EA022219B1 - Способ получения полипептида или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре - Google Patents

Abstract

Описана система хемостат-подобного непрерывного культивирования клеток, которая сочетает определенные преимущества перфузионных открытых систем и хемостатных открытых систем, для улучшения культивирования клеток млекопитающих, например генетически модифицированных клеток, особенно в средах, не содержащих сыворотку или химически определенных средах. Система непрерывного культивирования, описанная здесь, включает культивирование клеток млекопитающих в системе непрерывного культивирования клеток, которая содержит устройство фиксации клеток, где система культивирования клеток имеет скорость разбавления (D), меньшую чем приблизительно 2 д, и плотность клеток, меньшую чем 2×10клеток/мл. Также здесь описан способ получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре, включающий культивирование клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в системе непрерывного культивирования клеток, которая содержит устройство фиксации клеток, где система культивирования клеток имеет скорость разбавления (D), меньшую чем 2 д, и плотность клеток, меньшую чем 2×10клеток/мл; и извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из среды, системы культивирования клеток.

Description

Настоящее изобретение относится к стратегии непрерывной клеточной культуры для получения полипептидов или вирусов, представляющих интерес, в культуре клеток млекопитающих. Стратегия непрерывной клеточной культуры, описанной здесь, сочетает преимущества технологий хемостатной и перфузионных культуры.

Предшествующий уровень техники

Способность вырабатывать полипептид или вирус, представляющие интерес, становится все более важной в биотехнологической промышленности. В течение последних двух десятилетий достижения в биотехнологии привели к интересу к многочисленным полипептидам и вирусам, которые имеют потенциальные терапевтические применения в качестве вакцин и фармацевтических препаратов. Крупномасштабное производство, в целом, включает рекомбинантное получение полипептида или вируса, представляющих интерес, например, в бактериальных, дрожжевых, насекомых, млекопитающих или других клеточных типах. Получение полипептидов или вирусов, представляющих интерес в культурах млекопитающих, в частности, имеет преимущества над получением в бактериальных или других низших микробных хозяевах вследствие способности клеток млекопитающих к посттрансляционной обработке сложных белковых структур посредством, например, дисульфид-зависимого фолдинга и гликозилирования.

Клетки млекопитающих, как правило, размножаются ίη νίίτο в одном из двух режимов: как несубстратзависимые клетки, растущие свободно в суспензии по всему объему культуры; или как субстратзависимые клетки, требующие прикрепления к твердому субстрату для их размножения (т.е. монослойный тип клеточного роста). Системы с микроносителями были разработаны для обеспечения обоих типов роста. Например, субстратзависимые клетки могут размножаться в системах с микроносителями, содержащих небольшие твердые частицы, суспендированные в среде для роста посредством медленного встряхивания. Эта система обеспечивает прикрепление субстратзависимых клеток к поверхностям суспендированных частиц и рост до конфлюентности, в то время как микроносители остаются суспендированными в среде для роста. Альтернативно, макропористые микроносители могут применяться для содержания несубстратзависимых клеток в биореакторах, например, посредством неспецифичного прикрепления для клеток к поверхности таких микроносителей. Суспензионные культуры с микроносителями для либо несубстратзависимых клеток или субстратзависимых клеток являются наиболее широко используемыми средствами крупномасштабного получения клеток и клеточных продуктов.

Крупномасштабные суспензионные культуры могут эксплуатироваться в закрытой системе, например такой, как периодические закрытые системы или периодические с подпиткой субстратом закрытые системы, которые являются более простыми для эксплуатации и масштабирования, чем открытые системы. Обычно в закрытой системе не удаляют никаких клеток, продуктов и/или продуктов выделения (хотя воздух (например, кислород) может добавляться и СО₂ удаляться посредством аэрации). Типовой профиль роста, наблюдаемый в системах для роста с периодическим добавлением субстрата, включает лагфазу с последующей экспоненциальной фазой, стационарную фазу и фазу отмирания. В таких периодических системах окружающая среда непрерывно меняется, поскольку компоненты питательной среды израсходуются, а метаболиты накапливаются. В системе с периодическим добавлением субстрата с подпиткой ключевые компоненты питательной среды непрерывно подаются в систему для продления цикла роста, несмотря на то что клетки, продукты, побочные продукты и продукты жизнедеятельности, включая токсичные метаболиты, не удаляются. Соответственно, получение полипептида или вируса, представляющих интерес, посредством периодических или периодических с подпиткой систем ограничено накоплением клеток и вредных веществ, таких как токсичные метаболиты.

Крупномасштабные суспензионные культуры могут также эксплуатироваться в открытой системе, например перфузионной системе или хемостатной системе. В перфузионной системе свежую среду подвергают перфузии через культуру, в то время как клетки удерживаются с помощью разнообразных устройств фиксации клеток. Типы устройств фиксации клеток включают, например, микроносители, мелкоячеистые центробежные фильтры, полые волокна, плоские мембранные фильтры, пробирки для осаждения, ультразвуковые устройства фиксации клеток и т.п. Обычно, перфузионные культуры конструируются для увеличения плотностей клеток до максимума с устройствами фиксации клеток, конструируемыми и эксплуатируемыми, чтобы иметь степень фиксации клеток, равную >90%. Такие культуры обычно достигают плотностей клеток >2х10⁷, которые могут снабжаться подаваемой средой для культуры клеток, подаваемой при скорости разбавления, большей чем приблизительно 2,0 д^-1. Однако устойчивое состояние системы трудно поддерживать вследствие неконтролируемого увеличения биомассы, и постоянные условия получения являются трудно контролируемыми и/или достижимыми.

Хемостатные системы эксплуатируют с непрерывным притоком среды и оттоком клеток и продуктов. В хемостатной системе устройство фиксации клеток отсутствует, так, что концентрация клеток в биореакторе и концентрация клеток в супернатанте, собранном из биореактора, являются, по существу,

- 1 022219 идентичными. Обычно, культуральная среда подается в реактор при предварительно определенной и постоянной скорости, поддерживая низкую скорость разбавления культуры (обычно от 0,3 до 0,8 д^-1). Для предотвращения вымывания клеток скорость разбавления, как правило, выбирают так, чтобы она была меньше чем и иногда равной максимальной конкретной скорости роста клеток. Культуральные текучие среды, содержащие клетки, клеточные продукты, побочные продукты, продукты выделения и т.д. удаляют при такой же скорости или, по существу, такой же скорости. Хемостатные системы обычно предоставляют высокую степень контроля, так как культуры могут уравновешиваться, т.е. достигать устойчивого состояния при конкретной скорости роста, эквивалентной скорости разбавления. Это уравновешивание является определяющим для концентрации клеток, метаболитов, продуктов выделения, экспрессируемых продуктов (например, секретируемых белков) и т.д. Конкретные скорости роста в хемостатных системах являются обычно более низкими, чем максимальная скорость роста, вследствие по меньшей мере одного лимитирующего субстрата. В некоторых системах, однако, устойчивые состояния могут поддерживаться при максимальных удельных скоростях роста посредством контролирования и регулирования биомассы, например, в турбидостатных системах хемостатных культур. Предпочтительно такие хемостатные культуры содержат гомогенное распределение клеток (например, суспензии одиночных клеток) по всему объему биореактора. По сравнению с перфузионной системой, однако, хемостатная система обычно приводит к более низким плотностям клеток. Кроме того, характерным недостатком хемостатных систем является то, что подача клеток не может контролироваться независимо от плотностей клеток в биореакторной системе.

Суспензионные клеточные культуры для получения рекомбинантных белков в не содержащих сыворотку и/или химически определенных средах являются также ограниченными в том, что не содержащие сыворотку и/или химически определенные среды обычно поддерживают более медленные скорости роста по сравнению с клетками, выращенными в средах, содержащих сыворотку. Сниженные скорости роста в культуре означают сниженную выработку полипептида или вируса, представляющих интерес.

Соответственно, существует потребность в разработке систем клеточного культивирования, способных к продолжительной выработке полипептида или вируса, представляющих интерес, особенно для культур, которые могут поддерживаться в течение продолжительных периодов времени, например, для удовлетворения требованиям увеличенной выработки при низких затратах. Настоящее изобретение предоставляет способы и композиции, направленные на удовлетворение этой и других потребностей.

Краткое содержание сущности изобретения

В изобретении раскрыта непрерывная клеточная культура для получения полипептидов и/или вирусов, представляющих интерес, в клетках млекопитающих, конкретно, несубстратзависимых клетках. Способ непрерывного клеточного культивирования, раскрытый здесь, сочетает преимущества перфузионных открытых систем и хемостатных открытых систем и обеспечивает увеличенные плотность клеток и клеточный рост особенно в не содержащих сыворотку или химически определенных средах. Увеличенные плотность клеток и клеточный рост предоставляют улучшенные выходы белков и/или вирусов, представляющих интерес, в то же время обеспечивая больше контроля над параметрами процесса.

Соответственно, один аспект изобретения относится к способу получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре, включающему культивирование клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус в непрерывной системе культивирования клеток, где система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток и имеет скорость разбавления, составляющую меньше чем приблизительно 2 д^-1, и плотность клеток меньше чем приблизительно 2х10⁷ клеток/мл; и извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из среды, удаляемой из системы культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки генетически модифицируют для рекомбинантной экспрессии полипептида и/или вируса, представляющих интерес.

