殖させることができる。細胞治療とは、ｅｘ ｖｉｖｏで操作または改変された自己細胞、同種細胞、または異種細胞の投与による、ヒトの疾患または傷害の予防、治療、治癒、または軽減のことである。細胞治療の１つの目標は、損傷した組織または臓器を修復、置換、または回復することである。

細胞培養物は、典型的には、生物学的材料が反応時間の終わりまでバイオリアクタに留まるバッチプロセスにおいて増殖する。これらのプロセスのいくつかでは、バイオリアクタ内に含まれる流体培地は、流体培地内に含まれる栄養素を補充し、場合によってはプロセス中に生産される有害な副産物を除去するために、定期的または継続的に除去および再供給することができる。

上記のようにバッチリアクタで細胞培養物を増殖させる前に、最初に接種プロセスが実施される。例えば、微生物の接種物は、微生物の望ましい生細胞数を集団に提供するために必要であり、商業規模の生産に適したレベルにスケールアップするのに適している。現在、接種プロセスはバッチモードで実施されている。栄養素の制限と阻害性代謝物の蓄積により、これらの従来のプロセスで達成できる最大細胞密度には限界がある。接種プロセス中の細胞密度が小さい場合、市販のバッチリアクタにおける所要時間が長くなる可能性がある。例えば、細胞密度がより小さいバッチリアクタに供給される接種物は、タンパク質などの所望のバイオ製品を生産する代わりに、最初、かなりの時間を細胞塊の生成に費やす下流の生産バイオリアクタを必要とする。最終的には、より大型の市販のバッチリアクタ内でより長いインキュベーション時間が必要になり、プロセス全体の効率に直接影響する。

上記を考慮して、後でより大きな生産バイオリアクタに移すための、微生物の接種物を生産するための改善された方法およびシステムのニーズが存在している。生細胞数がより多くなり、接種プロセス中に細胞密度をより大きくすることができる接種物を生成する方法およびシステムに対するニーズも存在している。生産バイオリアクタに供給することができる接種物を生産し、バイオ製品を生産するために、生産バイオリアクタにおける所要時間を短縮する接種プロセスのニーズも存在している。

［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
全般的に、本開示は、培養の過程で急速に増加する細胞密度および生細胞数を生み出す接種プロセスに関する。本開示の接種プロセスおよびシステムは、全般的には、灌流速度が一定に留まるのではなく、バイオマスにおいて細胞培養物が増加するにつれて進化および増加する灌流バイオリアクタを含む。実際、自動化された方法を使用して、リアルタイムのバイオマス測定値に基づいて灌流バイオリアクタへの栄養供給速度を調整することができる。このプロセスを通じて、劇的に増加した細胞密度および／または生細胞数で接種物を生産することができる。次いで、接種物を、タンパク質などのバイオ製品を生産するためのより大きな生産バイオリアクタに供給することができる。本開示の接種プロセスおよびシステムを通じて、生産バイオリアクタに必要な時間を大幅に短縮することができ、これにより、プロセスのスループットを劇的に向上させることができる。生細胞密度に基づく以前の方法とは対照的に、生細胞体積（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ）／生物体積（ｂｉｏｖｏｌｕｍｅ）の測定に基づくと、灌流速度の制御が改善されることがわかった。

［課題を解決するための手段］
したがって、第１の態様では、本開示は、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのプロセスであって、
細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、
灌流バイオリアクタに、ある流量で栄養培地を供給し、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すことと、
バイオマスセンサを使用して灌流バイオリアクタ内の経時的なバイオマス濃度を決定することであって、バイオマスセンサが、コントローラと通信している、決定することと、
バイオマスセンサによって感知されたバイオマス濃度に基づいて灌流バイオリアクタへの栄養培地流量を調整することであって、コントローラが、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、培地流量を調整するように構成されている、調整することと、を含み、
栄養培地流量は、以下の関係：
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
Ｐは、ｍ供給／ｍバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて調整される、プロセスに関する。

関連する実施形態では、本発明はまた、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのプロセスであって、
細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、
灌流バイオリアクタに、ある流量で栄養培地を供給し、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すことと、
バイオマスセンサを使用して灌流バイオリアクタ内の経時的な生物体積の割合を決定することであって、バイオマスセンサが、コントローラと通信している、決定することと、
生物体積の割合に基づいて灌流バイオリアクタへの栄養培地流量を調整することであって、コントローラが、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて培地流量を調整するように構成されている、調整することと、を含み、
栄養培地流量が、上記のように、以下の関係：上述のとおりのＰ＝Ｋ＊φに基づいて調整される、プロセスに関する。

このプロセスは、目的のバイオ製品の生産など、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するために使用することができる。このプロセスは、細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することを含むことができる。栄養培地は、灌流バイオリアクタにある流量で供給することができる。同時に、流体培地を灌流バイオリアクタから取り出すことができる。灌流バイオリアクタから取り出される流体培地は、細胞の損失を防ぐために濾過することもできる。灌流バイオリアクタでの細胞培養物の増殖中、バイオマス濃度は、灌流バイオリアクタでの細胞培養物と流体連通しているバイオマスセンサを使用して経時的に決定される。バイオマスセンサは、コントローラと通信することもできる。次いで、栄養培地流量を、バイオマスセンサによって送信されたバイオマス濃度に基づいて調整することができる。コントローラは、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、培地流量を調整するように構成することができる。

バイオマスセンサは、例えば、灌流バイオリアクタ内に載置されるように適合された静電容量センサを含むことができる。あるいは、バイオマスセンサは、光学セルカウンタを含んでもよい。一実施形態では、例えば、灌流バイオリアクタは、自動サンプリングシステムと流体連通することができる。自動サンプリングシステムは、バイオマスセンサを使用して試験するために、灌流バイオリアクタからサンプルを継続的または定期的に除去することができる。バイオマスセンサは、一実施形態では、少なくとも６時間ごと、例えば、少なくとも４時間ごと、例えば、少なくとも３０分ごと、例えば、少なくとも１０分ごとに、バイオマス濃度の読み取りを行うことができる。バイオマス濃度の測定値は、栄養培地流量を決定するためのアルゴリズムを含み得るコントローラに提供することができる。例えば、栄養培地流量は、以下の関係：
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて調整することができる。
全般的には、コントローラは、バイオリアクタ内の細胞密度が増加するにつれて、灌流バイオリアクタへの栄養培地流量を増加させるように構成することができる。

灌流バイオリアクタに供給される栄養培地流量を制御することに加えて、灌流バイオリアクタから取り出される流体培地流量も制御することができる。例えば、一実施形態では、灌流バイオリアクタ内のバイオマスおよび流体培地の量を決定することができる。この量に基づいて、流体培地が灌流バイオリアクタから取り出される速度を選択的に増加または減少させることができる。一実施形態では、例えば、灌流バイオリアクタ内のバイオマスおよび流体培地の量は、計量デバイスを使用して決定することができる。計量デバイスは、コントローラと通信することができる。計量デバイスからの重量情報に基づいて、コントローラは、流体培地が取り出される速度を選択的に増加または減少させるために、灌流バイオリアクタと流体連通するポンプデバイスを制御するように構成することができる。例えば、流体培地が取り出される速度は、流体培地および細胞培養物を含む灌流バイオリアクタ内の体積がプロセス中に一定のままであるような方法で行うことができる。

計量デバイスの代わりに、プロセスおよびシステムは、灌流バイオリアクタ内の流体培地の量を決定するためのボリュームレベルインジケータを使用してもよい。ボリュームインジケータは、灌流バイオリアクタからの流体培地の取り出し率を自動的に制御するために、コントローラと通信して載置することもできる。

灌流バイオリアクタは、一般に、約１０リットル～約４０００リットル、または約１０００リットル～約４０００リットルの体積を有することができる。接種プロセス中、細胞培養物は、灌流バイオリアクタ内で約１０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約５０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約７０×１０^６細胞／ｍＬ超の細胞密度に達することができる。一実施形態では、細胞培養物は、１００×１０^６細胞／ｍＬ以上の細胞密度に達することができる。細胞密度は、一般的に約１０００×１０^６細胞／ｍＬ未満である。細胞培養物は、灌流バイオリアクタ内に約３日～約１２日間留まることができる。

本開示のプロセスは、所望の細胞密度が灌流バイオリアクタから第２のバイオリアクタに到達した後に細胞培養物を移すステップをさらに含むことができる。例えば、第２のバイオリアクタは、バッチ供給リアクタであり得、約１０Ｌ～約３０，０００Ｌの体積を有することができる。第２のバイオリアクタは、例えば、灌流バイオリアクタの体積よりも大きい体積を有することができる。例えば、灌流バイオリアクタの体積と第２のバイオリアクタの体積との間の比率は、約１：４～約１：１０など、約１：３～約１：４０とすることができる。細胞培養物は、約１２日未満、例えば、約１１日未満、例えば、約１０日未満の期間、第２のバイオリアクタ内に留まることができ、それでも、所望の量のバイオ製品を生産することが可能である。

