CN110055222B - 包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，该用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。本发明提供的方案实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞体外培养技术领域，特别涉及一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法。
背景技术
随着人们生活水平的日益改善，肿瘤患者日益增加，且呈年轻化趋势。为研究其发病机制和治疗，目前已建立了不同肿瘤的肿瘤细胞株。但经过长期培养，肿瘤细胞株的生物学特异性发生变异，不利于其癌变、分子遗传、免疫学特性以及浸润转移演变机制等的研究。
对于原代培养的肿瘤细胞来说，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90％以上，适用于药物敏感性试验及机制探究相关试验。另外，通过原代培养技术建立相应的肿瘤细胞库，可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源。因此，建立合理、稳定、高效的肿瘤细胞原代培养模式已成必然。
由于原代肿瘤细胞的培养过程过于复杂、贴壁速度慢、细胞数量少、纯度低且培养困难等，现有的原代肿瘤细胞的培养方法，往往需要采用比较大的组织样本进行培养。而很多情况下获得的组织样本并不能满足现有的培养方法的需求，也就是说，对于具有组织样本小，混杂成纤维细胞以及微生物多样性等特点的肿瘤细胞组织如肠癌细胞组织、胃癌细胞组织等来说，现有的一些原代肿瘤细胞培养基很难用来培养原代肿瘤细胞。因此，开发针对较小的组织样本的促进细胞贴壁的包被液以及分离培养方法则显得十分重要。
发明内容
本发明实施例提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，实现了从较小的组织样本中分离培养原代肿瘤细胞。
一方面，一种用于促进细胞贴壁的包被液，包括：
混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。
优选地，
所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。
优选地，
所述包被液Ⅲ为40-100mM NaOH、200-300mM NaHCO3以及100-250mM HEPES组成的混合液。
另一方面，一种原代肿瘤细胞分离培养方法，包括：
将权利要求1至3任一所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的细胞培养容器；
通过清洗液清洗肿瘤组织；
顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；
顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；
当培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。
优选地，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：
在1-2ml DF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；
将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，第一次离心3～5min，移除上清；
向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，，置于37℃CO2培养箱中，振荡消化20～120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3～5min，移除上清；
向第二次离心后的细胞沉淀中加入3～5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。
优选地，所述顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞，包括：
通过200-300μm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；
用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；
将重悬后的细胞接种至包被的细胞培养容器中培养；
所述包被的细胞培养容器内的细胞贴壁后，将培养基换成含抗生素的无血清培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养，并每隔2～3天换一次所述含抗生素的无血清培养基。
优选地，所述基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞，包括：
去除所述含抗生素的无血清培养基；
用1～2ml EDTA-Trypsin消化处理；
显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，并第四次离心3～5min；
用DF10培养基对第四次离心后的肿瘤细胞重悬，将重悬后细胞放于细胞培养容器中，并置于37℃，5％CO2细胞培养箱中5～120min，使成纤维细胞先贴壁；
将未贴壁的原代肿瘤细胞收集起来，加入DF10培养基转入新的细胞培养容器继续培养，反复贴壁2-6次。
优选地，
所述清洗液为含有抗生素的生理盐水、含有抗生素的PBS以及含有抗生素的培养基中的任意一种或多种。
优选地，
所述细胞分散酶，包括：胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶以及弹性蛋白酶中的任意一种或多种。
优选地，
所述细胞消化液，包括：浓度为0.02％～0.05％的EGTA和浓度为0.2％～0.5％的Trypsin。
优选地，
所述抗生素，包括：硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南中的任意多种。
优选地，
所述无血清培养基，包括：DF培养基和添加物，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松中的任意多种。
优选地，
所述抗生素，包括：20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠中的多种。
优选地，
所述无血清培养基，包括：DF培养基、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF以及BSA。
优选地，
所述细胞分散酶，包括：胶原酶和透明质酸酶。
本发明实施例提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法，该用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为10×F12，包被液Ⅲ为NaOH溶液、NaHCO3溶液以及HEPES组成的混合液，该用于促进细胞贴壁的包被液固化在细胞培养容器底部，接种细胞后，促进细胞贴壁，该促进细胞贴壁能够比较高效的收集肿瘤细胞，可实现只需较小的组织样本，即能够收集满足肿瘤细胞培养、纯化所需的细胞量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一个实施例提供的原代肿瘤细胞分离培养方法的流程图；
图2是本发明一个实施例提供的清洗后的肠癌组织样本图；
图3是本发明一个实施例提供的肠癌细胞纯化前和纯化后对比培养图；
图4是本发明一个实施例提供的纯化后原代肠癌细胞初步免疫荧光鉴定图；
图5是本发明一个实施例提供的清洗后的胸腺瘤组织样本图；
图6是本发明一个实施例提供的胸腺瘤细胞纯化前和纯化后对比培养图；
图7是本发明一个实施例提供的纯化后原代胸腺瘤细胞初步免疫荧光鉴定图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
