CN116574671B - 一种hek293细胞培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种HEK293细胞培养基及其应用，培养基包括基础培养基和添加复合物，所述的基础培养基为DMEM培养基或HE01培养基的任意一种；所述的添加复合物包括：终浓度为2~3mmol/L的钙离子、终浓度为5~7mmol/L的镁离子、终浓度为1.1~1.5mg/L的纤连蛋白、终浓度为1.5~2μg/L TGF‑β1。上述复合物可以替代血清加入基础培养基直接用于HEK293细胞的贴壁传代培养，该复合物化学成分明确，获取和使用方便，价格低廉，适用于工业生产和研究用途。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养基领域，具体为一种HEK293细胞培养基及其应用。
背景技术
HEK293细胞是原代人胚肾细胞转染5型腺病毒DNA而得到的永生化细胞，稳定过表达腺病毒E1A和E1B基因，其最初的用途是繁殖缺乏这些基因的腺病毒突变体。HEK293细胞具有易于培养和高转染效率的特点，对外源蛋白有着较好的翻译后折叠和加工，因此该细胞后续也常被用于蛋白表达和病毒包装。
常见的HEK293细胞培养方式包括含血清贴壁培养和无血清悬浮培养。在贴壁培养中，一般需要添加10%体积比例的血清，血清中含有细胞所需的部分营养物质和促细胞贴壁因子。目前大部分的慢病毒工艺属于贴壁生产工艺，如康宁（Corning）的CellCube智能化移动式细胞培养工作站工艺，类似于多层的细胞工厂，工作体积达到2.6~2.8L，颇尔（Pall）的ICELLIS生物反应器的固定床工艺，最大生产体积能够达到120L。贴壁工艺的优点在于发展时间较早，工艺成熟，比较方便转染后的换液操作，病毒收获操作简单。其主要的缺点在于培养过程需要添加血清。血清价格昂贵，成分未知，并且存在批次差异，影响了工业稳定性；血清含有的一些蛋白也给下游纯化带来压力；规模化生产较为困难。
去除血清对贴壁培养的最大负面效果在于细胞无法正常贴附介质，而HEK293细胞需要贴附介质才能正常生长，目前针对293的病毒包装工艺开发方向集中于无血清条件下的悬浮工艺，无血清条件下的贴壁工艺的研究比较少。因此，为促进无血清贴壁工艺发展，需要提高HKE293细胞对介质贴附能力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种HEK293细胞培养基及其应用，以弥补现有技术的不足。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种HEK293细胞培养基，包括基础培养基和添加复合物，
所述的基础培养基为DMEM培养基或HE01培养基的任意一种；
所述的添加复合物包括：终浓度为2~3mmol/L的钙离子、终浓度为5~7mmol/L的镁离子、终浓度为1.1~1.5mg/L的纤连蛋白、终浓度为1.5~2μg/L TGF-β1。
优选的，所述的添加复合物包括：终浓度为2mmol/L的钙离子、终浓度为5mmol/L的镁离子、终浓度为1.1mg/L的纤连蛋白、终浓度为1.5μg/L TGF-β1。
优选的，所述的钙离子由氯化钙提供。
优选的，所述的镁离子由氯化镁提供。
前述的一种HEK293细胞培养基的应用，用于HEK293细胞的培养。
优选的，用于HEK293细胞的贴壁培养。
本发明的有益效果：
1）使HEK293细胞在无血清环境下能够像在含血清的条件下一样贴附、伸展、扩增、传代；培养过程未引入血清，添加的物质也都属于明确物质，属于化学限定培养基；
2）其中的二价离子成分价格低廉，降低了培养成本；
3）本发明的培养基中包含由钙离子、镁离子、纤连蛋白、TGF-β1组成的复合物，上述复合物可以替代血清加入基础培养基直接用于HEK293细胞的贴壁传代培养，该复合物化学成分明确，获取和使用方便，价格低廉，适用于工业生产和研究用途。
本发明的作用机理：纤连蛋白和TGF-β1对细胞无毒害作用，纤连蛋白可以增强细胞之间粘连以及细胞与基质之间粘连，纤连蛋白能够促进悬浮状态下细胞贴附，同时提高贴附状态下细胞的运动能力和趋化性，使细胞接触和伸展良好，并维持良好的细胞形态。TGF-β1是一种多功能多肽，能够明显增强α5β1整合素的表达，进而刺激细胞对纤维连接蛋白(Fn)的粘附。钙镁是细胞生长所必须的，钙离子是细胞钙黏蛋白的组成成分，钙离子的结合稳定了钙黏蛋白的胞外延伸的棒状结构，这是钙粘蛋白分子排列在临近细胞上实现最佳粘附所必需的。三羧酸循环作为细胞能量的主要来源，其限速酶磷酸果糖激酶需要镁离子激活。此外，二价离子可以中和细胞表面负电荷，从而减少细胞之间的斥力。此外，钙镁离子可以降低消化传代过程中残留胰酶活性，从而保证细胞正常粘附。