本開示はまた、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのシステムに関する。したがって、第２の態様では、本発明はまた、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのシステムであって、
灌流バイオリアクタと、
灌流バイオリアクタと流体連通する栄養培地供給部であって、栄養培地を、細胞培養物を増殖させるために灌流バイオリアクタに供給するための、栄養培地供給部と、
灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すための流出部と、
灌流バイオリアクタから制御された量の流体培地を取り出すための、灌流バイオリアクタの流出部と流体連通しているポンプデバイスと、
灌流バイオリアクタの重量を監視するための計量デバイスと、
灌流バイオリアクタ内のバイオマス濃度を決定するための、灌流バイオリアクタと流体連通している、静電容量センサなどのバイオマスセンサと、
バイオマスセンサおよび計量デバイスと通信するコントローラであって、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタに供給される栄養培地の流量を増加または減少させるために栄養培地供給部を制御するように構成されており、かつ、計量デバイスから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタから取り出される流体培地の流量を増加または減少させるためにポンプデバイスを制御するように構成されている、コントローラと、を備え、
コントローラは、灌流バイオリアクタへの栄養培地の流量重量を、以下の関係：上記のとおりのＰ＝Ｋ＊φに基づいて制御する、システムに関する。

このシステムは、灌流バイオリアクタと流体連通する栄養培地供給部を含む。栄養培地供給部は、細胞培養物を増殖させるために灌流バイオリアクタに栄養培地を供給するためのものである。灌流バイオリアクタはまた、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すための流出部を含むことができる。ポンプデバイスは、灌流バイオリアクタからの流体培地の流れを制御するために、流出部と流体連通することができる。このシステムは、灌流バイオリアクタの重量を監視するための計量デバイスと、灌流バイオリアクタ内のバイオマス濃度を決定するための灌流バイオリアクタと通信するバイオマスセンサと、をさらに含むことができる。コントローラは、バイオマスセンサおよび計量デバイスと通信することができる。コントローラは、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタに供給される栄養培地の流量を増加または減少させるために栄養培地供給部を制御するように構成することができる。コントローラはまた、計量デバイスから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタからの流体培地の流量を増加または減少させるためにポンプデバイスを制御するように構成することができる。コントローラは、例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサを備えてもよい。

上記のように、本開示のプロセスおよびシステムは、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するのに特によく適している。

したがって、第３の態様では、本発明は、細胞培養物生産プロセスであって、
バイオ製品を発現する宿主細胞を含む本発明の第１の態様の方法によって接種物を生産することと、
接種物を生産バイオリアクタに導入し、細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、
宿主細胞を培養してバイオ製品を生産することと、
細胞培養物からバイオ製品を収穫することと、
任意選択的に、バイオ製品を１つまたは複数の精製ステップに供することと、を含む、細胞培養物生産プロセスに関する。

あるいは、しかしながら、本開示のプロセスおよびシステムを使用して、後続のバッチバイオリアクタに移すことなくバイオ製品を生産することができる。例えば、一実施形態では、細胞培養物を灌流バイオリアクタ内でインキュベートして、所望の細胞密度に到達させることができる。次いで、細胞培養物を、精製プロセスに供給し、かつ／または細胞培養物からバイオ製品を収穫するためのプロセスに供給することができる。

本開示の他の特徴および態様は、以下でより詳細に論じられる。

本開示の完全かつ可能な開示は、以下の添付の図面への参照を含めて、本明細書の残りの部分でより具体的に示されている。

下流の細胞生産のための接種物を生産するための本開示による灌流バイオリアクタシステムの一実施形態を示す図である。 接種物を生産し、接種物を、バイオ製品を生産するための大規模バイオリアクタに移すためのシステムの一実施形態を示す図である。 本開示の様々な利益および利点を示すグラフ表示である。 本明細書の実施形態による、可変供給の例示的なグラフである。 本明細書の実施形態による、可変供給の例示的なグラフである。 生物体積ごとに正規化された灌流培地供給速度の関数としての濃縮栄養供給速度を示すグラフである。 細胞ごとに正規化された灌流培地供給速度の関数としての濃縮栄養供給速度を示すグラフである。 生物体積ごとに正規化された灌流培地供給速度の関数としての濃縮栄養供給速度を示すグラフである。 細胞ごとに正規化された灌流培地供給速度の関数としての濃縮栄養供給速度を示すグラフである。 本明細書の実施形態による、生物体積ごとの一定の供給戦略を示すグラフである。 細胞培養性能に対する生物体積固有の灌流速度を調べるための条件の選択を示すグラフである。 ４つのＢＶＳＰＲ条件についての培地消費および細胞密度を示すグラフである。 ４つのＢＶＳＰＲ条件についての培地消費および細胞密度を示すグラフである。 ７ｍＬ／ｍＬ／日のＢＶＳＰＲ条件で培養された５つの細胞クローンの細胞密度を示すグラフである。 ベンチスケールから５０ＬバイオリアクタへのＮ－１プロセスのスケールアップを示すグラフである。

［発明を実施するための形態］
本議論は例示的な実施形態の説明にすぎず、本開示のより広い態様を限定することを意図するものではないことは、当該技術分野の通常の技術者によって理解されるべきである。

本開示は、全般的には、バイオ製品を生産するためのプロセスおよびシステムに関する。より具体的には、本開示は、バイオ製品の生産のために大規模なバイオリアクタに移される接種物を生産するためのプロセスおよびシステムに関する。接種物は、灌流バイオリアクタで増殖され、プロセスの目標は、培養の過程で急速に増加するバイオマスを生産することである。プロセス制御は、灌流バイオリアクタに供給される栄養培地の速度と、灌流バイオリアクタからの流体培地の取り出し速度と、を注意深く制御するために使用される。本開示によれば、栄養培地流量および取り出し流量は、一定の体積または一定の質量の条件を維持しながら、灌流バイオリアクタ内のバイオマスあたりの最適な供給速度を維持するために定期的および／または常時調整される。一実施形態では、プロセスは、リアルタイムで行われるバイオマス濃度測定値に基づいて栄養培地供給速度を調整するために完全に自動化することができる。例えば、栄養培地供給速度は、その速度がリアクタ内の現在のバイオマスに正比例するように調整することができる。

接種物を生成することに加えて、本開示のプロセスおよびシステムはまた、さらなるインキュベーション時間を必要としない細胞培養物を生産するために使用することができる。例えば、本開示の灌流バイオリアクタは、細胞密度を有する細胞培養物を生産することができ、そこでは、バイオ製品を灌流バイオリアクタから直接収穫することができる。あるいは、灌流バイオリアクタでインキュベートされた細胞培養物を、後でバイオ製品を収穫するための精製プロセスに供給することができる。

本開示の方法およびシステムは、任意の適切な細胞培養製品に適用することができる。例えば、本開示の方法は、生物療法タンパク質などの生物医薬品の生産に特によく適している。例えば、生物療法タンパク質は、遺伝子改変された哺乳動物細胞から生産される。一実施形態では、細胞培養物は、細胞宿主における組換え遺伝子発現を介して生産することができる。そのような生産は、例えば、ＣＨＯ、ＮＳＯ、またはＰＥＲ．Ｃ６などの確立された培養物からの細胞株からのものとすることができる。これらの細胞は、目的のタンパク質を発現し、続いてタンパク質を培地に分泌することができる。しかしながら、本開示のプロセスおよび技術は、タンパク質の生産に限定されず、任意の適切な細胞培養物が、本明細書に記載の制御に供され得ることを理解されたい。

上記のように、一実施形態では、本開示は、全般的には、商業規模のバイオリアクタなどのより大きなバイオリアクタに移すことができる接種物を生産するためのシステムおよびプロセスに関する。本開示によれば、比較的大きい細胞密度および生細胞数での生産バイオリアクタでのさらなる増殖に適合し、かつ十分に適した状態の微生物を含む接種物を調製することができる。例えば、本開示のプロセスおよびシステムは、接種剤として使用するのに適した生理学的状態で高レベルの生存可能なバイオマスを達成することができる。タンパク質を生産することに加えて、本開示のプロセスおよびシステムは、抗菌剤、酵素、飲料、薬物、毒素、ビタミン、アミノ酸などを生産するために使用することができる。

図１を参照すると、本開示による、接種物を生成するために使用され得る灌流バイオリアクタシステムの一実施形態が示されている。図１に示された図は、例示のみを目的としており、品質属性情報を生成するために使用され得る灌流バイオリアクタシステムのタイプを限定するものではない。全般的には、灌流バイオリアクタシステムは、高度に自動化されたプロセス開発プラットフォームとして構成することができる。灌流バイオリアクタシステムを使用して、非常に大きい細胞密度および／または生細胞数の接種物を生産することができる。

図１に示されるように、灌流バイオリアクタシステムは、灌流バイオリアクタ１０を含む。灌流バイオリアクタ１０は、増殖される細胞培養物に応じて、任意の適切なバイオリアクタを含んでもよい。例えば、灌流バイオリアクタ１０は、発酵槽、撹拌槽型リアクタ、波型バイオリアクタ、ロッキングリアクタなどを含んでもよい。図１に示される実施形態における灌流バイオリアクタ１０は、流体増殖培地内で細胞培養物を受容するためのバイオリアクタ体積１２を含む中空の器または容器を備える。灌流バイオリアクタ１０は、バイオリアクタ体積１２内に含まれる細胞培養物を攪拌するために、攪拌機１３に結合された回転可能なシャフトと関連して載置することができる。