大多数动物细胞皆为贴壁依赖性细胞，对于贴壁依赖性细胞可分为成纤维细胞和上皮样细胞。根据成纤维细胞与上皮样细胞贴壁时间的差异，可实现分离成纤维细胞与上皮样细胞，由于肿瘤细胞是上皮样细胞的一种，则可按照贴壁时间的差异，分离成纤维细胞与肿瘤细胞，从而实现对肿瘤细胞的纯化。
实现细胞贴壁的关键条件之一为包被液，包被液不仅会影响成纤维细胞与肿瘤细胞贴壁速度，而且会影响成纤维细胞与肿瘤细胞贴壁的时间差异，不难理解地，成纤维细胞与肿瘤细胞的贴壁速度将直接影响到细胞贴壁、生长、分离、纯化等的效率，而时间差异将直接影响成纤维细胞与肿瘤细胞分离的难易程度。因此，开发出一种能够促进细胞贴壁同时能够比较好的将成纤维细胞与上皮样细胞的贴壁时间分开的包被液，则显得十分重要。
本发明实施例提供一种用于促进细胞贴壁的包被液，该用于促进细胞贴壁的包被液包括：
混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为含有10×F12培养基，包被液Ⅲ为NaOH、NaHCO3以及HEPES组成的混合液。
10×F12培养基为10倍浓缩1×F12的培养基。即针对市场在售的F12培养基粉末来说，将日常推荐的或者常规操作的配制1L量的F12培养基粉末配制成100ml的F12。
上述HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其是一种氢离子缓冲剂，加入细胞培养基或者包被液中能较长时间控制恒定的pH范围。
上述Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。
在本发明另一实施例中，为了能够更好促进细胞贴壁，上述包被液Ⅲ为40-100mMNaOH、200-300mM NaHCO3以及100-250mM HEPES组成的混合液。
由于用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，包被液Ⅱ为10×F12，包被液Ⅲ为NaOH溶液、NaHCO3溶液以及HEPES组成的混合液，该用于促进细胞贴壁的包被液固化到细胞培养容器底部，接种细胞后，能够促进细胞贴壁，该促进细胞贴壁能够比较高效的收集细胞，可实现只需较小的组织样本，即能够收集满足肿瘤细胞培养所需的细胞量。
上述用于促进细胞贴壁的包被液在进行细胞贴壁培养或细胞贴壁分离之前，需将该包被液均匀铺于细胞培养容器如培养皿、培养瓶或者培养板上，并在37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的培养皿、培养瓶或者培养板，并在包被的培养皿、培养瓶或者培养板中进行细胞贴壁培养或细胞分离纯化操作。
由于上述用于促进细胞贴壁的包被液为胶原蛋白型包被液，比较容易凝固成固态，因此，上述用于促进细胞贴壁的包被液在制备过程中需要在低温下完成，或者在温度2-8℃的环境下制备，另外，上述用于促进细胞贴壁的包被液需要2-8℃条件下存储。
值得说明的是，将上述实施例提供的用于促进细胞贴壁的包被液制成的包被，分别与多聚赖氨酸包被以及血清包被进行对比，对比结果显示细胞在本发明实施例提供的用于促进细胞贴壁的包被液制成的包被中贴壁效果最好。
另外，上述用于促进细胞贴壁的包被液，还可被用作三维细胞培养，即将待培养细胞与包被液混合，将混合有待培养细胞的包被液均匀铺于培养皿或培养瓶或培养板上，固化后加入合适的细胞培养基在37℃5％CO2细胞培养箱中培养，以使细胞进行三维立体生长，更接近人体生理状态环境。从而有助于研究细胞的三维生长形态以及细胞的其他三维特性。
肿瘤原代培养，是指从肿瘤患者体内手术切除肿瘤组织，获得肿瘤细胞，并在体外进行短期培养的过程。原代培养的肿瘤细胞由于组织刚刚离体，其生物学特性未发生很大变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90％以上，适用于药物敏感性试验及机制探究相关试验，其数据更具有说服力。肿瘤细胞原代培养技术是癌症在体外研究的重要手段，与体内研究相辅相成。通过原代培养技术建立相应的肿瘤细胞库，可为日益深入的肿瘤研究及治疗提供充足有效的细胞来源。
一般来说，纯化和培养原代肿瘤细胞都需要有足够量的待培养的原代肿瘤细胞供纯化和培养，目前，由于一次获得的具有原代肿瘤细胞的组织样本量较小，现有的细胞分离培养方法并不能够从组织样本中获取纯化和培养所需的细胞量。而本发明实施例提供的用于促进细胞贴壁的包被液，能够从不大于0.3g的具有丰富原代肿瘤细胞的组织样本中，获得满足原代肿瘤细胞纯化和培养所需的细胞量。因此，基于用于促进细胞贴壁的包被液，本发明实施例进一步提供一种原代肿瘤细胞分离培养方法，如图1所示，该原代肿瘤细胞分离培养方法可包括如下步骤：
步骤101：将包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1～2h，制得包被的细胞培养容器；
该步骤中的包被液即为上述实施例提供的用于促进细胞贴壁的包被液。
步骤102：通过清洗液清洗肿瘤组织；
步骤103：顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；
步骤104：顺次利用包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；
步骤105：当培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。
上述步骤102中使用的清洗液为包含有抗生素的生理盐水、包含有抗生素的PBS以及含有抗生素的培养基中的任意一种或多种，当然，考虑成本因素的话，该清洗液优选为包含有抗生素的生理盐水，另外，由于肠道内含有的菌群比较复杂，为了能够尽可能的排除肠道菌群干扰，该清洗液中的抗生素的种类一般不止一种。比如，抗生素可为硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南中的任意多种，较为优选地为抗生素包含有硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素以及头孢美唑钠。较为优选地，抗生素可包括20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠中的多种；比如对于肠癌组织细胞，抗生素可由抗生素可包括20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠组成；对于胸腺癌组织细胞、胃癌组织细胞等，抗生素可由20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B组成，通过上述清洗液清洗可去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
上述步骤103的具体实施方式可包括：在1-2ml DF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20mlDF培养基重悬后，第一次离心3～5min，移除上清；向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，置于37℃CO2培养箱中，振荡消化20～120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3～5min，移除上清；向第二次离心后的细胞沉淀中加入3～5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。
其中，在将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状的过程中加1-2ml DF培养基，避免因肿瘤组织干燥而影响肿瘤细胞活性。该将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状的过程是利用剪刀和刀片协作进行，与其他的组织破碎的方式如组织捣碎机、匀浆器、研钵等相比，本发明实施例选用的方式，在保证肿瘤细胞比较容易分离的同时，能够最大程度的保证肿瘤细胞的完整性和活性。该碎泥状是指大小不大于1mm3，且大小不大于1mm3组织的样品量不低于总样品量的90％。
其中，DF培养基为DMEM/F12(1:1)培养基。