纤连蛋白（FN）具有介导细胞的粘附和迁移的功能，这一功能在干细胞培养方面的应用比较多，在HEK293细胞培养方面的应用很少见，实际测试中，只添加纤连蛋白不足以让HEK293细胞在无血清的条件下贴壁。功能类似的蛋白还有胶原蛋白、玻连蛋白等，在实际测试中，单独或以组合物形式添加的情况下促贴壁情况均不如本发明组合物效果。
DMEM培养基中钙离子浓度为1.8mM，镁离子浓度为0.8mM，实际测试中，发现提高钙离子、镁离子浓度有助于HEK293细胞贴壁，本发明提供的方法是在DMEM基础上额外添加了钙离子2-3mM，镁离子5-7mM，可增强细胞粘附能力，从而实现贴壁效果。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明实施例1中第一组的细胞贴附示意图；
图2是本发明实施例1中第二组的细胞贴附示意图；
图3是本发明实施例1中第三组的细胞贴附示意图；
图4是本发明实施例1中第四组的细胞贴附示意图；
图5是本发明实施例1中第五组的细胞贴附示意图；
图6是本发明实施例1中第六组的细胞贴附示意图；
图7是本发明实施例2中添加复合物的不同浓度条件下的细胞传代曲线示意图；
图8是本发明实施例2中添加复合物的不同浓度条件下的细胞平均比生长速率示意图；
图9是本发明实施例3中第一组的细胞贴附示意图；
图10是本发明实施例3中第二组的细胞贴附示意图；
图11是本发明实施例3中第三组的细胞贴附示意图；
图12是本发明实施例3中第四组的细胞贴附示意图；
图13是本发明实施例3中第五组的细胞贴附示意图；
图14是本发明实施例3中第六组的细胞贴附示意图；
图15是本发明实施例4中添加复合物的不同浓度条件下的细胞传代曲线示意图；
图16是本发明实施例4中添加复合物的不同浓度条件下的细胞平均比生长速率示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、实验试剂：
本试验所用材料，包括氯化钙（西格玛，C4901）、氯化镁（西格玛，M8266）、纤连蛋白（罗氏，10838039001）、转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）（西格玛，5051）、培养方瓶（洁特生物，TCF012250）、胰酶（赛默飞，27250018）、细胞计数仪（上海睿钰，IC1000）、针头过滤器（洁特生物，SCA227025）、DMEM培养基（赛默飞，10566016）、HE01培养基（含谷氨酰胺）（依科赛生物，HE000-N012）、胎牛血清（Fatal bovine serum，FBS）（依科赛生物，FSP500）；
实施例中其他所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
二、实验方法：
本发明的的添加复合物使用方法如下：
添加复合物的各个组分配制方法：将氯化钙、氯化镁、纤连蛋白、TGF-β1分别以目标浓度1000倍溶于水，如TGF-β1控制在1.5g/L，随后使用针头过滤器进行无菌过滤，保存在4℃备用。
针对于在含血清培养条件下的HEK293贴壁细胞，于显微镜下观察细胞汇合度，汇合度达到90%左右，使用移液管吸取并丢弃原培养液，加入无菌1×DPBS（磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，溶于水，定容至1L，调节pH=7.4）10mL，洗涤残余血清，重复洗涤一次，加入1mL胰酶溶液（0.25%），常温条件下消化2~3分钟，观察细胞之间出现裂隙但未脱落情况下，吸取弃掉胰酶溶液，加入新鲜含添加复合物的基础培养基轻轻将细胞从培养介质上吹打下来，吹打混匀后取样计数，弃掉部分培养液，加入新鲜含添加复合物的基础培养基调整到合适密度0.1~0.4×106细胞数/mL，体积控制在5~10mL，随后将培养方瓶转移至培养箱（37℃、5%CO2）继续培养，传代间隔控制在2~3天。