灌流バイオリアクタ１０は、様々な材料から作製することができる。例えば、バイオリアクタ１０は、ステンレス鋼などの金属から作製することができ、再利用するように設計することができる。あるいは、灌流バイオリアクタ１０は、剛性ポリマーまたは可撓性ポリマーフィルムから作製された単回使用バイオリアクタを含んでもよい。バイオリアクタの壁は、例えば、硬質ポリマーから作製されている場合、自立することができる。あるいは、バイオリアクタ１０は、液体不透過性であり、かつ内部親水性表面を有することができる可撓性ポリマーフィルムまたは形状適合材料から作製することができる。一実施形態では、灌流バイオリアクタ１０は、所望の形状をとるための金属容器などの剛性構造に挿入されるように設計された可撓性ポリマーフィルムから作製することができる。

灌流バイオリアクタ１０は、任意の適切な体積を有することができる。例えば、灌流バイオリアクタ１０の体積は、一般に、約１Ｌ超、例えば、約５Ｌ超、例えば、約１０Ｌ超とすることができる。実施形態では、灌流バイオリアクタ１０の体積は、一般に、約４００Ｌ未満、例えば、約２５０Ｌ未満、例えば、約１００Ｌ未満である。あるいは、灌流バイオリアクタ１０は、比較的大きな体積を有することができる。例えば、灌流バイオリアクタは、２５０Ｌ超、例えば、５００Ｌ超、例えば、７５０Ｌ超、例えば、１０００Ｌ超、例えば、１５００Ｌ超であり、かつ一般に、約４０００Ｌ未満、例えば、約３０００Ｌ未満の体積を有してよく、例えば、約１０Ｌ～約４０００Ｌである。

灌流バイオリアクタ１０はまた、生物学的細胞の培養および増殖を可能にする、バッフル、スパージャ、ガス供給、熱交換器などのような様々な他の構成要素および機器を含むことができる。さらに、灌流バイオリアクタ１０は、ｐＨセンサ、ガスセンサ、温度センサなどの様々なセンサと通信することができる。

灌流バイオリアクタ１０は、栄養培地などの様々な入力を継続的に受け取り、かつバイオリアクタ１０内に含まれる細胞培養物内の疑似定常状態条件を維持するように使用済み培地を継続的に除去するように設計されている。例えば、一実施形態では、灌流バイオリアクタ１０は、比較的一定の量の細胞培養物および培地を維持するように動作する。例えば、灌流バイオリアクタ１０は、バイオリアクタ内の体積が１０％を超えて変化しない、例えば、約８％以下、例えば、約５％以下、例えば、約３％以下だけ変化するように、動作することができる。

生物学的細胞を枯渇させることなく、灌流バイオリアクタ１０から使用済み培地を除去するための様々な異なる方法が存在する。例えば、一実施形態では、灌流バイオリアクタは、細胞が結合することによって細胞が放れるのを防ぐ、毛細管繊維または膜などの付着デバイスを含むことができる。他の実施形態では、灌流バイオリアクタ１０は、バイオリアクタで所望の細胞密度を維持するフィルタデバイス１５を含むことができる。灌流バイオリアクタ１０から使用済み培地を継続的に除去し、それを新しい培地と交換することにより、バイオリアクタ内の増殖条件を変化させるために栄養レベルを制御および維持することができる。さらに、細胞廃棄物を、制御された方法で除去して毒性を回避することができる。

灌流バイオリアクタ１０は、複数のポートを含むことができる。ポートは、流体および他の材料を追加および除去するために、バイオリアクタ１０に出入りする補給ラインおよび供給ラインを可能にすることができる。さらに、１つまたは複数のポートは、灌流バイオリアクタ１０内の状態を監視するために１つまたは複数のプローブに接続されてもよい。

図１に示される実施形態では、例えば、灌流バイオリアクタ１０は、流出ポート１４および流入ポート１８を含む。流出ポート１４は、灌流バイオリアクタ１０から流体培地を連続的または定期的に除去するためのものである。流出ポート１４は、流量を制御するためのポンプ２２と流体連通することができる。他方、流入ポート１８は、栄養培地供給部１６およびポンプ２０と流体連通することができる。ポンプ２０は、制御された量の栄養培地供給を、流入ポート１８を介して灌流バイオリアクタ１０にポンプ輸送するように設計することができる。一実施形態では、灌流バイオリアクタ１０に栄養培地を供給するために、単一の流入ポート１８のみが必要とされる。しかしながら、他の実施形態では、栄養培地、基礎培地、ならびに／または、ｐＨ調整剤、酸素、窒素、および二酸化炭素などのガスなどの他の任意の構成要素を供給するために、複数のポートを使用してもよい。

本明細書で使用される場合、栄養培地または栄養素は、生物が生きる、成長する、または他の方法でバイオマスを加えるために使用し得るものなど、バイオ製品の質量を増加させることができる任意の流体、化合物、分子、または物質を指す。例えば、栄養供給は、呼吸または任意のタイプの代謝に使用される酸素または二酸化炭素などのガスを含むことができる。他の栄養培地には、炭水化物源を含めることができる。炭水化物源には、グルコース、マルトース、フルクトース、ガラクトース、およびそれらの混合物などの複合糖および単糖が含まれる。栄養培地はまた、アミノ酸を含むことができる。アミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、それらの単一の立体異性体、ならびにそれらのラセミ混合物が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸、グルタミン、リシン、チロシンまたはバリンである。

栄養培地には、１つまたは複数のビタミンを含めることもできる。栄養培地に含有し得るビタミンには、Ｂ１２などのグループＢビタミンが含まれる。他のビタミンには、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、ビオチン、およびそれらの混合物が含まれる。栄養培地はまた、１つまたは複数の脂肪酸および１つまたは複数の脂質を含有することができる。例えば、栄養培地供給部は、コレステロール、ステロイド、およびそれらの混合物を含んでもよい。栄養培地はまた、タンパク質およびペプチドをバイオリアクタに供給し得る。タンパク質およびペプチドには、例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、フェチュイン、およびそれらの混合物が含まれる。本開示内の増殖培地にはまた、増殖因子および増殖阻害剤、微量元素、無機塩、加水分解物、ならびにそれらの混合物が含まれ得る。増殖培地に含まれ得る微量元素には、微量金属が含まれる。微量金属の例には、コバルト、ニッケルなどが含まれる。

図１に示されるように、システムは、バイオマスセンサ２４をさらに含む。バイオマスセンサ２４は、灌流バイオリアクタ１０内のバイオマス濃度をアッセイするために使用することができる。本明細書で使用される場合、「バイオマス濃度」は、バイオリアクタ１０の総体積（ｍＬ／ｍＬ）に対する、バイオリアクタ内の細胞（典型的には生細胞）内に含まれる体積を指し、これは、バイオリアクタの満たされた総体積（液体体積）、すなわち、流体培地、細胞、細胞破片などを含有したものを指す。例えば、バイオマスセンサ２４は、静電容量プローブとすることができる。無傷の原形質膜を有する灌流バイオリアクタ１０内に含まれる細胞は、電場の影響下でコンデンサとして機能する。原形質膜の非導電性は、電荷の蓄積を可能にする。そして、その結果得られた静電容量を測定することができる。例えば、バイオマスセンサ２４は、無線周波数インピーダンスを使用して、灌流バイオリアクタ１０内のバイオマスを定期的または連続的に測定することができる。例えば、ＲＦインピーダンスにより、細胞懸濁液の誘電特性の測定が可能になる。その結果得られた測定値を使用して、灌流バイオリアクタ１０に存在するバイオマス含有量（生細胞体積など）、ならびに細胞直径などの他の細胞特性を導き出すことができる（バイオマス含有量測定の開示を含む、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第９，５６８，４４９号を参照）。バイオマスセンサ２４は、繰り返し使用されるデバイスとすることができ、または単回使用デバイスとすることができる。一実施形態では、例えば、バイオセンサは、一度使用して廃棄することができるパッチセンサであってもよい。

静電容量プローブを使用する場合、静電容量プローブは、約５００ＫＨｚ～約２０，０００ＫＨｚの周波数範囲で動作し得る。静電容量の測定範囲は、約０～約４００ｐＦ／ｃｍである。導電率は、約１～約４０ｍＳ／ｃｍの範囲であり得る。静電容量プローブを使用してバイオマス濃度を測定するための適切な方法が、実施例に提供されている。適切な静電容量プローブには、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ ＢｉｏｔｅｃｈのＢｉｏＰＡＴ（登録商標）ＶｉａＭａｓｓ、（例えば、単回使用アプリケーション用）およびＡｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．のＦｕｔｕｒａ １２ｍｍ Ｐｒｏｂｅ（例えば、マルチユースアプリケーション用）が含まれる。