另外，细胞分散酶选择的是消化性能比较柔和的胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶以及弹性蛋白酶中的任意一种或多种，比较优选地，细胞分散酶为胶原酶和透明质酸酶混合物，其中，胶原酶为胶原酶Ⅰ。更优选地，细胞分散酶为含1～10mg/mL的胶原酶Ⅰ和0.2～2mg/mL透明质酸酶混合物。
同时，细胞消化液包括浓度为0.02％～0.05％的EGTA和浓度为0.2％～0.5％的Trypsin，该细胞消化液的消化性能比较柔和。通过上述细胞分散酶与细胞消化液对肿瘤组织进行消化，可以最大程度消化组织，同时保证肿瘤细胞的完整性和活性。
另外，离心时间以及消化时间的控制都将影响肿瘤细胞的收集以及杂质的去除，本发明实施例给出的离心时间以及消化时间是通过设计以及实验对比得出的。
上述步骤104的具体实施方式可包括：通过200-300μm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；将重悬后的细胞接种至包被的细胞培养容器中培养；包被的细胞培养容器内的细胞贴壁后，将培养基换成含抗生素的无血清培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养，并每隔2～3天更换一次含抗生素的无血清培养基。
针对含抗生素的DF10培养基以及含抗生素的无血清培养基来说，其抗生素可为硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南中的任意多种，较为优选地为抗生素包含有硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素以及头孢美唑钠。较为优选地，抗生素可包括抗生素可包括20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠中的多种；比如对于肠癌细胞组织，抗生素可由抗生素可包括20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠组成；对于胸腺癌细胞组织、胃癌细胞组织等，抗生素可由20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B组成。
其中，无血清培养基包括：DF培养基和添加物，其中，添加物包括谷氨酰胺、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松中的任意多种。优选地，添加物为谷氨酰胺、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、氢化可的松以及BSA的组合物，其中，1～5mM谷氨酰胺、5～30mg/L胰岛素；5～20mg/L转铁蛋白，5～20μg/L亚硒酸钠，5～20μg/L EGF，10～100nM氢化可的松以及1～5mg/mL BSA。
针对上述无血清培养基中的添加物，通过在基础培养基中加入上述添加物的组合，然后进行细胞生长曲线绘制来评估细胞的生长状态和周期，经过筛选和优化得到最适合于原代肿瘤细胞生长的添加物组合及各自的最适浓度。
上述步骤105的具体实施方式可包括：去除含抗生素的无血清培养基；用1～2mlEDTA-Trypsin消化处理；显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，并第四次离心3～5min；用DF10培养基对第四次离心后的肿瘤细胞重悬，将重悬后细胞放于细胞培养容器中，并置于37℃，5％CO2细胞培养箱中5～120min，使成纤维细胞先贴壁；将未贴壁的原代肿瘤细胞收集起来，加入DF10培养基转入新的细胞培养容器继续培养，反复贴壁2-6次。
其中，在该步骤中，由于原代肿瘤细胞与成纤维细胞贴壁时间不一样，通过反复贴壁2-6次，即可实现对原代肿瘤细胞的纯化，另外，上述新的细胞培养容器可以为普通细胞培养容器，也可以选用本发明实施例提供的用于促进细胞贴壁的包被液制成的包被的细胞培养容器，其中，比较优选地为新的细胞培养容器内具有用于促进细胞贴壁的包被液制成的包被，并基于该包被纯化分离原代肿瘤细胞。
值得说明的是，待培养细胞的细胞汇和度达到70～90％时，继续采用上述的组合消化方式纯化，反复纯化2-5次即可得到无成纤维细胞等杂质细胞的原代肿瘤细胞。
上述实施例得到的原代肿瘤细胞还可进一步进行传代培养。
为了能够清楚地说明，基于用于促进细胞贴壁的包被液，实现的原代肿瘤细胞分离培养方法，下面分别以分离培养原代肠癌细胞、原代胸腺瘤细胞、原代肺癌细胞以及原代胃癌细胞为例展开说明。
值得说明的是，下述所选用的新鲜的肿瘤组织样品，均是在病人或病人监护人知情同意的情况下收集的。
实施例1：原代肠癌细胞分离培养1
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将获取的如图2所示的0.3g的新鲜肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含500μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、5μg/mL头孢美唑钠的生理盐水冲洗5-8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状。
(4)将(3)中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(该细胞分散酶含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和0.2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡(40-80rpm)消化60min；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含500μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、5μg/mL头孢美唑钠的DF10培养基重悬，加入至步骤(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含100μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基(该无血清培养基为在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，其中添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)(8)中原代肿瘤细胞每2-3天换一次含20μg/mL青霉素、20μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基。
(10)在(9)中的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉无血清培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶/(1)中的包被培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-120min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肠癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶/(1)中的包被培养瓶中继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达85％的原代肠癌细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。肠癌纯化前后的培养对比图如图3所示，从图中可以清楚地看出，经过纯化可以达到全部清除成纤维细胞的作用。另外，通过对纯化后原代肠癌细胞进行初步免疫荧光鉴定，鉴定结果如图4所示。其中，细胞角蛋白(Keratin，CK)，钙视网膜蛋白(Calretinin，CR)，细胞角蛋白是上皮细胞常见标志物，可作为上皮来源肿瘤细胞的标志物，原代肿瘤细胞中只表达CK，而CR为阴性表达。进一步说明，纯化后的为原代肠癌细胞，且成纤维细胞已被全部清除。