В некоторых вариантах осуществления устройство фиксации клеток выбирают так, чтобы оно было менее способно к удержанию клеток, чем типовые устройства фиксации клеток. В некоторых вариантах осуществления устройство фиксации клеток производит степень фиксации клеток, меньшую чем приблизительно 90%, меньшую чем приблизительно 85%, меньшую чем приблизительно 80% или меньшую чем приблизительно 75%. В некоторых вариантах осуществления устройство фиксации клеток содержит макропористый микроноситель, например частицы на основе целлюлозы.

Скорость разбавления и плотность клеток предпочтительно поддерживают при выбранных значениях или интервалах. В некоторых вариантах осуществления скорость разбавления составляет меньше чем приблизительно 1 д^-1, например между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,0 д^-1. В некоторых вариантах осуществления плотность клеток составляет меньше чем приблизительно 1х10⁷ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления отношение скорости разбавления к удельной скорости роста (Ό/μ) для системы культивирования клеток поддерживают при выбранном значении или интервале. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления система культивирования клеток имеет отношение скорости разбавления к удельной скорости роста, большее чем приблизительно 1, например между приблизительно 1,2 и приблизительно 5,0 или между приблизительно 1,8 и приблизительно 3. В некоторых

- 2 022219 вариантах осуществления удельную скорость роста поддерживают между 0,2 и 0,8 д^-1.

Преимущество некоторых вариантов осуществления системы непрерывного культивирования клеток, описанной здесь, состоит в том, что культура может продлеваться в течение продолжительного периода времени. В некоторых вариантах осуществления, например, скорость разбавления и/или плотность клеток поддерживают, по меньшей мере, в течение приблизительно 80% от времени, в течение которого клетки культивируют в системе непрерывного культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют в системе культивирования клеток в течение более чем 20 дней, предпочтительно более чем 40 дней и более предпочтительно более чем 50 дней, например, обеспечивая увеличенное получение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, потенциально при низких затратах.

Еще одним преимуществом некоторых вариантов осуществления системы непрерывного культивирования клеток является увеличение объемной производительности вследствие более высокой плотности клеток по сравнению с типовой хемостатной культурой. Например, в конкретных предпочтительных вариантах осуществления объемная производительность увеличивается на 70, 90% или более. Еще одним другим преимуществом некоторых вариантов осуществления системы непрерывного культивирования клеток является улучшенная удельная активность извлекаемого белка вследствие, например, сниженного времени пребывания в аппарате для культивирования, которое может иметь благоприятный эффект на стабильность, структуру и/или функцию белка.

Еще одно преимущество некоторых вариантов осуществления системы непрерывного культивирования клеток, описанной здесь, состоит в том, что система является подверженной масштабированию для крупномасштабных производств. А именно посредством обеспечения увеличенных плотности клеток и/или клеточного роста по сравнению со стандартными системами хемостатного культивирования система непрерывного культивирования клеток, раскрытая здесь, предоставляет промышленное производство полипептида и/или вируса, представляющих интерес. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки культивируют по меньшей мере в приблизительно 250 л среды, например по меньшей мере приблизительно 500 л или по меньшей мере приблизительно 1000 л среды. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетки культивируют в средах, не содержащих сыворотку и/или химически определенных средах.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию предварительного культивирования, например, для адаптации клеток для получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в системе непрерывного культивирования клеток, как описано здесь. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает перед стадией культивирования предварительное культивирование клеток в суспензии, например, до тех пор, пока культура не достигнет надлежащего объема.

В частном варианте осуществления полипептид, представляющий интерес, является подобным дезинтегрину и металлопептидазой с белком тромбоспондинового типа 1 мотива 13 (ΑΌΑΜΤ813). В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих представляют собой СНО клетки, например СНО клетки, генетически модифицированные для экспрессии белка ΑΟΑΜΤ813. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу для получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре, включающему (а) культивирование несубстратзависимых клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в системе непрерывного культивирования клеток, где система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток, имеющее степень фиксации клеток меньше чем 90%, и имеет скорость разбавления (Ό) от 0,1 до 1,0 д^-1 и плотность клеток меньше чем 1х 10⁷ клеток/мл; и (Ь) извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из среды, удаляемой из системы культивирования клеток.

В еще одном частном варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре, включающему (а) культивирование несубстратзависимых СНО клеток, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в системе непрерывного культивирования клеток, где система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток с макропористым микроносителем, имеющим степень удерживания клеток менее чем 90% и имеет скорость разбавления (Ό) от 0,1 до 1,0 д^-1 и плотность клеток менее чем 1х 10⁷ клеток/мл; и (Ь) извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из среды, удаляемой из системы культивирования клеток.

В еще одном другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу получения ΑΟΑΜΤ813 в непрерывной клеточной культуре, включающему: (а) культивирование несубстратзависимых клеток млекопитающих, экспрессирующих рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤ813, в системе непрерывного культивирования клеток, где система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток с макропористым микроносителем, имеющее степень фиксации клеток меньше чем 90% и имеет скорость разбавления (Ό) от 0,1 до 1,0 д^-1 и плотность клеток меньше чем 1х10⁷ клеток/мл; и (Ь) извлечение ΑΟΑΜΤ813 из среды, удаляемой из системы культивирования клеток.

В еще одном другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу полу- 3 022219 чения полипептида и/или вируса, представляющих интерес, в непрерывной клеточной культуре, включающему: (а) культивирование несубстратзависимых клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в системе непрерывного культивирования клеток, где система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток, имеющее степень фиксации клеток меньше чем 90%, и имеет скорость разбавления (Ό) от 0,1 до 1,0 д^-1, плотность клеток меньше чем 1х 10⁷ клеток/мл и отношение скорости разбавления к удельной скорости роста (Ό/μ) от 1,2 до 5; и (Ь) извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из среды, удаляемой из системы культивирования клеток; и дополнительно, где клетки культивируют в системе культивирования клеток в течение более чем 50 дней, и скорость разбавления, плотность клеток и отношение скорости разбавления к удельной скорости роста каждое поддерживают в течение по меньшей мере 80% от времени, в течение которого клетки культивируют в системе культивирования клеток.

Дополнительный аспект изобретения относится к композиции, содержащей полипептид и/или вирус, представляющие интерес, полученные в соответствии со способами, описанными здесь, например композиции, содержащей рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤ813, полученный соответственно.

Эти и другие аспекты изобретения описаны более подробно ниже.

Подробное описание изобретения

Система непрерывного культивирования клеток, как описана здесь, сочетает некоторые из преимуществ как перфузионной культуры, так и хемостатной культуры клеток млекопитающих. Как описано выше, системы с перфузионной культурой эксплуатируют со свежей средой, перфузируемой через культуру клеток, в то время как клетки удерживаются с использованием устройства фиксации клеток: системы с хемостатной культурой эксплуатируют с непрерывным притоком среды и оттоком клеток и продуктов без устройства фиксации клеток.

В рамках изобретения перфузионная относится к непрерывному потоку раствора физиологического питательного компонента при устойчивой скорости через популяцию клеток или над ней. Поскольку перфузионные системы обычно включают удерживание клеток в аппарате для культивирования, перфузионные культуры типично имеют относительно высокие плотности клеток, но условия культивирования трудно при этом поддерживать и контролировать. В дополнение, поскольку клетки выращивают и затем удерживают в аппарате для культивирования при высоких плотностях, скорость роста обычно непрерывно снижается с течением времени, приводя к поздней экспоненциальной или даже стационарной фазе клеточного роста. Напротив, хемостатная в рамках изобретения относится к непрерывному притоку раствора физиологического питательного компонента в сочетании с непрерывным оттоком клеток и других продуктов с удаленными средами через культуру клеток, например, как в хемостатных системах. Однако, так как клетки непрерывно удаляются, хемостатная система обычно поддерживает только более низкие плотности клеток.

Стратегия непрерывного культивирования, описанная здесь, обычно включает культивирование клеток млекопитающих, например несубстратзависимых клеток, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, во время фазы выработки в системе непрерывного культивирования клеток. Под несубстратзависимыми клетками подразумевают клетки, свободно размножающиеся в суспензии по всему объему культуры, в противоположность прикрепленным или фиксированным к твердому субстрату во время размножения. Система непрерывного культивирования клеток будет содержать устройство фиксации клеток, аналогичное устройству, используемому в перфузионной системе, но которое обеспечивает непрерывное удаление значительной части клеток предпочтительно таким образом, что удерживается меньшее в процентном отношении количество клеток, чем в перфузионной культуре. Устройство фиксации клеток означает любую структуру, способную к удержанию клеток, особенно несубстратзависимых клеток, в конкретном расположении во время культивирования клеток. Неограничивающие примеры включают микроносители, мелкоячеистые центробежные фильтры, полые волокна, плоские мембранные фильтры, пробирки для осаждения, ультразвуковые устройства фиксации клеток и т.п., которые могут удерживать несубстратзависимые клетки в биореакторах. Полипептиды и/или вирусы, представляющие интерес (например, рекомбинантный полипептид и/или рекомбинантный вирус), могут быть извлечены из системы культивирования клеток, например из среды, удаляемой из системы культивирования клеток.