静電容量プローブに加えて、バイオマス質量センサ２４は、バイオマス濃度または細胞数を監視または決定することができる他の任意の適切な機器とすることができる。例えば、代替の実施形態では、バイオマスセンサ２４は、光学セルカウンタとすることができる。例えば、光学セルカウンタは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＣＯＵＮＴＥＳＳ ＩＩまたはＣＯＵＮＴＥＳＳ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンタの商品名で市販されている。光学セルカウンタには、バイオマス濃度を決定するために集団内の細胞を識別するオートフォーカスおよびカウンタアルゴリズムが含まれる。光学セルカウンタを利用してバイオマス濃度（生物体積）を決定するための方法は、当該技術分野で知られており、バイオマス濃度を算出するために、光学デバイスからの、細胞直径と組み合わせた細胞数の測定を利用する。バイオマス濃度を決定するための追加の方法には、例えば、顕微鏡ベースの方法が含まれる。

図１に示されるように、バイオマスセンサ２４は、バイオリアクタ内に含まれる細胞培養物と密接に接触するために、灌流バイオリアクタ１０の体積１２内に含めることができる。図１に示される実施形態では、例えば、バイオマスセンサ２４は、上記のような静電容量プローブであってもよい。

あるいは、システムは、灌流バイオリアクタからバイオマスサンプルを取得し、バイオマス濃度および／または他の成分についてサンプルを分析する、少なくとも１つのサンプル収集サブシステムを含むことができる。例えば、一実施形態では、灌流バイオリアクタ１０は、自動サンプリングおよび試験システムと流体連通することができる。バイオマスサンプルを無菌オートサンプラに供給して、必要に応じてサンプル前処理を自動化する液体処理ロボットにサンプルを送ることができる。サンプリングおよび試験システムは、細胞数およびバイオマス濃度といった、細胞培養内の任意のパラメータを測定および監視することができる。モジュール式自動サンプリングシステムの一例は、Ｌｏｎｚａ Ｌｔｄ．によってＭＡＳＴという名前で販売されている。自動サンプリングシステムは、米国特許公開第２０１４／００８７４１３号、米国特許第９，３８９，１５１号、米国特許第９，３２２，７４９号、米国特許公開第２０１５／００１９１４０号、および米国特許公開第２０１６／００２５６０１号に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。

自動サンプリングシステムを使用してバイオマス濃度測定を実施する場合、バイオマスセンサは、静電容量プローブまたは光学セルカウンタを備えることができる。

バイオマスセンサ２４は、少なくとも６時間ごと、例えば、少なくとも４時間ごと、例えば、少なくとも２時間ごと、例えば、少なくとも１時間ごと、例えば、少なくとも３０分ごと、例えば、少なくとも１５ごと、例えば、少なくとも１０分ごとに、読み取りを行うことができる。一実施形態では、バイオマスセンサ２４は、灌流バイオリアクタ１０内のバイオマス濃度を継続的に監視することができる。

バイオマスセンサ２４は、コントローラ２６およびポンプ２０と通信することができる。コントローラ２６は、例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサなどの１つまたは複数のプログラム可能なデバイスを含んでもよい。コントローラ２６は、バイオマスセンサ２４からバイオマス濃度測定値を受信するように構成することができる。バイオマスセンサ２４から受信した情報に基づいて、コントローラ２６は、ポンプ２０を制御することによって、灌流バイオリアクタ１０への栄養培地流量を制御するように構成することができる。

従来の灌流バイオリアクタでは、灌流速度は一般に比較的狭い範囲内に留まっている。しかしながら、本開示のプロセスでは、劇的に改善された細胞密度および生細胞数の接種物を生成するために、灌流速度または栄養培地が灌流バイオリアクタ１０に供給される速度は、灌流バイオリアクタ１０内のバイオマスまたは細胞培養は急速に増加するに伴って、絶えず変化している。

例えば、本開示によれば、栄養培地供給部１６からの栄養培地の流量は、バイオマスセンサ２４によって決定されるように、灌流バイオリアクタ１０内に含まれるバイオマスの現在の量に方向的に比例する方法で変化する。バイオマスセンサ２４は、リアルタイムでバイオマス濃度測定値を得ることができ、測定値は、バイオリアクタを通る栄養培地流量の完全な自動化を可能にするコントローラ２６に提供される。例えば、プロセス中、栄養培地流量は、生存可能なバイオマス濃度に応じて上昇する。例えば、一実施形態では、コントローラ２６は、バイオマスセンサ２４から受信した情報に基づいて、栄養素流量を決定するアルゴリズムでプログラムすることができる。一実施形態では、アルゴリズムは、以下：
Ｐ＝Ｋ＊φ／Ｖ
（式中、Ｋは、生物体積固有の供給速度であり、ｍＬ／％生物体積／日の単位を有し、
（φで示される）生物体積は、細胞の細胞膜の内側にあるリアクタ体積（充填体積）の％で表される割合であり、Ｖは、ｍＬ単位の容器体積であり、Ｐは、容器体積／日単位の総バイオリアクタ灌流供給速度である）に基づくことができる。
この関係は、
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積（充填体積）であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）のように表すこともできる。これを表現する別の方法は、特に静電容量を使用してバイオマスを導出する場合、生細胞（ＶＣＶ）の細胞膜内の体積をバイオリアクタの（すなわち、培養培地と細胞／破片などに占有されている）総充填体積で除算することに基づいたパーセンテージとしてのものである。

上記の関係は、灌流バイオリアクタ１０で増殖している特定の細胞培養物について、他の様々なプロセス条件に基づいて決定することができる。実験的または理論的な計算により、上記の式のＫを決定することができる。例えば、一実施形態では、Ｋは、約１×１０^－９～約２５０×１０^－９、適切には、約１×１０^－９～約５０×１０^－９、または約１×１０^－９～約２０×１０^－９、例えば、約１×１０^－９～約１０×１０^－９、約４×１０^－９～約９×１０^－９、または約７×１０^－９変化することができる。本明細書に記載されるように、驚くべきことに、生細胞密度（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＶＣＤ）（すなわち、細胞数）を使用して行われた測定値と比較して、生物体積（細胞の細胞膜の内側にあるリアクタ体積のパーセンテージ）の使用により、必要な栄養培地の流れのより良好な予測因子が提供されることが見出された。ＶＣＤは、細胞あたりの栄養素消費率が一定であると想定しているため、重要なのは単に細胞の数である。ただし、大きな細胞は小さな細胞よりも多くの栄養素を消費するため、本明細書に記載されているように、栄養素の使用のより正確な予測因子は、生物体積に基づいている。

灌流バイオリアクタ１０への栄養培地供給速度を制御することに加えて、図１に示される本開示のプロセスおよびシステムはまた、流体培地がバイオリアクタ１０からポンプ２２を使用する流出部１４を通って取り出される速度を制御するように構成されてもよい。例えば、一実施形態では、システムは、ロードセルなどの計量デバイス２８を含むことができる。計量デバイス２８は、灌流バイオリアクタ１０内に含まれる流体培地およびバイオマスの重量を監視することができる。図１に示されるように、計量デバイス２８は、コントローラ２６およびポンプ２２と通信することができる。コントローラ２６は、計量デバイス２８から受信した情報に基づいて、ポンプ２２を使用して灌流バイオリアクタ１０から取り出される流体培地の量を制御するように構成することができる。計量デバイス２８から受信した情報に依存することに加えて、コントローラ２６はまた、流体培地がバイオリアクタから取り出される速度を決定するときに、バイオリアクタへの栄養培地流量の増加を考慮に入れることができる。

計量デバイス２８に加えて、システムはまた、灌流バイオリアクタ１０内の流体培地の量を決定するための他のデバイスを含むことができる。例えば、代替の実施形態では、システムは、バイオリアクタ１０内の流体培地の体積を監視する体積レベルインジケータを含むことができる。体積レベルインジケータはまた、コントローラ２６と通信して載置することができる。

一実施形態では、コントローラ２６は、比較的一定の体積を維持するように灌流バイオリアクタ１０を動作させるように構成することができる。例えば、体積は、プロセス中に、約２０％以下、例えば、約１５％以下、例えば、約１０％以下、例えば、約５％以下、例えば、約２％以下だけ変化することができる。

本開示のプロセスおよびシステムを通して、下流の細胞生産のための接種物は、非常に大きい細胞密度および生存細胞数で生産することができる。例えば、灌流バイオリアクタ内の細胞培養物は、細胞密度またはバイオマス濃度において、１日あたり約３０％超、例えば、１日あたり約４０％超、例えば、１日あたり約５０％超、例えば、１日あたり約６０％超、例えば、１日あたり約７０％超、例えば、１日あたり約８０％超、例えば、１日あたり約９０％超、例えば、１日あたり約１００％超、例えば、１日あたり約１１０％超、例えば、１日あたり約１２０％超、の量で増加する可能性がある。例えば、バイオマス濃度は、１日あたり１５０％超、例えば、１日あたり２００％超、例えば、１日あたり２５０％超だけ増加する可能性がある。

灌流バイオリアクタ内で所望の量の増殖が行われた後、接種物または細胞培養物は、バイオ製品の継続的な増殖および収穫のために、下流のより大きなバイオリアクタに移される。細胞培養物は、所望の細胞密度またはバイオマス濃度を達成するのに十分な時間、灌流バイオリアクタ内に留まることができる。例えば、本開示によれば、細胞培養物または接種物は、約１０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約５０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、さらには７０×１０^６細胞／ｍＬ超の細胞密度を有することができる。実施形態では、灌流バイオリアクタ内で達成される細胞密度は、１００×１０^６細胞／ｍＬ、２００×１０^６細胞／ｍＬ、２２０×１０^６細胞／ｍＬ、２５０×１０^６細胞／ｍＬ以上とすることができる。しかしながら、所望の細胞密度は、様々なプロセス条件および生成される細胞培養物のタイプに依存し得る。