实施例2：原代肠癌细胞分离培养2
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将获取的新鲜肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含500μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.5μg/mL万古霉素、5μg/mL头孢美唑钠的生理盐水冲洗5-8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状。
(4)将(3)中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(该细胞分散酶含1-10mg/mL的胶原酶Ⅰ和0.2-2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡(40-80rpm)消化30min-2h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含400μg/mL青霉素、300μg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、10μg/mL头孢美唑钠的DF10培养基重悬，加入至步骤(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含300μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.5μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基(该无血清培养基为在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，其中添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)在(8)期间每2-3天换一次含300μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、0.5μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的的无血清培养基。
(10)在(9)中的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉无血清培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置10min-2h，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肠癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次后，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例3：原代肠癌细胞分离培养3
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将获取的新鲜肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含20μg/mL青霉素、20μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、5μg/mL头孢美唑钠的生理盐水冲洗8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状。
(4)将(3)中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心3分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(该细胞分散酶含1mg/mL的胶原酶Ⅰ和0.2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡(40-80rpm)消化2h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含500μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的DF10培养基重悬，加入至步骤(1)中的包被培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含500μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基(该无血清培养基为在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，其中添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)在(8)期间每2-3天换一次含500μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基。
(10)在(9)中的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉无血清培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-120min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肠癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶/(1)中的包被培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次后，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例4：原代肠癌细胞分离培养4
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将获取的新鲜肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含200μg/mL青霉素、300μg/mL硫酸卡那霉素、0.35μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、10μg/mL头孢美唑钠的生理盐水冲洗6次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状。
(4)将(3)中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(该细胞分散酶含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡(40-80rpm)消化30min；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含300μg/mL青霉素、400μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、15μg/mL头孢美唑钠的DF10培养基重悬，加入至步骤(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含500μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基(该无血清培养基为在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，其中添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)在(8)期间每2-3天换一次含200μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、10μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基。