Способ получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес (например, рекомбинантного полипептида и/или рекомбинантного вируса), раскрытый здесь, включает в себя способ культивирования клеток, который предоставляет хемостат-подобную систему культивирования и который использует устройство фиксации клеток. Система включает культивирование клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в системе непрерывного культивирования клеток с устройством фиксации клеток. Роль устройства фиксации клеток заключается в предотвращении удаления из культуры части, предпочтительно значительной части жизнеспособных клеток во время пополнения израсходованной культуральной среды свежей средой. Успешное устройство фиксации клеток должно удовлетворять максимально возможному количеству из следующих требований: (1) минимальное повреждение клеток или воздействие на клеточный рост и производительность, (2) селективное

- 4 022219 удерживание только жизнеспособных клеток (нежизнеспособные клетки предпочтительно удаляют из культуры, поскольку они высвобождают токсичные метаболиты в окружающую культуру среду), (3) непрерываемая эксплуатация в течение длительных периодов культивирования, (4) низкое потребление энергии, (5) простота в эксплуатации и поддержании, (6) способность к масштабированию для аппаратов крупномасштабного производства, (7) компактная структура и (8) экономическая эффективность.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления используемое устройство фиксации клеток позволяет осуществить частичное удерживание клеток. Устройства и/или способы фиксации клеток являются хорошо известными в области. Многие основаны на традиционных методах осаждения, центрифугирования и/или фильтрации. Неограничивающие примеры устройств фиксации клеток включают микроносители, вращающиеся фильтры, такие как мелкоячеистые центробежные фильтры, полые волокна, плоские мембранные фильтры, пробирки для осаждения, ультразвуковые устройства фиксации клеток, гравитационные осадители, центрифуги, акустические клеточные фильтры, клеточные сепараторы на основе диэлектрофореза и т.п. (см., например, патенты США № 5019512; 5626734, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

В соответствии с одним вариантом осуществления системы культивирования, описанной здесь, в качестве устройства фиксации клеток могут применяться микроносители. Микроноситель может действовать в качестве экономичной масштабируемой поверхности, на которой несубстратзависимые клетки могут быть иммобилизованы, чтобы способствовать удерживанию клеток. В рамках изобретения термин микроносители относится к частицам, достаточно мелким для применения в суспензионных культурах, предпочтительно со скоростью перемешивания, которая не вызывает значительного сдвигового повреждения клеток. Микроносители могут быть твердыми, пористыми или иметь твердую сердцевину с пористым покрытием. Микроносители могут, например, без ограничения, быть на основе целлюлозы или декстрана, и их поверхности (внешняя и внутренняя поверхность в случае пористых носителей) могут быть положительно заряженными. Дополнительные подробности, касающиеся микроносителей, можно найти, например, в \ЧО 02/29083, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В одном варианте осуществления микроноситель представляет собой макропористый микроноситель. В рамках изобретения термин макропористые микроносители относится к частицам, например частицам на основе целлюлозы, которые имеют следующие свойства: (а) они являются достаточно мелкими, чтобы обеспечить применение в суспензионных культурах предпочтительно при скорости перемешивания, которая не вызывает значительного сдвигового повреждения клеток; и (Ь) они имеют поры и внутренние пространства достаточного размера для обеспечения миграции клеток во внутренние пространства. Их поверхности (внешние и внутренние) могут в одном варианте осуществления быть положительно заряженными. В одном варианте осуществления носители: (а) имеют общий диаметр частицы между приблизительно 150 и приблизительно 350 мкм; (Ь) имеют средний диаметр отверстия пор между приблизительно 15 и приблизительно 40 мкм и (с) имеют плотность положительного заряда между приблизительно 0,8 и 2,0 мэкв/г. В некоторых вариантах осуществления положительный заряд предоставлен ΌΕΑΕ (М,И-диэтиламиноэтил)группами. Применимые макропористые микроносители включают, без ограничения, СУТОРОКЕ 1™ и СУТОРОКЕ 2™ (СЕ НсаИйсатс ЫГе Зсюпссх. Р18са1аиау, N1). Особенно применимые макропористые микроносители представляют собой носители СУТОРОКЕ 2™, которые имеют средний диаметр частиц, равный 230 мкм, средний размер пор, равный 30 мкм, и плотность положительного заряда, равную 1,8 мэкв/г.

В некоторых вариантах осуществления аппараты для культивирования подвергают механическому возмущению. Возмущение может включать в себя встряхивание, перемешивание, качание, вибрацию, или т.п., как известно в области. В предпочтительном варианте осуществления возмущение достигается с помощью мешалки Раштона с перегородками. Перегородки могут находиться при приблизительно 140 об/мин, что соответствует вводу удельной входной мощности/объем, равной приблизительно 40 Вт/м³. В некоторых вариантах осуществления удельная входная мощность/объем составляет более чем приблизительно 40 Вт/м³, например приблизительно 50 Вт/м³, приблизительно 60 Вт/м³, приблизительно 70 Вт/м³, приблизительно 80 Вт/м³ или более. Другие скорости могут применяться по необходимости в соответствии с конкретными используемыми клетками или культурой.

Концентрация микроносителей, как описано здесь, в целом, является низкой, например, чтобы способствовать поддержанию скорости разбавления и плотности клеток в конкретных интервалах. В одном варианте осуществления аппарат для культивирования может содержать количество микроносителей, соответствующее конечной концентрации микроносителей в интервале 0,05-1,0 г/л. В одном варианте осуществления конечная концентрация микроносителя составляет приблизительно 0,05-0,1 г/л. В одном варианте осуществления конечная концентрация микроносителя составляет приблизительно 0,1-0,25 г/л. В еще одном варианте осуществления конечная концентрация микроносителя составляет приблизительно 0,25-0,5 г/л. В еще одном варианте осуществления конечная концентрация микроносителя составляет приблизительно 0,5-0,75 г/л. В еще одном варианте осуществления конечная концентрация микроносителя составляет приблизительно 0,75-1,0 г/л. В еще одном варианте осуществления концентрация носи- 5 022219 теля может быть увеличена или снижена во время непрерывного культивирования, например, для регуляции плотностей клеток и скоростей разбавления в предварительно определенных интервалах.

Раскрытая система непрерывного культивирования клеток имеет предпочтительную скорость разбавления (Ό) и предпочтительную плотность клеток. Конкретно, скорость разбавления и плотность клеток поддерживают при предварительно определенных значениях или в пределах предварительно определенных интервалов. Кроме того, раскрытая система непрерывного культивирования клеток может иметь минимальную удельную скорость роста или предварительно определенный интервал удельных скоростей роста в течение полного времени процесса.

Скорость разбавления (Ό) относится к объему среды, подаваемому в день, разделенному на объем культуры. Хотя система непрерывного культивирования клеток, описанная здесь, включает в себя фиксацию клеток, скорость разбавления системы непрерывного культивирования клеток, в целом, составляет меньше, чем такая же скорость для перфузионной культуры, например меньше чем приблизительно 2 объема разбавления/день (2 д^-1). В одном варианте осуществления скорость разбавления поддерживают между более чем приблизительно 0,2 д^-1 до меньше чем приблизительно 2,0 д^-1. В еще одном варианте осуществления скорость разбавления поддерживают при меньше чем приблизительно 2,0 д^-1, например меньше чем приблизительно 1,8 д^-1, например меньше чем приблизительно 1,5 д^-1, например меньше чем приблизительно 1,2 д^-1 и т.д. В еще одном варианте осуществления скорость разбавления поддерживают при меньше чем приблизительно 1,0 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,9 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,8 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,7 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,6 д^-1 и т.д. В еще одном варианте осуществления скорость разбавления поддерживают при более чем приблизительно 0,2 д^-1, например более чем приблизительно 0,3 д^-1, например более чем приблизительно 0,4 д^-1, например более чем приблизительно 0,5 д^-1 и т.д.

Дополнительно, в системе непрерывного культивирования клеток, как описано здесь, плотность клеток поддерживают при значении, меньшем, чем значение, поддерживаемое в перфузионной системе культивирования, но более высоком, чем плотности клеток, достигаемые в хемостатной системе. В одном варианте осуществления плотность клеток составляет меньше чем приблизительно 2х10⁷ клеток/мл, например меньше чем приблизительно 1,5х10⁷ клеток/мл, например меньше чем приблизительно 1х10⁷ клеток/мл, например меньше чем приблизительно 8х10⁶ клеток/мл, например меньше чем приблизительно 6х10⁶ клеток/мл, например меньше чем приблизительно 5х10⁶ клеток/мл. В еще одном варианте осуществления плотность клеток может составлять более чем приблизительно 1,0х10⁶ клеток/мл, например более чем приблизительно 1,5х10⁶ клеток/мл, например более чем приблизительно 2х10⁶ клеток/мл, например более чем приблизительно 3х10⁶ клеток/мл, например более чем приблизительно 4х10⁶ клеток/мл и т.д. В еще одном варианте осуществления, плотность клеток поддерживают между от приблизительно 1,0х10⁶ клеток/мл до приблизительно 2х10⁶ клеток/мл. В еще одном варианте осуществления плотность клеток поддерживают между от приблизительно 2х10⁶ клеток/мл до приблизительно 4х10⁶ клеток/мл. В еще одном варианте осуществления плотность клеток поддерживают между от приблизительно 5х10⁶ клеток/мл до приблизительно 1х10⁷ клеток/мл, например между от приблизительно 6х10⁶ клеток/мл до приблизительно 8х10⁶ клеток/мл. В еще одном варианте осуществления плотность клеток поддерживают между от приблизительно 1х 10⁷ клеток/мл до приблизительно 2х 10⁷ клеток/мл.