全般的には、任意の適切な接種物は、本開示のプロセスおよびシステムを使用して生産することができる。一実施形態では、例えば、接種物は、哺乳動物細胞を含んでもよい。

接種物の細胞密度および／または生細胞数を増加させることは、下流の生産中に多くの利益と利点を生み出すことができる。例えば、細胞密度の大きい接種物は、細胞培養が下流のより大きな生産バイオリアクタに留まる時間を短縮することができる。生産バイオリアクタでのインキュベーション時間を短縮することは、プロセス効率に直接影響する。例えば、大規模な商業規模のバイオリアクタは、生産施設の床面積の大部分を占める。したがって、生産バイオリアクタでのインキュベーション時間は、生産効率を制限するイベントである。しかしながら、本開示のプロセスおよびシステムを通して、インキュベーション時間は、下流の生産バイオリアクタにおいて劇的に短縮され得、その結果、空時収量が増加する。実際、これらの利益および利点は、灌流バイオリアクタで接種物のインキュベーション時間が長くなった場合でも達成される。

図２を参照すると、バイオ製品を生産するための生産プロセスの一実施形態が示されている。図示されているように、一実施形態では、接種物４０は、最初に小さい細胞培養容器５０に供給することができる。例えば、細胞培養容器５０は、振とうフラスコ拡張デバイスであってもよい。接種物は、これらの専用のインキュベータ容器で限られた範囲で増殖させることができる。例えば、細胞培養容器５０は、全般的には、約０．５Ｌ超、例えば、約１Ｌ超、例えば、約２Ｌ超であり、かつ全般的には、約５Ｌ未満、例えば、約４Ｌ未満、約３Ｌ未満の体積を有することができる。

次いで、細胞培養容器５０から、接種物が、本開示の灌流バイオリアクタ１０に供給される。図２に示されるように、灌流バイオリアクタ１０は、ロッキングバイオリアクタまたはウェーブバイオリアクタまたは撹拌槽型バイオリアクタとすることができる。一実施形態では、灌流バイオリアクタ１０は、約５Ｌ～約４０００Ｌ、例えば、約１０Ｌ～約３０００Ｌ、例えば、約５０Ｌ～約２０００Ｌの体積を有することができる。灌流バイオリアクタ１０は、ステンレス鋼容器とすることができるか、または保持容器内のライニングとして使用される使い捨てバッグタイプのバイオリアクタとすることができる。

灌流バイオリアクタ１０内のインキュベーション時間は、生産される接種物および所望の最終細胞密度に応じて変化することができる。例えば、灌流バイオリアクタ１０との接種物のインキュベーション時間は、全般的には、約３日超、例えば、約５日超、例えば、約７日超、例えば、約９日超であり、かつ全般的には、約１５日未満、例えば、約１２日未満、例えば約１１日未満とすることができる。上記のように、灌流バイオリアクタ１０は、劇的に改善された細胞密度および生細胞数の接種物を生産するために特によく適合されている。

次いで、灌流バイオリアクタ１０から、接種物は、バイオ製品を生産するための生産バイオリアクタ６０に供給される。一実施形態では、例えば、生産バイオリアクタ６０は、約５００Ｌ超、例えば、約６００Ｌ超、例えば、約７００Ｌ超であり、かつ全般的には、約３０，０００Ｌ未満、例えば、約２０，０００Ｌ未満、例えば、約１０，０００Ｌ未満の体積を有することができる。全般的には、生産バイオリアクタ６０は、灌流バイオリアクタ１０よりも大きな体積を有する。例えば、灌流バイオリアクタと生産バイオリアクタとの間の体積比は、約１：３～１：４０、例えば、約１：４～約１：１０とすることができる（例えば、４，０００Ｌの灌流バイオリアクタと２０，０００Ｌの生産（例えば、バッチ供給）バイオリアクタ。

生産バイオリアクタ６０に供給される接種物の細胞密度が増加するため、バイオリアクタ６０内のインキュベーション時間を大幅に短縮することができる。例えば、従来のシステムでは典型的には、１５日以上のインキュベーション時間が必要である。しかしながら、本開示による生産バイオリアクタ６０内のインキュベーション時間は、約１３日未満、例えば、約１２日未満、例えば、約１１日未満、例えば、約１０日未満、例えば、約９日未満、例えば、約８日未満とすることができる。インキュベーション時間は、一般に、約３日超、例えば、約５日超である。生産バイオリアクタ６０内でのインキュベーション時間の短縮は、プロセス全体の効率の向上に大きな影響を及ぼす。

より大きい細胞密度の接種物を生産することにより、生産バイオリアクタ内の非生産的な始動日数を排除することにより、より高い力価を、生産バイオリアクタで、より短い期間で生み出すことができる。この効果を例示するために、図３は、本開示のプロセスの利益のうちのいくつかのグラフ表示である。図３のグラフは、生産バイオリアクタにおける経時的な生細胞密度と力価を示している。サンプルＮｏ．１は、生産バイオリアクタに供給される接種物の細胞密度が５×１０^５細胞／ｍＬである従来のプロセスを表している。しかしながら、本開示に従って作製されたサンプルＮｏ．２は、１０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で生産バイオリアクタに接種物を供給することを表している。示されているように、サンプルＮｏ．２は、劇的に優れた増殖速度と全体的に高い力価を生み出している。例えば、１５日後、サンプルＮｏ．１は、４．９５ｇ／Ｌの力価に達し、一方で、サンプルＮｏ．２は１２日間で６．１３ｇ／Ｌの力価に達した。力価をインキュベーション時間で割ることにより、空時収量が得られる。サンプルＮｏ．１は、０．３ｇ／Ｌ／日の空時収量を生み出し、サンプルＮｏ．２は、０．５１ｇ／Ｌ／日の空時収量を生み出した。したがって、本開示によるプロセスは、空時収量の５０％の増加を生み出した。

上記のように、本開示の灌流バイオリアクタは、多くの従来のプロセスと比較して、細胞密度の有意かつ劇的な増加を生み出すことができる。実際、実験手順を通して、本開示の灌流バイオリアクタは、８０×１０^６細胞／ｍＬ、例えば、９０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度を有する細胞培養物を生産することができる。実際、本開示の灌流バイオリアクタは、１００×１０^６細胞／ｍＬ以上の細胞密度を生み出す能力を実証している。

細胞密度の増加により、接種物を生産することに加えて、本開示の灌流バイオリアクタを使用して、最終生産物を生産することもできる。例えば、一実施形態では、本開示の灌流バイオリアクタを使用して、細胞培養物をインキュベートすることができ、バイオ製品を細胞培養物から直接収穫することができる。一実施形態では、灌流バイオリアクタで生産された細胞培養物は、次いでバイオ製品を収穫するための下流の精製プロセスに供給することができる。したがって、本発明はまた、細胞培養物生産プロセスであって、
バイオ製品を発現する宿主細胞を含む本発明の第１の態様の方法によって接種物を生産することと、
接種物を生産バイオリアクタに導入し、細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、
宿主細胞を培養してバイオ製品を生産することと、
細胞培養物からバイオ製品を収穫することと、
任意選択的に、バイオ製品を１つまたは複数の精製ステップに供することと、を含む、細胞培養物生産プロセスに関する。

一実施形態では、接種物は、少なくとも５×１０^６細胞／ｍＬ、例えば少なくとも８または１０×１０^６細胞／ｍＬの最終密度まで生産バイオリアクタに導入される。これは、例えば、本発明のＮ－１プロセスからの接種物の４～１０倍の希釈を表すことができる。

実施形態では、細胞は、組換え治療または診断製品などの製品を発現または生産する。細胞によって生産される生産物の例には、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（抗原に特異的に結合するが、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｄｎｅｃｔｉｎ、またはＩｇＮＡＲなどの抗体に構造的に関連しないポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、その他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療薬（例えば、抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療およびウイルス免疫療法のためのウイルスベクタ）、細胞治療薬（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞および成体幹細胞）、ワクチンもしくは脂質カプセル化粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）もしくはＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質もしくはアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、デバイス、施設、方法は、バイオ後続品の製造に使用することができる。

前述のように、実施形態では、デバイス、施設、および方法は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞もしくは下等真核細胞（例えば、酵母細胞もしくは糸状菌細胞など）、またはグラム陽性もしくはグラム陰性細胞などの原核細胞、および／または真核細胞もしくは真核細胞の生産物、例えば、大規模な方法で真核細胞によって合成された、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の生産を可能にする。本明細書で特に明記しない限り、デバイス、施設、および方法は、ベンチスケール、パイロットスケール、およびフル生産スケールの能力を含むがこれらに限定されない、任意の所望の容量または生産能力を含むことができる。