针对于无血清悬浮条件下的HEK293悬浮细胞，取样进行细胞计数，300g、5分钟进行离心去除原无血清培养基，使用新鲜含添加复合物的基础培养基调整到合适密度0.1~0.4×106细胞数/mL，体积控制在5~10mL，随后全部转移至培养箱（37℃、5%CO2）继续培养，由无血清悬浮转换为贴壁之后的后续传代操作可以参考上述的贴壁传代方法，传代间隔控制在2-3天。
一般来说，由贴壁培养条件向悬浮培养条件时候，细胞由静置培养转为摇动培养状态，生存条件变差，会出现活率大幅度下降、扩增速度降低的情况，因此需要将贴壁HEK293细胞进行悬浮驯化，筛选出适应悬浮培养的细胞。本发明提供的方法是在去除血清的条件下，保持细胞贴壁性能，所使用的细胞是贴壁的HEK293细胞、或将悬浮的HEK293细胞转为贴壁培养（细胞生长条件更平稳，不影响细胞活性和扩增速度），故不涉及驯化操作。本发明的组合物可以替代血清的促细胞贴壁性能。
实施例1，以DMEM基础培养基，根据上述配制的不同的添加复合物添加进DMEM培养基，各个试验组设置如下：
第一组（氯化钙）：在DMEM培养基中添加氯化钙，浓度设置为2mmol/L；
第二组（氯化镁）：在DMEM培养基中添加氯化镁，浓度设置为5mmol/L；
第三组（纤连蛋白）：在DMEM培养基中添加纤连蛋白，浓度设置为1.1mg/L；
第四组（TGF-β1）：在DMEM培养基中添加TGF-β1，浓度设置为1.5μg/L；
第五组（FBS）：在DMEM培养基中添加FBS，添加比例控制在10%；
第六组（复合物组合）：在DMEM培养基中添加氯化钙终浓度为2mmol/L、氯化镁的终浓度为5mmol/L、纤连蛋白的终浓度为1.1mg/L、TGF-β1添的终浓度为1.5μg/L。
培养过程：将贴壁HEK293细胞消化后转入上述培养基，随后转入培养箱培养，培养48小时后于显微镜下观察拍照。
细胞贴附情况见图1~图6，结果显示，仅有第五组和第六组的细胞绝大部分已经贴附到了培养介质上，仅少量细胞漂浮。其他组的细胞未能贴壁，同时产生了较多细胞团。
实施例2，以DMEM培养基作为基础培养基，根据上述配制的不同的添加复合物添加进DMEM培养基，各个试验组设置如下：
第一组为本发明的低浓度的添加复合物组合：在DMEM培养基中添加氯化钙终浓度为1mmol/L，氯化镁的终浓度为3mmol/L，纤连蛋白的终浓度为0.7mg/L，TGF-β1添的终浓度为1μg/L；
第二组为本发明的中浓度的添加复合物组合：在DMEM培养基中添加氯化钙终浓度为2mmol/L，氯化镁的终浓度为5mmol/L，纤连蛋白的终浓度为1.1mg/L，TGF-β1添的终浓度为1.5μg/L；
第三组为本发明的高浓度的添加复合物组合：在DMEM培养基中添加氯化钙终浓度为3mmol/L，氯化镁的终浓度为7mmol/L，纤连蛋白的终浓度为1.5mg/L，TGF-β1添的终浓度为2μg/L；
第四组为不加添加复合物的对照，仅含有DMEM基础培养基；
第五组为加FBS的对照，在DMEM基础培养基中添加10%比例的FBS。
培养过程：培养过程与实施例1中相似，不同之处在于此实施例中要用上述培养基的组合进行3次培养传代，每次消化后需要进行细胞密度和细胞活率检测。
细胞扩增情况见图7和图8，由于第四组的培养基中不含添加复合物组合或血清，培养过程中细胞未能贴壁，不能进行传代，因此无传代数据，图7和图8中对照组数据为第五组的传代数据。低浓度、中浓度、高浓度的添加复合物和第五组对照组的三次传代的平均比生长速率分别为0.84天-1、0.94天-1、0.96天-1、1..01天-1。在低浓度的添加复合物条件下，细胞生长速度较慢，中浓度条件、高浓度条件和对照组的三组之中对照组生长速度最快，可能与血清中营养比较丰富有关。此外，由于中浓度组合和高浓度组之间生长速度无明显差异，在基于节省物料成本情况下，中浓度条件即为最佳浓度。
实施例3，以HE01基础培养基，HE01培养基具体操作使用按照说明书进行，根据上述配制的不同的添加复合物添加进HE01培养基，各个试验组设置如下：
第一组（氯化钙）：在HE01培养基中添加氯化钙，浓度设置为2mmol/L；
第二组（氯化镁）：在HE01培养基中添加氯化镁，浓度设置为5mmol/L；
第三组（纤连蛋白）：在HE01培养基中添加纤连蛋白，浓度设置为1.1mg/L；
第四组（TGF-β1）：在HE01培养基中添加TGF-β1，浓度设置为1.5μg/L；
第五组（FBS）：在HE01培养基中添加FBS，添加比例控制在10%；
第六组（复合物组合）：在HE01培养基中添加氯化钙终浓度为2mmol/L，氯化镁的终浓度为5mmol/L，纤连蛋白的终浓度为1.1mg/L，TGF-β1添的终浓度为1.5μg/L。