Квалифицированный специалист в данной области сможет осознать, что механизм, посредством которого могут поддерживаться плотности клеток, включает в себя снижение части клеток, удерживаемых с помощью устройства фиксации клеток, т.е. степени фиксации клеток. В целом, перфузионная культура имеет степень фиксации клеток, большую чем 90 или 95% и во многих случаях близкую 100%. В раскрытой системе непрерывного культивирования клеток степень фиксации клеток составляет меньше чем 90%. В одном варианте осуществления фиксация клеток составляет меньше чем приблизительно 85%, например меньше чем приблизительно 75%. В одном варианте осуществления степень фиксации клеток составляет меньше чем приблизительно 70%, например меньше чем приблизительно 60%, например меньше чем приблизительно 50%, например меньше чем приблизительно 40%, например меньше чем приблизительно 30%. В одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 30% и приблизительно 90%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 30% и приблизительно 80%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 30% и приблизительно 70%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 40% и приблизительно 60%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 40% и приблизительно 70%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 50% и приблизительно 90%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 60% и приблизительно 90%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 70% и приблизительно 90%. В еще одном варианте осуществления фиксацию клеток поддерживают между приблизительно 80% и приблизительно 90%.

Культура может также характеризоваться отношением скорости разбавления к удельной скорости роста. Удельная скорость роста (μ) относится к увеличению клеточной массы на клеточную массу в день

- 6 022219 (относительно общей клеточной массы): μ= (1η(Χ_ί/Χ_ί-1))/((1)-(ΐ-1)), где X является концентрацией биомассы при времени (() и Χ_ί-1 относится к биомассе при предыдущей временной точке. В целом, удельная скорость роста системы непрерывного культивирования, как описано здесь, должна быть постоянной в пределах предварительно определенного интервала и предпочтительно с определенным минимальным уровнем для обеспечения минимальной ассоциированной с ростом экспрессии полипептида и/или вируса. Например, удельная скорость роста системы непрерывного культивирования, описанной здесь, может составлять от приблизительно 0,1 д^-1 до приблизительно 1,0 д^-1. В одном варианте осуществления удельная скорость роста, поддерживаемая системой непрерывного культивирования, описанной здесь, составляет больше чем приблизительно 0,1 д^-1, например больше чем приблизительно 0,15 д^-1, например больше чем приблизительно 0,2 д^-1, например больше чем приблизительно 0,25 д^-1, например больше чем приблизительно 0,3 д^-1, например больше чем приблизительно 0,35 д^-1 и т.д. В еще одном варианте осуществления удельная скорость роста, поддерживаемая системой непрерывного культивирования, описанной здесь, составляет меньше чем приблизительно 1,0 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,8 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,7 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,6 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,5 д^-1, например меньше чем приблизительно 0,45 д^-1. В еще одном варианте осуществления удельная скорость роста может поддерживаться между приблизительно 0,1 д^-1 до приблизительно 0,45 д^-1. В одном варианте осуществления удельная скорость роста, поддерживаемая системой непрерывного культивирования, описанной здесь, составляет между от приблизительно 0,15 д^-1 до приблизительно 0,3 д^-1. В одном варианте осуществления удельная скорость роста, поддерживаемая системой непрерывного культивирования, описанной здесь, составляет между приблизительно 0,2 д^-1 до приблизительно 0,25 д^-1.

Как описано ниже, система непрерывного культивирования, раскрытая здесь, поддерживает плотность клеток меньше чем приблизительно 2х10⁷ клеток/мл. Механизм, посредством которого плотности клеток могут поддерживаться, как описано ниже, включает в себя поддержание отношения конкретной скорости разбавления к удельной скорости роста. Хемостатные культуры имеют скорости разбавления, приблизительно равные удельным скоростям роста для отношения Ό/μ, равного приблизительно 1. Перфузионные культуры, как правило, имеют более высокие абсолютные скорости разбавления и очень низкие удельные скорости роста, так, что отношение Ό/μ составляет значительно больше чем 1. В системе непрерывного культивирования, раскрытой здесь, однако предпочтительно поддерживают скорость разбавления, которая является слегка выше, чем удельная скорость роста. Соответственно, в непрерывной культуре, раскрытой здесь, поддерживают отношение Ό/μ, большее чем 1. В особенно предпочтительных вариантах осуществления скорость разбавления рассчитывают и устанавливают в соответствии с эффективностью устройства фиксации таким образом, чтобы поддерживать удельную скорость роста в пределах предварительно определенного интервала. В одном варианте осуществления отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет больше чем приблизительно 1,0, например больше чем приблизительно 1,2, например больше чем приблизительно 1,5, например, больше чем приблизительно 2, например больше чем приблизительно 2,5. В еще одном варианте осуществления отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет меньше чем приблизительно 5, например меньше чем приблизительно 4, например меньше чем приблизительно 3. В одном варианте осуществления отношение Ό/μ составляет между приблизительно 1,2 и приблизительно 5. В еще одном варианте осуществления отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет между приблизительно 1,8 и приблизительно 3. В еще одном варианте осуществления отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет между приблизительно 2,0 и приблизительно 2,5.

Способы изобретения могут осуществляться в соответствующем аппарате для культивирования или биореакторе. Биореактор может иметь любой размер, постольку, поскольку он является применимым для культивирования клеток, например клеток млекопитающих. Поскольку процессы с низкими плотностями клеток, в целом, являются простыми для масштабирования, способы изобретения могут быть особенно преимущественными для крупномасштабного культивирования (т.е. с объемами культуры больше чем 250 л) и могут быть особенно подвержены масштабированию от небольших, лабораторных культур (например, 10 л) до культур промышленного масштаба (например, 250 л и свыше) с минимальной модификацией условий культивирования. Внутренние условия аппарата для культивирования, включающие, но не ограниченные рН, рО₂ и температурой, обычно контролируют во время периода культивирования. Производственный аппарат для культивирования относится к конечному аппарату для культивирования, используемому при получении полипептида, вируса и/или любого другого продукта, представляющего интерес. Объем крупномасштабного производственного аппарата для культивирования, в целом, составляет больше чем приблизительно 250 л и может составлять приблизительно 300, приблизительно 500, приблизительно 800, приблизительно 1000, приблизительно 2500, приблизительно 5000, приблизительно 8000, приблизительно 10000, приблизительно 120000 л или более или любой промежуточный объем. Подходящий аппарат для культивирования или производственный аппарат для культивирования могут быть составлены из (т.е. сконструированы из) любого материала, который является пригодным для удерживания клеточных культур, суспендированных в средах при условиях культивирования, преду- 7 022219 смотренных здесь, и материала, который является благоприятным для клеточного роста и жизнеспособности млекопитающих. Примеры подходящих материалов включают, без ограничения, стекло, пластик и/или металл. В предпочтительных вариантах осуществления материал(ы) не оказывают воздействия или не оказывают значительного воздействия или не оказывают воздействия, по существу, на экспрессию и/или стабильность желательного продукта, например полипептида и/или вируса, представляющих интерес.

Квалифицированный специалист в области будет осведомлен и будет в состоянии выбрать подходящие аппараты для культивирования для применения в практическом осуществлении настоящей системы непрерывного культивирования.

В некоторых вариантах осуществления процесс культивирования клеток эксплуатируют в более чем одном отдельных аппаратах для культивирования, таким образом, как применение одного или более посевного (для размножения) аппарата (аппаратов) для культивирования с последующим использованием производственного аппарата для культивирования. В некоторых вариантах осуществления затем процесс включает в себя перенос приблизительно 50 л размноженной посевной культуры (имеющей приблизительно 1,0х10⁶ клеток/мл) в аппарат для культивирования объемом 250 л, содержащий приблизительно 150 л культуральной среды. В целом, систему непрерывного культивирования, описанную здесь, применяют только для производственных аппаратов для культивирования. Например, посевные клетки млекопитающих могут сначала быть размножены, например, в периодической, периодической с подпиткой, перфузионной и/или хемостатных системах, в одном или более посевных аппаратах для культивирования. После переноса клеток в производственный аппарат для культивирования клетки могут культивироваться в соответствии с системой непрерывного культивирования, как описано здесь, например, с устройством фиксации клеток в системе культивирования клеток, имеющей скорость разбавления, составляющую меньше чем приблизительно 2 д^-1, и плотность клеток меньше чем приблизительно 2х10⁷ клеток/мл.

Альтернативно, распространение клеток в производственный аппарат для культивирования и фаза получения могут осуществляться в одном физическом аппарате для культивирования. Например, клетки могут распространяться до конечного производственного масштаба и процесс может переводиться на условия получения, при этом могут использоваться условия для системы непрерывного культивирования клеток, описанной здесь.