さらに、本明細書で特に明記しない限り、デバイス、施設、および方法は、撹拌槽、気泡ポンプ、ファイバ、マイクロファイバ、ホローファイバ、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流床（ｓｐｏｕｔｅｄ ｂｅｄ）バイオリアクタを含むがこれらに限定されない、任意の好適なリアクタ（複数可）を含むことができる。本明細書で使用される場合、「リアクタ」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「リアクタ」という用語は、「発酵器」と同義に使用される。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクタユニットは、以下：栄養素および／もしくは炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵もしくは細胞培養培地の流入および流出、気体相および液体相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、撹拌）、ならびに／または洗浄／滅菌のうちの１つもしくは複数またはすべてを実施することができる。発酵ユニットなどの例示的なリアクタユニットは、ユニット内に複数のリアクタを含むことができ、例えば、ユニットが、各ユニット内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個、もしくはそれ以上のバイオリアクタを有することができてもよく、かつ／または施設が、施設内に単一もしくは複数のリアクタを有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクタは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスに好適なものとすることができる。任意の好適なリアクタ直径を使用することができる。実施形態では、バイオリアクタは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有することができる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、３０，０００リットル、４０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの体積が挙げられる。さらに、好適なリアクタは、複数回使用、単回使用、使い捨て、または非使い捨てとすることができ、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス鋼）およびインコネル（Ｉｎｃｏｎｅｌ）などの金属合金、プラスチック、ならびに／またはガラスを含む任意の好適な材料で形成することができる。

生産細胞による生産物の生合成が満足のいくポイントまで進行すると、生産物を、例えば、培地を取り出し、細胞および細胞破片から上清を分離することで、収穫することができる。生産物は、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、濾過および／またはウイルス不活化などの精製された生産物を得るために、１つまたは複数の精製／処理ステップに供することができる。生産物はまた、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と、例えば、緩衝剤、界面活性剤、安定剤（トレハロース、スクロース、グリセロールなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニンなど）、金属イオン／キレート剤、塩および／または防腐剤のうちの１つまたは複数と、組み合わせて、製剤化された医薬組成物などの組成物を生産し得る。

本明細書に記載のデバイス、施設および方法は、原核生物および／または真核生物の細胞株を含む任意の所望の細胞株を培養するのに適している。さらに、実施形態では、デバイス、施設、および方法は、浮遊細胞または足場依存性（付着性）細胞を培養するのに適しており、ポリペプチド製品、核酸製品（例：ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞および／もしくはウイルス療法で使用されるものなどの細胞および／もしくはウイルスなどの、医薬製品およびバイオ医薬製品の生産のために構成された生産作業に適している。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞を導出することができる種の例には、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット、およびネコが含まれる。実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（グルタチオンシンテターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＧＳ）遺伝子のすべての内因性コピーが不活性化されているＣＨＯ細胞）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＦＵＴ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳ－ＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＧＳ Ｘｃｅｅｄ（登録商標）－ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ（登録商標））である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウトセルは、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ（登録商標）ＦＵＴ８ノックアウト（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。

実施形態では、本明細書に特に明記しない限り、本明細書に記載のデバイス、施設、および方法はまた、特に言及されていない任意の好適なユニット動作および／または機器、例えば、そのような生産物の分離、精製、ならびに単離のための動作および／または機器を含むことができる。伝統的な現場組み立て（ｓｔｉｃｋ－ｂｕｉｌｔ）施設、モジュール式、移動式、および仮設の施設、または任意の他の好適な建設、施設、および／もしくはレイアウトなど、任意の好適な施設および環境を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、モジュール式クリーンルームを使用することができる。さらに、特に明記しない限り、本明細書に記載のデバイス、システム、および方法は、単一の場所または施設において収容および／または実施することができ、あるいは、別々のもしくは複数の場所および／または施設において収容および／または実施することができる。

実施例
実施例１：生物体積に基づく灌流リアクタの供給により、良好な培養成績が予測され、生物体積に基づく灌流リアクタの供給は、細胞数に基づく供給よりも優れている。
バイオマス濃度（生物体積）の静電容量測定
培養バイオマス濃度（生物体積）は、Ａｂｅｒ Ｆｕｔｕｒａ静電容量プローブ（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ，ＵＫ）を使用して実施された。静電容量は、１０００ｋＨｚで３０秒ごとに測定された。静電容量信号は、３０サンプル移動平均フィルタを使用してフィルタ処理され、電極分極は信号に適用されなかった。静電容量の値は、キャリブレーション実験において生物体積（バイオマス濃度）と相関しており、その実験では、異なる生細胞濃度で増殖中のバイオリアクタ培養物から毎日サンプルを抽出した。生細胞濃度および平均細胞直径は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して各サンプルについて決定された。生存生物体積は、球形の細胞形状を仮定することにより、Ｆｌｅｘからの前述の測定値から以下のように決定された。

（式中、φは、ｍＬ／ｍＬ単位の生存生物体積の割合、ｖＣＣは、細胞／ｍＬ単位の生細胞濃度、Ｄは、μｍ単位の平均細胞径である。）
キャリブレーション実験の結果、φと静電容量との間に線形相関が生じた。

（式中、φは、ｍＬ／ｍＬ単位の生存生物体積、ｍは、キャリブレーション曲線の傾き（ｍＬ＊ｃｍ／（ｍＬ＊ｐＦ））、Ｃは、静電容量（ｐＦ／ｃｍ）、ｂは、キャリブレーション曲線の切片（ｍＬ／ｍＬ）である。）

生物体積に関する特記事項：ｍＬ／ｍＬ単位の、濃度に類似した生物体積の割合φは、ＶＣＣ（細胞／ｍＬ）に類似したものである。生存生物体積（ｍＬ）は、総生物体積であり、かつ総細胞数（細胞）に類似したものである。すなわち、生物体積の割合とＶＣＣは両方とも濃度であり、生存生物体積と総細胞数は、リアクタの全体積の合計である。

供給操作空間実験のための灌流培養の操作
灌流培養を、モノクローナル抗体を発現する単一のＣＨＯ細胞株を用いて行った。培養物を、０．５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞濃度で、ｐＨ６．９での化学的に定義された基本培地（基本培地＋１．９ｖｏｌ％ ＳＦ１０２（濃縮栄養供給））へと接種させた。溶存酸素濃度は、４０％以上の空気飽和度に維持した。細胞は、点灌流を１容器体積（ｖｖ）／日（灌流培地－基本培地＋４．２１ｖｏｌ％ ＳＦ１０２）で開始した補足供給を伴う６日目まで、拡大することが可能とされた。細胞が拡大し続けるにつれて、灌流速度は、最大２ｖｖ／日まで毎日増加した。培養物が所望の細胞濃度（またはその特定の実行の制御戦略に応じた生物体積の割合）に達すると、静電容量測定によって制御された細胞ブリードを開始し、培養物を一定の細胞濃度または生物体積の割合に維持した。灌流供給速度は、やはり実験に応じて、所望の細胞固有の灌流速度、または生物体積固有の灌流速度を達成するように手動で調整された。

灌流されたＮ－１培養物の操作
灌流されたＮ－１培養物を、０．５×１０^６細胞／ｍＬの生細胞濃度で、化学的に定義された基本培地へと接種させた。細胞は、灌流を開始させた４日目まで、拡大することが可能にされた。灌流供給速度は、次のように静電容量の読み取り値によって予測されるように、生物体積の割合によって決定された。
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｐは、ｖｖ／日単位の灌流供給速度であり、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、φは、生物体積の割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）である）。

細胞を分裂させ、灌流速度をそれに応じて１００×１０^６細胞／ｍＬまで制御した。この可変供給の例示的な例は、３つのＣＨＯ細胞クローン（Ｃ１～Ｃ３）についての図４Ａ～図４Ｂに示されている。

供給操作空間の作成
灌流培地の供給については、次の２つの培地供給の考慮事項を検討した：過剰供給なしで細胞の要件を満たすのに十分な栄養素の補給と、希釈による培養物からの老廃物の除去。灌流培地を次の２つの成分に分けた：基礎培地と、濃縮栄養補給。基礎培地に添加される栄養補給（ＳＦ１０２）の量を変えることにより、栄養豊富度の異なる灌流培地を得た。より多くの栄養補給は、より豊富な灌流培地をもたらした。

灌流培地は、様々な量の栄養補給を追加して調製した。次いで、細胞固有のまたは生物体積固有の灌流速度を、培地組成ごとに変化させ、各培養物の定常状態の挙動を観察した。少なくとも５日間安定した定常状態をもたらした培養物は、許容可能な担い手と見なし、生存率の低下またはアポトーシス（および通常は培養物のクラッシュ）をもたらした培養物は、許容できない担い手と見なした。

各灌流培養条件について、細胞または生物体積に固有の灌流速度を、細胞または生物体積に固有の濃縮栄養供給速度に対してプロットした。生物体積または細胞に固有の濃縮栄養供給補給速度は、生物体積または細胞に固有の灌流速度に、その特定の培地の基礎灌流培地に追加された濃縮栄養供給の量（体積分率として表される）を掛けたものとして決定した。

灌流されたＮ－１培養物における供給操作空間項目の実施
許容できる（および許容できない）培養性能をもたらした灌流速度と濃縮栄養供給補給速度の範囲を特定した操作空間を確立したら（図５の上下の点線を参照）、その操作空間を使用して、非定常状態またはＮ－１増殖培養で許容可能な培養性能をもたらす灌流供給条件を特定した。これを達成するために、事前定義された供給操作空間の中央付近で条件を選択した（図５のひし形を参照のこと）。