培养过程：将悬浮HEK293细胞消化后转入上述培养基，随后转入培养箱培养，培养24小时后于显微镜下观察拍照。
细胞贴附情况见图9~图14，结果显示，与实例1中结果类似，仅有第五组和第六组的细胞绝大部分已经贴附到了培养介质上，仅少量细胞漂浮。其他组的细胞未能贴壁，同时产生了较多细胞团。
实施例4，以HE01培养基作为基础培养基，HE01培养基具体操作使用按照说明书进行，根据上述配制的不同的添加复合物添加进HE01培养基，各个试验组设置如下：
第一组为本发明的低浓度的添加复合物组合：在HE01培养基中添加氯化钙终浓度为1mmol/L，氯化镁的终浓度为3mmol/L，纤连蛋白的终浓度为0.7mg/L，TGF-β1添的终浓度为1μg/L；
第二组为本发明的中浓度的添加复合物组合：在HE01培养基中添加氯化钙终浓度为2mmol/L，氯化镁的终浓度为5mmol/L，纤连蛋白的终浓度为1.1mg/L，TGF-β1添的终浓度为1.5μg/L；
第三组为本发明的高浓度的添加复合物组合：在HE01培养基中添加氯化钙终浓度为3mmol/L，氯化镁的终浓度为7mmol/L，纤连蛋白的终浓度为1.5mg/L，TGF-β1添的终浓度为2μg/L；
第四组为不加添加复合物的对照，仅含有HE01基础培养基；
第五组为加FBS的对照，在HE01基础培养基中添加10%比例的FBS。
培养过程：培养过程与实施例1中相似，不同之处在于此实施例中要用上述培养基的组合进行3次培养传代，每次消化后需要进行细胞密度和细胞活率检测。
细胞扩增情况见图15和图16，由于第四组的培养基中不含添加复合物组合或血清，培养过程中细胞未能贴壁，不能进行传代，因此无传代数据，图15和图16中对照组数据为第五组的传代数据。低浓度、中浓度、高浓度的添加复合物和对照组的三次传代的平均比生长速率分别为0.99天-1、1.16天-1、1.14天-1、1.13天-1。在低浓度的添加复合物条件下，细胞生长速度较慢。中浓度条件、高浓度条件和对照组的三组之间无明显差异，整体三次传代的平均比生长速率高于实施例2中，这与HE01培养基中本身含有较为丰富的营养组分有关。基于节省物料成本的考虑，中浓度条件即为最佳浓度。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程方法物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程方法物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种HEK293细胞培养基，其特征在于，由基础培养基和添加复合物组成，
所述的基础培养基为DMEM培养基或HE01培养基的任意一种；
所述的添加复合物由终浓度为2~3mmol/L的钙离子、终浓度为5~7mmol/L的镁离子、终浓度为1.1~1.5mg/L的纤连蛋白和终浓度为1.5~2μg/L的TGF-β1组成。
2.根据权利要求1所述的一种HEK293细胞培养基，其特征在于，所述的添加复合物由终浓度为2mmol/L的钙离子、终浓度为5mmol/L的镁离子、终浓度为1.1mg/L的纤连蛋白和终浓度为1.5μg/L TGF-β1组成。
3.根据权利要求1所述的一种HEK293细胞培养基，其特征在于，所述的钙离子由氯化钙提供。
4.根据权利要求1所述的一种HEK293细胞培养基，其特征在于，所述的镁离子由氯化镁提供。
5.根据权利要求1或2任一所述的一种HEK293细胞培养基的应用，其特征在于，用于HEK293细胞的培养。
6.根据权利要求5所述的一种HEK293细胞培养基的应用，其特征在于，用于HEK293细胞的贴壁培养。
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Non-Patent Citations (2)
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| 三维培养基质体系在细胞迁移研究中的应用;余涛等;《上海大学学报(自然科学版)》;第110-114页，参见全文 * |
| 哺乳动物细胞无血清培养基研究进展;杨学义等;《动物医学进展》;第32卷(第2期);第69-72页，参见全文 * |
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