Неожиданно было обнаружено, что способы культивирования изобретения могут применяться для поддержания плотностей клеток и скорости разбавления в пределах предварительно определенных интервалов, например, для поддержания фаз получения с продолжительностью, сходной с продолжительностью для хемостатных или перфузионных систем. Под предварительно определенными интервалами подразумевают целевые интервалы, например интервалы, описанные здесь, для эксплуатации систем непрерывного культивирования в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Например, в некоторых вариантах осуществления целевой интервал для скорости разбавления составляет между 0,2 до 2,0 д^-1 л и плотность клеток составляет меньше чем 2х10⁷ клеток/мл. В еще одном варианте осуществления скорость разбавления поддерживают при меньше чем 2,0 д^-1, например меньше чем 1,8 д^-1, например меньше чем 1,5 д^-1 или, например, меньше чем 1,2 д^-1 и плотность клеток составляет меньше чем 1,5х10⁷ клеток/мл, например меньше чем 1х10⁷ клеток/мл или, например, меньше чем 8х10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления удельная скорость роста составляет от 0,1 до 1,0 д^-1 и отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет между 1,2 и 5. В некоторых вариантах осуществления целевой интервал для скорости разбавления составляет между от 0,5 до 1,0 д^-1 и плотность клеток составляет меньше чем 5х10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления удельная скорость роста составляет от 0,15 до 0,3 д^-1 и отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет между 1,8 и 3. В некоторых вариантах осуществления удельная скорость роста составляет от 0,2 до 0,25 д^-1 и отношение скорости разбавления к удельной скорости роста составляет между 2,0 и 2,5. В особенно предпочтительном варианте осуществления плотность клеток составляет 5х10⁶ клеток/мл или меньше, скорость разбавления составляет меньше чем 0,6 д^-1 и удельная скорость роста составляет от 0,18 до 0,27 д^-1. В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления плотность клеток составляет меньше чем 5х10⁶ клеток/мл, скорость разбавления составляет между 0,55 и 0,6 д^-1 и удельная скорость роста составляет от 0,16 до 0,26 д^-1. Варианты осуществления включают поддержание скорости разбавления и/или плотности клеток и/или удельной скорости роста и/или отношения скорости разбавления к удельной скорости роста в пределах целевого интервала (например, установленных выше) для по меньшей мере приблизительно 50%, например по меньшей мере приблизительно 60%, например по меньшей мере приблизительно 70%, например по меньшей мере приблизительно 80%, например по меньшей мере приблизительно 90%, например по меньшей мере приблизительно 95%, например по меньшей мере приблизительно 98% от общего времени непрерывного культивирования и/или времени фазы получения.

Система непрерывного культивирования клеток, описанная здесь, может обеспечить продолжительное получение полипептида и/или вируса, представляющих интерес, из клеток млекопитающих. В

- 8 022219 некоторых вариантах осуществления клетки культивируют в течение полного времени непрерывного культивирования клеток, равного более чем приблизительно 7 дней. В более предпочтительных вариантах осуществления клетки культивируют в течение более чем приблизительно 9 дней, более чем приблизительно 14 дней, более чем приблизительно 21 дня, более чем приблизительно 28 дней, более чем приблизительно 35 дней, более чем приблизительно 40 дней, более чем приблизительно 45 дней или более чем приблизительно 50 дней.

Термины клеточная культуральная среда и культуральная среда (или просто среда) относятся к раствору питательного компонента, используемому для выращивания эукариотных клеток, который обычно предоставляет по меньшей мере один компонент из одной или более из следующих категорий: (1) соли (например, натрия, калия, магния, кальция и т.д.), способствующие осмоляльности среды; (2) источник энергии, обычно в виде углевода, такого как глюкоза; (3) все незаменимые аминокислоты, и, обычно, основной набор двадцати аминокислот; (4) витамины и/или другие органические соединения, требуемые при низких концентрациях: и (5) следовые элементы, где следовые элементы определяют как неорганические соединения, которые обычно требуются при очень низких концентрациях, обычно в микромолярном интервале. Раствор питательных компонентов может необязательно быть дополнен одним или более компонентами из любых следующих категорий: (а) животная сыворотка; (Ь) гормоны и другие факторы роста, такие как, например, инсулин, трансферрин и эпидермальный фактор роста; и (с) гидролизаты растений, дрожжей и/или тканей, включая их белковые гидролизаты.

Настоящая система непрерывного культивирования находит конкретное применение при культивировании клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, представляющие интерес, в среде, не содержащей сыворотку, химически определенной среде или среде с отсутствием компонентов животного происхождения. Химически определенные среды представляют собой среды, в которых все компоненты имеют известную химическую структуру. Химически определенные среды являются доступными от промышленных поставщиков, таких как, например, 81дта, ТКН Вюкаепсек, О1Ьсо и Оетш. В других вариантах осуществления изобретения среда может содержать аминокислоты, полученные из любого источника или способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, аминокислоту (аминокислоты), полученные в результате добавления одной или более аминокислот или добавления пептонного или белкового гидролизата (включая гидролизат из животного, дрожжевого или растительного источника (источников).

Может применяться любая клеточная культуральная среда, которая поддерживает клеточный рост и обеспечивает поддержание при условиях изобретения. Обычно, среда содержит воду, регулятор осмоляльности, буфер, источник энергии, аминокислоты, неорганический или рекомбинантный источник железа, один или более синтетических или рекомбинантных факторов роста, витамины и кофакторы. В предпочтительных вариантах осуществления в культуральной среде отсутствуют компоненты животного происхождения. В рамках изобретения животного происхождения компоненты представляют собой любые компоненты, которые вырабатываются в интактном животном (такие как, например, белки, выделенные и очищенные из сыворотки) или полученные с использованием компонентов, полученных в интактном животном (такие как, например, аминокислота, полученная с использованием фермента, выделенного и очищенного из животного, для гидролиза вещества растительного источника). Напротив, белок, который имеет последовательность животного белка (т.е. имеет геномное происхождение в животном), но который получают ίη νίίτο в культуре клеток (такой как, например, в рекомбинантных дрожжевых или бактериальных клетках или в установленной непрерывной эукариотной клеточной линии, рекомбинантной или нет), с использованием сред с отсутствием компонентов, полученных в или выделенных и очищенных из интактного животного, не является компонентом животного происхождения. Например, инсулин, продуцируемый в дрожжевой или бактериальной клетке, или инсулин, продуцируемый в установленной линии клеток млекопитающего, такой как, например, клетки СНО, ВНК или НЕК, или интерферон, продуцируемый в клетках Ναιηαίινα. не составляют компонент животного происхождения. Соответственно, клеточная культуральная среда с отсутствием компонентов животного происхождения является средой, которая может содержать животные белки, которые получают рекомбинантно; такая среда, однако, не содержит, например, животную сыворотку или белки или другие продукты, очищенные из животной сыворотки. Такая среда может, например, содержать один или более компонентов, полученных из растений.

В еще других вариантах осуществления изобретения среда, используемая во время фазы клеточного роста, содержит концентрированную среду, т.е. среду, которая содержит более высокие концентрации питательных компонентов, чем обычно необходимо и обычно предоставляемых в растущую культуру. Квалифицированный специалист в области сможет выяснить, какие клеточные среды, инокуляционные среды и т.д., соответствуют культуре конкретных клеток, например животных клеток (например, клеток СНО). Например, специалист в данной области будет в состоянии подходящим образом выбрать для конкретной культуры количество глюкозы и других питательных компонентов, таких как глутамин, железо, следовые элементы и т.п., а также другие переменные для культуры, такие как, например, количество вспенивания, осмолярность и т.д. (см., например, МаШет, ТР. еί а1. (1999) СиЙиге теШа, атта1 се11к, 1агде кса1е ргоТисйоп, Епсус1ореФа оТ Вюргосекк ТесЬпоГоду: Реттейайоп, ВюсаЮРык и ВюкерагаИоп,

- 9 022219 νοί. 2:777-785 (особенно с. от 780 до 783); опубликованная патентная заявка США № 2006/0121568 (особенно параграфы от [0144] до [0185] и от [0203] до [0331]); которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки). Настоящее изобретение также включает варианты таких известных сред, включая, например, обогащенные питательными компонентами варианты таких сред, концентрированные среды, химически определенные среды, не содержащие сыворотки среды, и среды, иным образом модифицированные в соответствии с разнообразными вариантами осуществления изобретения.

Система непрерывного культивирования не является ограниченной любым типом несубстратзависимых клеток млекопитающих. Клетки млекопитающих могут представлять собой генетически модифицированные клетки млекопитающих, экспрессирующие рекомбинантный полипептид (и/или рекомбинантный вирус), представляющие интерес, или немодифицированные клетки млекопитающих, экспрессирующие полипептид (и/или вирус), представляющие интерес. Ряд клеточных линий млекопитающих являются подходящими клетками-хозяевами для рекомбинантной экспрессии полипептидов и/или вирусов. Линии клеток-хозяев млекопитающих включают, например, СО8, РЕК.С6, ТМ4, УЕКО, МОСК. ΒΚΕ-3Ά, Ж38, Нер 02, ММТ, МКС 5, Р84, СНО, 293Т, А431, 3Т3, СУ-1, С3Н10Т1/2, Со1о205, 293, НеЬа, Ь клетки, ВНК, НЬ-60, РКЬЬ-2, И937, НаК, .ΙιιιΈιΙ клетки, Ка12. ВаЕ3, 32Ό, РОСР-!. РС12, М1х, мышиные миеломы (например, 8Р2/0 и N80) и С2С12 клетки, а также тансформированные клеточные линии приматов, гибридомы, нормальные диплоидные линии и клеточные штаммы, полученные из культуры ίη νίίτο первичной ткани и первичных эксплантатов. Любые клетки млекопитающих, которые могут быть адаптированы для суспензионной культуры, могут применяться в раскрытом способе культивирования клеток. Неограничивающий пример включает СНО клетки, которые являются субстратзависимыми при культивировании в присутствии сыворотки и подходящих поверхностей, но легко адаптируются для роста в суспензионной культуре (см., например, Кактиккеп 1998, СуЮ1есЬпо1оду 28: рр.31-42, особенно с. 34-37, касающиеся культивирования не содержащей сыворотки клеточной линии СНО). Также любые клетки млекопитающих, способные к экспрессии полипептида и/или вируса, представляющих интерес (либо полученные рекомбинантно или нет), могут применяться в раскрытых способах культивирования клеток. В одном варианте осуществления способ непрерывного клеточного культивирования, раскрытый здесь, может применяться для адаптации субстратзависимой клеточной линии к несубстратзависимой клеточной линии. Многочисленные клеточные линии являются доступными из промышленных источников, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС). В одном варианте осуществления систему непрерывного культивирования клеток применяют для культивирования генетически модифицированных клеток СНО.