結果
異なる栄養補給速度で実行された一連の初期灌流培養は、不安定な培養（Ｘラベルを参照のこと）が、許容可能な培養性能範囲の端で、ＳＦ１０２栄養供給／細胞の速度が高すぎたり低すぎたりして得た場合（図６）の、細胞あたりの一定の栄養消費の仮定を支持した。

細胞あたりの提案された栄養供給速度の上限および下限の最初の観察値と、それら限界が一定であるという仮定とに基づいて、より少ない培地（より低いＣＳＰＲ）を使用するが、それでも細胞あたりの栄養供給の最適ウィンドウ内で動作する（＋記号、図６）と予測された、より強化された培養条件を試みた。驚いたことに、代わりに不安定な培養が、その新しい条件（＋）で、細胞サイズの変化を含む栄養の過剰供給の兆候とともに観察された。

細胞あたりの一定の栄養要件の仮定は不正確であると判断され、代わりに、必要な栄養は、生物体積ごとに供給されると予測する必要があった。これは、より大きな細胞は、より多くの細胞機構を持っているという事実のために、より多くの栄養を必要とし、逆に、より小さな細胞は、より少ない栄養を必要とするという事実を説明している。同じ灌流条件を生物体積ごとに表示すると、選択した灌流条件（＋）は、実際には過剰供給側にあると予測され、観察されたものと相関している（図７中、上側の点線、すなわち、許容可能な培養性能範囲の上限に位置する、丸で囲んだ＋記号）。

生物体積あたり一定となる仮定に対する供給制限の更新された解釈に基づいて、生物体積固有の供給空間の予測された理想的な供給範囲（図７の三角形）に位置する新しい条件を選択した。この条件は、良好に機能する灌流培養をもたらした。

ただし、ＣＳＰＲの関数として見ると、この成功した条件は、細胞固有の栄養供給速度が一定となる仮定を使用して、供給不足であると予測されていたであろう。（図８中、下側の点線の下、つまり「許容可能な培養性能範囲」の外側にある、丸で囲んだ三角形）。

この予想外の発見に基づいて、生物体積ごとに一定となる供給戦略を実施した（図９を参照のこと）。示されているように、細胞が「栄養豊富な環境」で増殖している場合、それらは許容可能な増殖特性を示さない（上の画像）。ただし、「許容可能な培養性能範囲」で増殖した細胞は、適切な細胞形状と密度という望ましい細胞特性を示している。

灌流されたＮ－１プロセス最適化への供給操作空間の実装
培養性能への影響について、様々な生物体積固有の灌流供給速度を評価した。灌流されたＮ－１培養を、以下の４つの生物体積固有の灌流速度で完了させた：５、６．２、７、および８．４ｍＬ／ｍＬ／日。これらの条件は、単一の灌流培地組成について、中間条件が良好な培養性能を提供すると予測され、かつ隣接条件を許容可能な操作空間の端に近いが、それでも範囲内にあると予測されるように選択された（図１０を参照のこと）。

各培養物は、操作空間によって予測されるように、少なくとも７５×１０＾６細胞／ｍＬの細胞密度にうまく到達した。ただし、空間の端に近い条件では、空間の中央（および６．２ＢＶＳＰＲ）よりも増殖が遅くなり、それに応じて培地の消費量（８．４および５ＢＶＳＰＲ）が多くなった（図１１Ａを参照のこと）。図１１Ｂは、ＣＨＯ細胞クローンＬ１について選択された各条件の細胞密度（ＶＣＣ）を示している。

最後に、単一細胞クローン（７ｍＬ／ｍＬ／日）（Ｃ１）について図１１Ｂで特定された最適条件を、他の４つのクローン（Ｃ２～Ｌ５）に適用した。これらはすべて、良好な増殖特性を示した。これは、生物体積固有の供給アプローチがプラットフォームアプローチであり、かつ１つの細胞株だけに限定されないことを支持している（図１２）。

まとめると、驚くべきことに、生物体積に基づくモデルの使用、すなわち、細胞の細胞膜の内側にあるリアクタ体積（すなわち、液体体積：流体培地、細胞、細胞破片など）のパーセンテージにより、望ましい灌流培養を提供するために必要な供給条件をより正確に予測できた、ということがわかった。

プロセスのスケールアップ
図１３は、Ｎ－１プロセスをベンチトップスケールから５０Ｌ単回使用撹拌槽型リアクタ（パイロットスケール）にスケールアップすることに成功したことを示している。５０×１０^６細胞／ｍＬの定義された目標ＶＣＣは、ほぼ同じ培養期間（約９日）で達成した。実際には、この目標要件を超え、１１日目に７０００万細胞／ｍＬのＶＣＣに達した。これらの結果は、自動化を含むプロセスが異なる規模と異なるリアクタ形式に変換できたことを示している。

例示的な実施形態
実施形態１は、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのプロセスであって、細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、灌流バイオリアクタに、ある流量で栄養培地を供給し、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すことと、静電容量センサなどのバイオマスセンサを使用して灌流バイオリアクタ内の経時的なバイオマス濃度を決定することであって、バイオマスセンサが、コントローラと通信している、決定することと、バイオマスセンサによって感知されたバイオマス濃度に基づいて灌流バイオリアクタへの栄養培地流量を調整することであって、コントローラが、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、培地流量を調整するように構成されている、調整することと、を含み、栄養培地流量は、以下の関係：
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて調整される、プロセスである。

実施形態２は、コントローラが、バイオマス濃度が増加するにつれて栄養培地の流量を増加させるように構成されている、実施形態１で定義される、プロセスを含む。

実施形態３は、灌流バイオリアクタ内の流体培地の量を決定し、その量に基づいて、流体培地が灌流バイオリアクタから取り出される速度を選択的に増加または減少させるステップをさらに含む、実施形態１または２で定義される、プロセスを含む。

実施形態４は、灌流バイオリアクタ内の流体培地の量が、計量デバイスを使用して灌流バイオリアクタを計量することによって決定される、実施形態３で定義される、プロセスを含む。

実施形態５は、計量デバイスが、コントローラと通信しており、計量デバイスからの重量情報に基づいて、コントローラが、流体培地が取り出される速度を選択的に増加または減少させるために、灌流バイオリアクタと流体連通するポンプデバイスを制御するように構成されている、実施形態４で定義される、プロセスを含む。

実施形態６は、灌流バイオリアクタから取り出された流体培地が、バイオマスが流体培地とともにバイオリアクタから取り出されるのを防ぐために濾過される、実施形態５で定義される、プロセスを含む。

実施形態７は、灌流バイオリアクタ内の流体培地の量が、体積を測定することによって決定される、実施形態３で定義される、プロセスを含む。

実施形態８は、細胞培養物が、細胞密度を有し、細胞密度が、灌流バイオリアクタにおいて経時的に増加する、実施形態１～７のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態９は、流体培地および細胞培養物を含む体積が、プロセス中、一定のままである、実施形態８で定義される、プロセスを含む。

実施形態１０は、細胞培養物が、哺乳動物細胞を含む、請求項１～９のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１１は、バイオマスセンサが、灌流リアクタ内のバイオマス濃度を少なくとも６時間ごとに決定する、実施形態１～１０のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１２は、灌流バイオリアクタが、約１０リットル～約４０００Ｌの体積を有する、実施形態１～１１のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１３は、プロセスが、インキュベーション期間の後、細胞培養物を灌流バイオリアクタから第２のバイオリアクタに移すことをさらに含み、第２のバイオリアクタが、灌流バイオリアクタの体積よりも大きい体積を有し、灌流バイオリアクタと第２のバイオリアクタとの間の体積比が、１：３～１：４０、例えば、約１：４～約１：１０である、実施形態１～１２のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１４は、細胞培養物が、供給バッチ型の様式で第２のバイオリアクタ内で増殖し続ける、実施形態１３で定義される、プロセスを含む。

実施形態１５は、細胞培養物が、灌流バイオリアクタ内に約３日～約１２日留まり、第２のバイオリアクタ内に約１２日未満、例えば、約１０日未満留まる、実施形態１３または１４で定義される、プロセスを含む。

実施形態１６は、細胞培養物が、灌流バイオリアクタ内で約１０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約５０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約７０×１０^６細胞／ｍＬ超の細胞密度に達する、実施形態１～１５のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１７は、細胞培養物が、灌流バイオリアクタ内で１００×１０^６細胞／ｍＬ以上の細胞密度に達する、実施形態１～１６のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１８は、細胞培養物が、細胞密度を有し、細胞密度が、灌流バイオリアクタ内で１日あたり少なくとも６０％増加する、実施形態１～１７のいずれかで定義される、プロセスを含む。