(10)在(9)中的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉无血清培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置10min-2h，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肠癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶/(1)中的包被培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次后，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例5：原代肠癌细胞分离培养5
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将获取的新鲜肠癌组织转移至细胞培养皿内，用含300μg/mL青霉素、300μg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素B、3μg/mL万古霉素、15μg/mL头孢美唑钠的生理盐水冲洗8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的肠癌组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状。
(4)将(3)中切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心4分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(该细胞分散酶含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和15mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡(40-80rpm)消化1.5h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含0.2mg/mL青霉素、0.3mg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、16μg/mL头孢美唑钠的DF10培养基重悬，加入至步骤(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含400μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.3μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基(该无血清培养基为在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，其中添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)在(8)期间每2-3天换一次含400μg/mL青霉素、500μg/mL硫酸卡那霉素、0.3μg/mL两性霉素B、2μg/mL万古霉素、20μg/mL头孢美唑钠的无血清培养基。
(10)在(9)中的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉无血清培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置10min-2h，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肠癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶/(1)中的包被的培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次后，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例6：原代胸腺瘤细胞分离培养1
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到包被的培养瓶后备用。
(2)将如图5所示的胸腺瘤组织转移至细胞培养皿内，用含20μg/mL青霉素、20μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B生理盐水冲洗8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的胸腺瘤组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状；
(4)将(3)中切碎的胸腺瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡消化20min；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含50μg/mL青霉素、300μg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素B的DF10培养基重悬，加入至(1)中的包被培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含抗生素的无血清培养基(在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)期间每2-3天换一次含抗生素的无血清培养基。
(10)在(9)的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-30min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的肿瘤细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达80％的原代胸腺瘤细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。胸腺瘤纯化前后的培养对比图如图6所示，从图中可以清楚地看出，经过纯化可以可达到全部清除成纤维细胞的作用。另外，通过对纯化后原代胸腺瘤细胞进行初步免疫荧光鉴定，鉴定结果如图7所示。其中，细胞角蛋白(Keratin，CK)，钙视网膜蛋白(Calretinin，CR)，细胞角蛋白是上皮细胞即肿瘤癌细胞的常见标志物，可作为上皮来源肿瘤细胞的标志物，原代肿瘤细胞中只表达CK，而CR为阴性表达。进一步说明，纯化后的为原代胸腺瘤细胞，且成纤维细胞已被全部清除。
实施例7：原代胸腺瘤细胞分离培养2
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到培养平包被后备用。
(2)将胸腺瘤组织转移至细胞培养皿内，用含500μg/mL青霉素、30μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B生理盐水冲洗5次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的胸腺瘤组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状；
(4)将(3)中切碎的胸腺瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心3分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(含5mg/mL的胶原酶Ⅰ和15mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡消化1h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含100μg/mL青霉素、50μg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素B的DF10培养基重悬，加入至(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含抗生素的无血清培养基(在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)期间每2-3天换一次含100μg/mL青霉素、300μg/mL硫酸卡那霉素、0.4μg/mL两性霉素的无血清培养基。