Как описано здесь, система непрерывного культивирования клеток позволяет проводить извлечение полипептида и/или вируса, представляющих интерес (например, рекомбинантного полипептида и/или рекомбинантного вируса). Полипептид и/или вирус обычно извлекают из отработанной среды, которую удаляют из системы. Преимущества предпочтительных вариантов осуществления изобретения включают снижение времени пребывания белка и/или вируса в биореакторе, которое особенно применимо для продуктов, подверженных деградации. Однако система непрерывного культивирования клеток, как раскрыто здесь, не ограничивается такими лабильными полипептидами или вирусами и может применяться для извлечения других полипептидов или вирусов, представляющих интерес.

Настоящее изобретение относится к способам для улучшенного крупномасштабного непрерывного культивирования клеток млекопитающих, которые экспрессируют один или более белков и/или вирусов, представляющих интерес, либо из эндогенных генов или природной инфекции, или вслед за введением в такие клетки рекомбинантных генов, кодирующих белок или вирус, представляющие интерес. Такие белки включают, как неограничивающие примеры, ферменты, гормоны, антитела, белковые рецепторы, гибридные белки (например, гибриды растворимых рецепторов и Рс доменов 1дО), вакцины, цитокины, хемокины, факторы роста, белки факторов крови и т.д. В одном варианте осуществления белок, представляющий интерес, представляет собой ΑΌΑΜΤ813. В еще одном варианте осуществления белок, представляющий интерес, является фактором VII или фактором VIII. В еще одном варианте осуществления белок, представляющий интерес, является ингибитором альфа-1-протеазы.

Настоящее изобретение также относится к способам для улучшенного крупномасштабного непрерывного культивирования клеток млекопитающих, которые экспрессируют один или более вирусов, представляющих интерес (включая вирусные частицы и вирусные векторы), либо дикого типа или рекомбинантные. Неограничивающие примеры таких дикого типа или рекомбинантных вирусов, вирусных частиц и/или вирусных векторов включают аденовирусы, вирусы герпеса, ретровирусы, лентивирусы, вирусы гриппа и т.д. Получение рекомбинантных вирусов, вирусных частиц и применение рекомбинантных вирусных векторов является хорошо известным в данной области. Для экспрессии вируса способ в соответствии с изобретением является особенно подходящим для, но не ограниченным инфекцией и экспрессией нелитических вирусов, таких как, например, гепатита А и ТВЕ в, например, клетках Уега, или лентивируса в, например, НЕК293 или других клеточных линиях людей или млекопитающих.

Как только среду удаляют из аппарата для культивирования, она может быть подвергнута одной или более стадиям обработки для получения белка и/или вируса, представляющих интерес. Стадии последовательной обработки включают, без ограничения, центрифугирование и/или фильтрацию для уда- 10 022219 ления клеток, ранее не удаленных с культурой; аффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием; ионообменную хроматографию; эксклюзионную хроматографию; электрофоретические методики (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (ΙΕΡ), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония), экстракцию и т.п. (см., в целом, 8соре5, Рго1с1п РипйсаЕоп, Зргшдег-Уепад, №\ν Уогк, 1982; и Рго1еш РипйсаЕоп, 1-С. Тиъоп и Ьагз Руйеп, еШ1ог8, УСН РиЬ1|5Нег5, №\ν Уогк, 1989).

В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих подвергают стадии предварительного культивирования, например стадии предварительного культивирования адаптируемых клеток для получения полипептида и/или вируса, представляющих интерес. В некоторых вариантах осуществления адаптация включает в себя предварительное культивирование клеток в суспензии, например, в течение времени для обеспечения достижения желательного конечного рабочего объема, например, равного приблизительно 5 л, приблизительно 8 л, приблизительно 10 л, приблизительно 12 л, приблизительно 15 л или приблизительно 20 л и т.д. В этот момент культивирование может быть переведено на непрерывную подпитку средой и эксплуатироваться в соответствии с системой непрерывного культивирования клеток, описанной здесь.

Примерные варианты осуществления изобретения, раскрытого здесь, в дальнейшем обсуждаются в примерах, предоставленных ниже. Примеры, однако, и их конкретные подробности никаким образом не предназначены для ограничения изобретения.

Примеры

Пример 1. Хемостатные культуры получали с рекомбинантной клеточной линией СНО, экспрессирующей человеческий ΑΌΑΜΤ813, в химически определенной среде ΒΆί'Ό-Ά13 (обогащенной составом ΌΜΕΜ/Ρ12), которую дополняют, как показано в табл. 1.1.

Таблица 1.1. Композиция клеточной культуральной среды ΒΆί'Ό-Ά13

Компонент	Концентрация [г/кг]
ОМЕМ/НАМЗ Р12 ВахЗЭ	12,74
Ь-Глутамин	1,3
Зупрегопгс	1,00
Этаноламин	0,00153
ΖΠ3Ο4.7Η2Ο	0,001
ЫаНСОз	1,5

Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие человеческий ΑΌΑΜΤ813, были адаптированы к химически определенной среде, а именно среде ВС8, как показано в табл. 1.2.

Таблица 1.2. Композиция клеточной культуральной среды ВС8

Компонент	Концентрация [г/кг!
ΌΜΕΜ/ΗΑΜ3 Е12 Вах Зрес1а1	11,75
Ь-Глутамин	0,9
Зупрегопгс	1,00
Этаноламин	0,00153
Путресцин.2НС1	0,0036
КеЗО4.7ΗξΟ	0,0006
ЫаНСО-з	2,0

Рабочий банк клеток для разработки оттаивали и клеточный инокулят получали в среде ВС8. Клетки переносили в аппарат объемом 10 л для культивирования с мешалками типа Раштона и культивировали в культурах с повторной загрузкой в среде ΒΑί'Ό-Α13 с контролируемыми параметрами вдоль линии следующим образом: рН 7,10, температура 36°С и до насыщения 20% воздухом.

После 2 циклов загрузки культуры достигали конечного рабочего объема, равного 10 л, и культуру переводили на непрерывную подпитку средой на день 4 и эксплуатировали до дня 18 в хемостатном режиме.

Из этой культуры второй 10 л аппарат для культивирования с мешалкой типа Раштона и устройством фиксации клеток инокулировали для хемостат-подобной перфузии, используя такую же клеточную культуральную среду, и культивировали в течение 8 дней в культуре с повторной загрузкой. Добавляли микроносители СУТОРОРЕ 2™ (ΟΕ НеаИЬсаге) (0,25 г/л), и аппарат для культивирования далее эксплуатировали в непрерывном хемостат-подобном перфузионном режиме параллельно с другим аппаратом для культивирования в хемостатном режиме. Аппараты для культивирования перемешивали с помощью мешалок типа Раштона с перегородками при 140 об/мин, что соответствует входному отношению удельная мощность/объем, равному приблизительно 40 Вт/м³.

Оба аппарата для культивирования эксплуатировали параллельно в течение 24 дней. Данные рассчитывали с 3 еженедельными интервалами и дополнительным 3-дневным интервалом (табл. 1.3 (хемостатная) и табл. 1.4 (хемостат-подобная перфузия). Данные от четырех интервалов табл. 1.3 (дни 26-32;

- 11 022219 дни 33-39; дни 40-46 и дни 47-49) непосредственно сравнивали с четырьмя интервалами, показанными в табл. 1.4 (дни 9-15; дни 16-22; дни 23-29 и дни 30-32).

Образцы из аппаратов для культивирования отбирали и анализировали на предмет концентрации ΑΩΑΜΤ513 посредством ЕЬ1§Л и активности ΑΩΑΜΤ813 посредством анализа ΡΚΕΤ8-73. Подсчеты клеток определяли посредством технологии Ыис1еосоип1ег. Для перфузионных культур общие подсчеты клеток и подсчеты клеток в супернатанте измеряли раздельно для расчета относительной фиксации клеток. Скорости разбавления измеряли и применяли для расчета скоростей роста и объемных производительностей. Уравнения предоставлены ниже.

Скорость роста (μ) в хемостатной культуре рассчитывали, используя уравнение μ=Ό+1η(Χ₁/Χ_ί-1)/ (ΐ-ΐ-1), где Ό = скорость разбавления, Χ_ΐ = общая плотность клеток на время ΐ, и (ΐ-ΐ-1) = время между (ΐ и ΐ-1).

Скорость роста (μ) в хемостат-подобной перфузионной культуре рассчитывали, используя уравнение μ=1η(X_ΐ/X_ΐ-1)/(ΐ-ΐ-1)+^χ(1одтеаη Х₃к/1одтеап Χ)/(ΐ-ΐ-1), где Ό - скорость разбавления, Χ_ΐ - общая плотность клеток на время ΐ, и (ΐ-ΐ-1) - время между (ΐ и ΐ-1), 1одтеап Χ - логарифмическое среднее общей плотности клеток = (Χ_ΐ-Χ_ΐ-1)/(1η(Χ_ΐ)-1η(Χ_ΐ-1)), и 1одтеап Χ_Χ\ - логарифмическое среднее плотности клеток супернатанта.

Степень фиксации клеток рассчитывали как = 100χ(1-Χ_3Ν/Χ) [%].