実施形態１９は、後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのシステムであって、灌流バイオリアクタと、灌流バイオリアクタと流体連通する栄養培地供給部であって、栄養培地を、細胞培養物を増殖させるために灌流バイオリアクタに供給するための、栄養培地供給部と、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すための流出部と、灌流バイオリアクタから制御された量の流体培地を取り出すための、灌流バイオリアクタの流出部と流体連通しているポンプデバイスと、灌流バイオリアクタの重量を監視するための計量デバイスと、灌流バイオリアクタ内のバイオマス濃度を決定するための、灌流バイオリアクタと流体連通している、静電容量センサなどのバイオマスセンサと、バイオマスセンサおよび計量デバイスと通信するコントローラであって、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタに供給される栄養培地の流量を増加または減少させるために栄養培地供給部を制御するように構成されており、かつ、計量デバイスから受信した情報に基づいて、灌流バイオリアクタから取り出される流体培地の流量を増加または減少させるためにポンプデバイスを制御するように構成されている、コントローラと、を備え、コントローラは、灌流バイオリアクタへの栄養培地の流量重量を、以下の関係：
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて制御する、システムである。

コントローラが、１つまたは複数のマイクロプロセッサを含む、実施形態１９で定義される実施形態２０のシステム。

実施形態２１は、灌流バイオリアクタが、約１０リットル～約２５０リットルの体積を有する、実施形態１９または２０で定義される、システムである。

実施形態２２は、灌流バイオリアクタと流体連通している第２のバイオリアクタをさらに備え、第２のバイオリアクタが、灌流バイオリアクタから細胞培養物を受け取るように構成され、第２のバイオリアクタが、灌流バイオリアクタの体積よりも大きい体積を有し、灌流バイオリアクタと第２のバイオリアクタとの間の体積比が、１：３～１：４０、例えば、約１：４～約１：１０である、実施形態１９～２１のいずれかで定義される、システムである。

実施形態２３は、細胞培養物生産プロセスであって、細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、灌流バイオリアクタに、ある流量で栄養培地を供給し、灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すことと、バイオマスセンサを使用して灌流バイオリアクタ内の経時的なバイオマス濃度を決定することであって、バイオマスセンサが、コントローラと通信している、決定することと、バイオマスセンサによって感知されたバイオマス濃度に基づいて灌流バイオリアクタへの栄養培地流量を調整することであって、コントローラが、バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、培地流量を調整するように構成されている、調整することと、を含み、栄養培地流量は、以下の関係：
Ｐ＝Ｋ＊φ
（式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて調整される、細胞培養物生産プロセスである。

実施形態２４は、インキュベーション期間の後、細胞培養物が精製プロセスに供給される、実施形態２３で定義される、プロセスを含む。

実施形態２５は、インキュベーション期間の後、バイオ製品が細胞培養物から収穫される、実施形態２３で定義される、プロセスを含む。

実施形態２６は、細胞培養物生産プロセスであって、バイオ製品を発現する宿主細胞を含む、実施形態１～１８のいずれかの方法による、接種物を生産することと、
接種物を生産バイオリアクタに導入することと、
宿主細胞を培養してバイオ製品を生産することと、
細胞培養物からバイオ製品を収穫することと、
任意選択的に、バイオ製品を１つまたは複数の精製ステップに供することと、を含む、細胞培養物生産プロセスを含む。

本発明に対するこれらおよび他の修正例および変形例は、（より具体的には添付の特許請求の範囲に記載される）本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって実施され得る。さらに、様々な実施形態の態様は、全体的または部分的に交換され得ることを理解されたい。さらに、当業者は、前述の説明が単なる例に過ぎず、そのような添付の特許請求の範囲にさらに記載されている本発明を限定することを意図していないことを理解するであろう。

Claims (18)

1. 後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのプロセスであって、
   細胞培養物を灌流バイオリアクタに導入することと、
   前記灌流バイオリアクタに、ある流量で栄養培地を供給し、前記灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すことと、
   バイオマスセンサを使用して前記灌流バイオリアクタ内の経時的なバイオマス濃度を決定することであって、前記バイオマスセンサが、コントローラと通信している、決定することと、
   前記バイオマスセンサによって感知されたバイオマス濃度に基づいて前記灌流バイオリアクタへの前記栄養培地流量を調整することであって、前記コントローラが、前記バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、前記培地流量を調整するように構成されている、調整することと、を含み、
   前記栄養培地流量は、以下の関係：
   Ｐ＝Ｋ＊φ
   （式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
   φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、
   パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
   Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて調整される、プロセス。
2. 前記バイオマスセンサは、静電容量センサである、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記コントローラは、前記バイオマス濃度が増加するにつれて前記栄養培地の前記流量を増加させるように構成されている、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
4. 前記灌流バイオリアクタ内の流体培地の量を決定し、前記量に基づいて、前記流体培地が前記灌流バイオリアクタから取り出される速度を選択的に増加または減少させるステップをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
5. 前記灌流バイオリアクタ内の流体培地の量は、計量デバイスを使用して前記灌流バイオリアクタを計量することによって決定される、請求項４に記載のプロセス。
6. 前記計量デバイスは、前記コントローラと通信しており、前記計量デバイスからの重量情報に基づいて、前記コントローラは、流体培地が取り出される速度を選択的に増加または減少させるために、前記灌流バイオリアクタと流体連通するポンプデバイスを制御するように構成されている、請求項５に記載のプロセス。
7. 前記灌流バイオリアクタ内の流体培地の量は、体積を測定することによって決定される、請求項４に記載のプロセス。
8. 前記灌流バイオリアクタ内の前記細胞培養物中の細胞密度は、経時的に、例えば、１日あたり少なくとも６０％だけ増加する、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
9. 前記バイオマスセンサは、前記灌流リアクタ内の前記バイオマス濃度を少なくとも６時間ごとに決定する、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
10. 前記灌流バイオリアクタは、約１０Ｌ～約４０００Ｌの体積を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。
11. 前記プロセスは、インキュベーション期間の後、前記細胞培養物を前記灌流バイオリアクタから第２のバイオリアクタに移すことをさらに含み、前記第２のバイオリアクタは、前記灌流バイオリアクタの体積よりも大きい体積を有し、前記灌流バイオリアクタと前記第２のバイオリアクタとの間の体積比は、１：３～１：４０、例えば、約１：４～約１：１０である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
12. 前記細胞培養物は、供給バッチ型の様式で前記第２のバイオリアクタ内で増殖し続ける、請求項１１に記載のプロセス。
13. 前記細胞培養物は、前記灌流バイオリアクタ内に約３日～約１２日留まり、前記第２のバイオリアクタ内に約１２日未満、例えば、約１０日未満留まる、請求項１１または１２に記載のプロセス。
14. 前記細胞培養物は、前記灌流バイオリアクタ内で約１０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約３０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約５０×１０^６細胞／ｍＬ超、例えば、約７０×１０^６細胞／ｍＬ超の細胞密度に達する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
15. 前記細胞培養物は、前記灌流バイオリアクタ内で１００×１０^６細胞／ｍＬ以上の細胞密度に達する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
16. 前記細胞培養物は、哺乳動物細胞を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。
17. 後続の細胞培養物生産プロセスのための接種物を生産するためのシステムであって、
    灌流バイオリアクタと、
    前記灌流バイオリアクタと流体連通する栄養培地供給部であって、栄養培地を、細胞培養物を増殖させるために前記灌流バイオリアクタに供給するための、栄養培地供給部と、
    前記灌流バイオリアクタから流体培地を取り出すための流出部と、
    前記灌流バイオリアクタから制御された量の流体培地を取り出すための、前記灌流バイオリアクタの前記流出部と流体連通しているポンプデバイスと、
    前記灌流バイオリアクタの重量を監視するための計量デバイスと、
    前記灌流バイオリアクタ内のバイオマス濃度を決定するための、前記灌流バイオリアクタと流体連通している、静電容量センサなどのバイオマスセンサと、
    前記バイオマスセンサおよび前記計量デバイスと通信するコントローラであって、前記バイオマスセンサから受信した情報に基づいて、前記灌流バイオリアクタに供給される栄養培地の流量を増加または減少させるために前記栄養培地供給部を制御するように構成されており、かつ、前記計量デバイスから受信した情報に基づいて、前記灌流バイオリアクタから取り出される流体培地の流量を増加または減少させるために前記ポンプデバイスを制御するように構成されている、コントローラと、を備え、
    前記コントローラは、前記灌流バイオリアクタへの前記栄養培地の流量重量を、以下の関係：
    Ｐ＝Ｋ＊φ
    （式中、Ｋは、生物体積固有の灌流速度（ｍＬ供給／ｍＬ生物体積／日）であり、
    φは、生物体積の割合であり、細胞の細胞膜の内側にある灌流バイオリアクタの体積であり、パーセンテージまたは割合（ｍＬ生物体積／ｍＬバイオリアクタ）で表され、
    Ｐは、ｍＬ供給／ｍＬバイオリアクタ／日で表される灌流速度である）に基づいて制御する、システム。
18. 細胞培養物生産プロセスであって、
    バイオ製品を発現する宿主細胞を含む請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法によって接種物を生産することと、
    前記接種物を生産バイオリアクタに導入することと、
    前記宿主細胞を培養して前記バイオ製品を生産することと、
    前記細胞培養物から前記バイオ製品を収穫することと、
    任意選択的に、前記バイオ製品を１つまたは複数の精製ステップに供することと、を含む、細胞培養物生産プロセス。

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