Таблица 1.3. Данные ферментационной суспензии для хемостатной культуры

Интервал	ΖΖ.-Νυο.	О	μ	АОати Рге1з	А<1ат18 ЕЫ8А	удельная актив- ность	Р Рге1з	Р ЕЫ5А	ςρ РгеСз	Яр ЕЬ18А
Дни	1 Еб/мл	1/Д	1/Д	мЕд/мл	мкг/мл	Ед/мг	Ед/л/д	мг/л/д	мЕд/ЕОб/д	мкг/ЕОб/д
0-4	н.о.	Загрузка	0,420	н.о.	н.о.	н.о.	Н.О.	н.о.	н.о.	но.
5-11	2,76	0,353	0,369	4314,4	4,09	1055	1523	1,44	551	0,52
12-18	2,01	0,309	0,299	9148,8	8,45	1083	2830	2,61	1407	1,30
19-25	1,82	0,311	0,300	8609,6	8,67	993	2677	2,70	1473	1,48
26-32	1,76	0,309	0,304	8868,2	9,96	891	2742	3,08	1560	1,75
33-39	1,84	0,321	0,337	7845,4	10,10	777	2519	3,24	1369	1,76
40-46	1,97	0,330	0,340	8098,7	9,24	877	2674	3,05	1358	1,55
47-49	2,02	0,361	0,343	7353,7	9,30	791	2658	3,36	1314	1,66
среднее 2649	1,90	0,330	0Д31	8041,5	9,65	834	2648	3,18	1400	1,68

Таблица 1.4. Данные ферментационной суспензии для хемостат-подобной культуры

Интервал	Общая СС	СС Супернатант	Фиксация клеток	ϋ	μ	Адат($ Рге{я	А4атГ8 ЕЫ8А	удельная актив- ность	Р Рге18	Р БЫ5А	Яр Рге1$	ЯР Е1Л5А
Дни	1x10 Еб/мл	1x30 Еб/мл	%	1/д	1/д	мЕд/мл	мкг/мл	Ед/мг	Ед/л/д	мг/л/д	мЕд/ЕОб/д	мкг/ЕОб/д
-8
-15	2,04	0,82	60	0,37	0,271	5804,4	6,25	929	2176	2,34	1068,	1,1
-22	3,75	1,14	70	0,44	0,192	8863,5	10,18	871	3889	4,46	1037	1,1
-29	5,86	1,53	74	0,53	0,178	11873,6	11,03	1076	6292	5,84	1073	1,0
-32	8,05	1,30	84	0,62	0,175	9398,6	10,61	886	5794	6,54	719	0,8
-32	4,93	1,20	72	0,49	0,204	8985,0	9,52	941	4538	4,80	974	1,0

Удельная скорость роста клеток в периодической культуре составляла приблизительно 0,42 д^-1. После перевода на хемостатное культивирование наблюдали падение удельной скорости роста до приблизительно 0,3 0 д^-1, что является показательным для условий, ограничивающих рост в химически определенной среде. Плотности клеток уравновешивали в интервале 1,8-2х10⁶ клеток/мл. При таких условиях непрерывного культивирования достигали устойчивого состояния (начиная в интервале 12-18), а может быть достигнуто свыше 2500 Ед/л/д.

Как отмечено выше, после инокуляции аппарата для культивирования с помощью устройства фиксации клеток на день 18 клетки дополнительно культивировали в непрерывном хемостат-подобном перфузионном режиме. Вследствие фиксации клеток плотности клеток в хемостат-подобных перфузионных культурах увеличивались. Однако вследствие относительно низкой степени фиксации клеток (среднее 72%; интервал 60-84%) плотности клеток поддерживались при относительно низком уровне <1х10⁷ клеток/мл (среднее 4,93х 10⁶ клеток/мл) и максимальная скорость разбавления составляла 0,62 д^-1.

Низкая степень фиксации клеток также обеспечивала поддержание клетками непрерывной удельной скорости роста, равной 0,18-0,27 д^-1, не приводя к избыточной плотности клеток. Это считается преимуществом для рекомбинантных клеток, которые экспрессируют рекомбинантные белки ассоциированным с ростом образом. Несмотря на сниженную удельную производительность (например, 974

- 12 022219 мЕд/Е06/д против 1400 мЕд/Е06/д) объемная производительность увеличивалась на свыше чем 70% от 2648 до 4538 Ед/л/д вследствие приблизительно 2,8-кратной более высокой плотности клеток. Удельная активность рекомбинантного белка также улучшалась (941 Ед/мг против 834 Ед/мг) вероятно вследствие сниженного времени пребывания в аппарате для культивирования, посредством этого улучшая стабильность или любой другой благоприятный эффект на структуру и функцию экспрессируемого рекомбинантного ΑΌΑΜΤ§13.

Пример 2. Хемостатные культуры получали с рекомбинантной клеточной линией СНО, экспрессирующей человеческий ΑΌΑΜΤ813, в химически определенной среде ВЛСО-Л13 (обогащенной составом ΌΜΕΜ/Ρ12), которая дополнена, как показано в табл. 1.1.

Рекомбинантные СНО клетки, экспрессирующие человеческий ΑΌΑΜΤ813, были адаптированы к химически определенной среде, а именно среде ВС8, как показано в табл. 1.2. Рабочий банк клеток для разработки оттаивали и клеточный инокулят получали в среде ВСЗ. Клетки переносили в аппарат объемом 1,5 л для культивирования с лопастными мешалками и культивировали в культурах с повторной загрузкой в среде ΒΑΟΌ-ΑΡΙ с контролируемыми параметрами вдоль линии следующим образом: рН 7,10, температура 36°С и до насыщения 20% воздухом.

После 2 циклов загрузки культуры достигали конечного рабочего объема, равного 1,5 л, и культивирование переводили на непрерывную подпитку средой на день 5 и эксплуатировали до дня 7 в хемостатном режиме.

Из этой культуры второй аппарат для культивирования, содержащий устройство фиксации клеток с лопастными мешалками, инокулировали, используя такую же клеточную культуральную среду, и культивировали в течение 1 дня в периодической культуре. Добавляли микроносители СУТОРОКЕ 2™ (СЕ НсаИЪсатс) (0,25 г/л), и аппарат для культивирования далее эксплуатировали в непрерывном хемостатподобном перфузионном режиме параллельно с другим аппаратом для культивирования в хемостатном режиме.

Оба аппарата для культивирования эксплуатировали параллельно в течение 28 дней. Данные рассчитывали в 4 еженедельных интервалах (табл. 2.1 (хемостат) и 2.2 (хемостат-подобный перфузионный режим)).

Образцы из аппаратов для культивирования отбирали и анализировали на предмет концентрации Α^ΑΜΤδ13 посредством ευδΑ и активности Α^ΑΜΤδ13 посредством анализа РКЕТ8-73. Подсчеты клеток определяли посредством технологии №1с1сосоип1сг. Для хемостат-подобных перфузионных культур общие подсчеты клеток и подсчеты клеток в супернатанте измеряли раздельно для расчета относительной фиксации клеток. Скорости разбавления измеряли и применяли для расчета скоростей роста и объемных производительностей.

Скорость роста (μ) в хемостатной культуре рассчитывали, используя уравнение μ=Ό+1η(Χ₁/Χ_ΐ-1)/ (ΐ-ΐ-1), где Ό = скорость разбавления, X =общая плотность клеток на время ΐ, и (ΐ-ΐ-1) = время между ΐ и ΐ1.

Скорость роста (μ) в хемостат-подобной перфузионной культуре рассчитывали, используя уравнение μ=1η(X_ΐ/X_ΐ-1)/(ΐ-ΐ-1)+^x(1одтсаη Х^.Додтсап Χ)/(ΐ-ΐ-1); где Ό - скорость разбавления, Χ_ΐ - общая плотность клеток на время ΐ, и (ΐ-ΐ-1) - время между ΐ и ΐ-1), 1одтсап X - логарифмическое среднее общей плотности клеток = (Χ_ΐ-Χ_ΐ-1)/(1η(Χ_ΐ)-1η(Χ_ΐ-4)), и 1одтсап Χ_δΝ - логарифмическое среднее плотности клеток супернатанта.

Степень фиксации клеток рассчитывали как = 100χ(1-Χ_δΝ/Χ) [%].

Таблица 2.1. Данные ферментационной суспензии для хемостатной культуры

Интервал	Общая СС	О	μ	А0ат1з Рге1з	А4ат(8 ЕЫ5А	удельная актив- ность	РРге15	Р ЕЦ8А	<ц>Рге($	0р ЕЫ5А
Дни	1x10 Еб/мл	1/Д	1/д	мЕд/мл	мкг/мл	Бд/мг	Ед/л/д	мг/л/д	мЕд/ЕОб/д	мкг/ЕОб/д
0-5	Н.О.	Загрузка	0,507	Н.О.	Н.О.	Н.О.	Н.О.	Н.О.	Н.О.	Н.О.
9-15	1,87	0,345	0,340	2879,8	2,987	964	994,0	1,031	533,0	0,553
16-22	1,21	0,298	0,253	3483,7	3,755	926	1042,9	1,123	867,7	0,933
23-29	1,02	0,270	0,262	3726,6	3,928	946	951,8	1,008	957,9	1,021
30-36	0,83	0,279	0,268	2551,1	2,858	895	691,8	0,780	837,7	0,948
среднее 936	1,23	0,298	0,281	31603	3,382	933	920,1	0,986	799,1	0,864

- 13 022219

Таблица 2.2. Данные ферментационной суспензии для хемостат-подобной перфузионной культуры

Интервал	Общая СС	Супер- натант СС	Фиксация клеток	ϋ	μ	Адате Ргее	Адате ЕЫ5А	удельная актив- ность	Р Ргее	Р ЕЫ8А	Чр Ргее	ЧР ЕЫ5А
Дни	1x10 Еб/мл	1x10 Еб/мл	%	1/д	1/д	мЕд/мл	мкг/мл	Ед/мг	Ед/л/д	мг/л/д	мЕд/ЕОб/д	мкг/ЕОб/д
02-08	1,96	1,22	38	0,449	0,262	2767,4	3,180	870	1241,6	1,427	634,6	0,729
09-15	2,95	1,12	62	0,442	0,256	4726,5	4,788	987	2090,0	2,117	707,7	0,717
16-22	3,90	1,06	73	0,592	0,207	3855,3	4,071	947	2281,5	2,409	585,6	0,618
23-29	3,57	1,00	72	0,604	0,205	2671,2	3,027	882	1613,4	1,829	451,8	0,512
30-36	3,52	1,13	68	0,594	0,222	2559,4	2,761	927	1519,5	1,639	431,3	0,465
37-43	4,20	1,18	72	0,571	0,219	2828,7	2,905	974	1615,2	1,659	384,7	0,395
44-49	4,30	1,21	72	0,566	0,159	2705,0	3,110	870	1530,0	1,759	355,9	0,409
среднее 02-29	3,09	1,10	61	0,522	0,232	3505,1	3,767	922	1806,6	1,945	594,9	0,644
среднее 02-49	3,49	1,13	68	0,545	0,219	3159,1	3,406	922	1698,8	1,834	5073	0,549

Удельная скорость роста рекомбинантных СНО клеток, экспрессирующих ΑΌΑΜΤ§13, в периодической культуре составляла приблизительно 0,51 д^-1. После перевода на хемостатное культивирование наблюдали отклонение удельной скорости роста до менее чем 0,30 д^-1, что является показательным для условий, ограничивающих рост в химически определенной среде. Плотности клеток уравновешивали в интервале 0,8-1,2х10⁶ клеток/мл при удельной скорости роста, равной 0,25-0,27 д^-1. При таких условиях непрерывного культивирования достигали устойчивого состояния (начиная в интервале 16-36). Средняя производительность всех 4 интервалов от дня 09-36 составляла 920 Ед/л/д.

Как отмечено выше, после инокуляции аппарата для культивирования с помощью устройства фиксации клеток на день 7 клетки дополнительно культивировали в непрерывном хемостат-подобном перфузионном режиме. Данные от четырех интервалов (дни 9-15; дни 16-22; дни 23-29 и дни 30-36) и среднее значение для дней 9-36 табл. 2.1 непосредственно сравнивали с данными от четырех интервалов (дни 2-8; дни 9-15; дни 16-22 и дни 23-29) и средним значением для дней 2-29 табл. 2.2.

Хемостат-подобную перфузионную культуру затем эксплуатировали (без хемостатной в качестве стандарта для сравнения) в течение еще других 3 интервалов (дни 30-36; дни 37-43 и дни 44-49), чтобы продемонстрировать долговременную стабильность хемостат-подобной перфузионной культуры. Средние значения для 7 недель непрерывного культивирования предоставлены в табл. 2.2 (среднее для дней 2-49).

Вследствие фиксации клеток плотности клеток в перфузионных культурах увеличивались. Однако вследствие относительно низкой степени фиксации клеток (среднее для дней 02-29: 61%, среднее для дней 02-49: 68%, интервал 38-72%) плотности клеток поддерживали при относительно низком уровне <5х10⁶ клеток/мл (среднее для дней 02-49 = 3,49х10⁶ клеток/мл). Максимальная скорость разбавления, равная приблизительно 0,60 д^-1, была достигнута в 3-ем интервале и затем оставалась постоянной между 0,55-0,60 д^-1 до конца эксперимента (среднее для дней 02-49: 0,55 д^-1).

Низкая степень фиксации клеток также обеспечивала поддержание клетками непрерывной удельной скорости роста, равной 0,16-0,26 д^-1 (среднее от дней 02-49: 0,22 д^-1, не приводя к избыточным плотностям клеток). Несмотря на сниженную удельную производительность (например, 595 мЕд/Е06/д против 799 мЕд/Е06/д) объемная производительность увеличивалась на свыше чем 90% от 920 до 1807 Ед/л/д вследствие приблизительно 2,8-кратной более высокой плотности клеток. Производительность хемостат-подобной культуры остается относительно стабильной в интервале от 1500-1600 Ед/л/д для дополнительных 3 интервалов.

Как в примере 1, было продемонстрировано, что этот подход к стабилизации непрерывных суспензионных культур с пониженной степенью фиксации клеток может компенсировать недостатки жестких ограничений роста при определенных условиях культивирования (например, при использовании химически определенной среды). Соответственно, контролирование фиксации клеток обеспечивает поддержание культуры при относительно умеренных плотностях клеток и относительно низких и постоянных скоростей разбавления. Также вследствие относительно низкой степени фиксации клеток, культура сохраняет больше характеристик непрерывной суспензионной культуры, как показано, например, посредством удельных скоростей роста.

Все патенты, патентные публикации и другие публикации, относящиеся к данному документу, включены здесь посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или патентная публикация были бы конкретно и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.

Определенные модификации и улучшения будут возникать у квалифицированных специалистов в

- 14 022219 области при чтении приведенного выше описания. Следует понимать, что все такие модификации и улучшения были здесь исключены ради краткости и читаемости. Тем не менее, все такие модификации и улучшения рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения и находятся надлежащим образом в пределах объема правовых притязаний следующей формулы изобретения.

Claims (24)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения полипептида и/или вируса, включающий:

   (a) культивирование клеток млекопитающих, экспрессирующих полипептид и/или вирус, в системе непрерывного культивирования клеток, где указанные клетки культивируют в химически определенной среде и где указанная система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток, имеющее степень фиксации клеток, поддерживаемую на уровне меньше чем 90%, и имеет скорость разбавления (Ό), поддерживаемую на уровне меньше чем 0,6 д^-1, и удельную скорость роста (μ), поддерживаемую на уровне от 0,15 до 0,25 д^-1; и (b) последующее извлечение указанного полипептида и/или вируса из среды, удаляемой из указанной системы культивирования клеток.
2. 2. Способ по п.1, где указанная скорость разбавления поддерживается на уровне от 0,55 до 0,6 д^-1.
3. 3. Способ по любому из пп.1-2, где указанная степень фиксации клеток поддерживается на уровне меньше чем 85%.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная степень фиксации клеток поддерживается на уровне меньше чем 80%.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная степень фиксации клеток поддерживается на уровне меньше чем 75%.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где указанная система культивирования клеток имеет отношение скорости разбавления к удельной скорости роста (Ό/μ) от 1,2 до 4.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где указанные клетки культивируют в указанной системе культивирования клеток в течение более чем 20 дней.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, где указанные клетки культивируют в указанной системе культивирования клеток в течение более чем 40 дней.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, где указанные клетки культивируют в указанной системе культивирования клеток в течение более чем 50 дней.
10. 10. Способ по любому из пп.1-9, где указанное устройство фиксации клеток содержит макропористый микроноситель.
11. 11. Способ по любому из пп.1-10, где указанная химически определенная среда не содержит компоненты животного происхождения.
12. 12. Способ по любому из пп.1-11, где указанные клетки культивируют по меньшей мере в 250 л среды.
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, где указанные клетки представляют собой несубстратзависимые клетки.
14. 14. Способ по любому из пп.1-13, дополнительно включающий перед стадией культивирования предварительное культивирование клеток в суспензии.
15. 15. Способ по любому из пп.1-14, где указанные клетки генетически модифицируют для экспрессии указанных полипептида и/или вируса.
16. 16. Способ по п.15, где указанные клетки представляют собой клетки СНО.
17. 17. Способ по п.15, где указанный полипептид является белком ΑΌΑΜΤ813.
18. 18. Способ получения белка ΑΌΑΜΤ813 в непрерывной клеточной культуре, включающий:

    (a) культивирование клеток млекопитающих, генетически модифицированных для экспрессии белка ΑΌΑΜΤ813. в системе непрерывного культивирования клеток, где указанная система культивирования клеток содержит устройство фиксации клеток, имеющее степень фиксации клеток, поддерживаемую на уровне меньше чем 90%; и имеет скорость разбавления (Ό), поддерживаемую на уровне меньше чем 0,6 д^-1, и удельную скорость роста (μ), поддерживаемую на уровне от 0,15 до 0,25 д^-1; и (b) извлечение указанного белка из указанной системы культивирования клеток.
19. 19. Способ по п.18, где указанная степень фиксации клеток поддерживается на уровне меньше чем

    75%.
20. 20. Способ по п.18, где указанная скорость разбавления (Ό) поддерживается на уровне от 0,55 до 0,6 _д ^-1.
21. 21. Способ по любому из пп.1-16, где указанный способ используют для продукции полипептида.
22. 22. Способ по п.21, в котором указанный полипептид представляет собой полипептид, выбранный из группы, состоящей из гормона, антитела, рецептора белка, слитого белка, цитокина, хемокина, фактора роста, белка фактора крови, фактора VII, фактора VIII и ингибитора альфа-1-протеазы.
23. 23. Способ по любому из пп.1-16, где указанный способ используют для продукции вируса.
24. 24. Способ по п.23, в котором указанный вирус представляет собой вирус, выбранный из группы,

    - 15 022219 состоящей из вируса дикого типа, рекомбинантного вируса, вирусной частицы, вирусного вектора, аденовируса, вируса герпеса, ретровируса, лентивируса и вируса гриппа.