(10)在(9)的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-30min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的肿瘤细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次后，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例8：原代胸腺瘤细胞分离培养3
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到培养平包被后备用。
(2)将胸腺瘤组织转移至细胞培养皿内，用含200μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B生理盐水冲洗7次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的胸腺瘤组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状；
(4)将(3)中切碎的胸腺瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和0.2mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡消化1.5h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3-5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含200μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B的DF10培养基重悬，加入至(1)中的包被培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含200μg/mL青霉素、100μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B的无血清培养基(在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)期间每2-3天换一次含100μg/mL青霉素、200μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B的无血清培养基。
(10)在(9)的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-30min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的肿瘤细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达85％的原代肠癌细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例9：原代胸腺瘤细胞分离培养4
(1)将用于促进细胞贴壁的包被液均匀铺于25cm2细胞培养瓶中，水平置于37℃细胞培养箱中1-2h，待培养瓶中液体完全凝固，得到培养平包被后备用。
(2)将胸腺瘤组织转移至细胞培养皿内，用含100μg/mL青霉素、200μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B生理盐水冲洗8次，去除脂肪、粘膜等非癌组织杂质。
(3)将(2)中处理后的胸腺瘤组织转移至一个新的培养皿中，用剪刀和刀片将组织块剁成碎泥状；
(4)将(3)中切碎的胸腺瘤组织转移至50mL离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，300g离心5分钟；移除上清，加入9ml DMEM/F12(DF)培养基进行重悬，再加入1ml细胞分散酶(含10mg/mL的胶原酶Ⅰ和20mg/mL透明质酸酶)，37℃CO2培养箱中低速振荡消化1.5h；酶反应结束后，加20mL的含10％FBS的DF(DF10)培养基终止反应，吹散混匀，300g离心5min，移除上清。
(5)将(4)的细胞沉淀中加入5mL细胞消化液(EGTA-Trypsin)溶液，吹散混匀。静置3～5min。加入10～15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀。
(6)将(5)的细胞通过300μm尼龙膜过滤，将过滤后细胞液收集到50mL离心管中，300g离心3～5min，移除上清。
(7)将(6)中的细胞用10ml含300μg/mL青霉素、50μg/mL硫酸卡那霉素、0.25μg/mL两性霉素B的DF10培养基重悬，加入至(1)中的包被的培养瓶中，至37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
(8)待(7)中的细胞贴壁后，换成含100μg/mL青霉素、200μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B的无血清培养基(在DF培养基中加入一定浓度的添加物和抗生素，包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松等)，将细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
(9)期间每2-3天换一次含100μg/mL青霉素、200μg/mL硫酸卡那霉素、0.5μg/mL两性霉素B的无血清培养基。
(10)在(9)的细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置5-30min，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的肿瘤细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达80％的原代胸腺瘤细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例10：原代肺癌细胞分离培养
将胸腺瘤组织替换为肺癌组织样本，(1)至(9)的操作过程与实施例7一致，在此不再赘述；
(10)在细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置10min-2h，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代肺癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达75％的原代肺癌细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
实施例11：原代胃癌细胞分离培养
将肠癌组织替换为肺癌组织样本，(1)至(9)的操作过程与实施例5一致，在此不再赘述；
(10)在细胞汇合度达到70-90％左右后，弃掉培养基，用1-2mlEDTA-Trypsin消化处理，显微镜下观察，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，250g离心5min，用DF10培养基重悬，将重悬后细胞放于细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中放置10min-2h，使成纤维细胞先贴壁，再将未贴壁的原代胃癌细胞收集起来，加入适量DF10培养基转入新的细胞培养瓶继续培养，经过反复贴壁2-5次，可得纯度达70％的原代胃癌细胞，待培养细胞的汇合度再次达到70-90％时，再采用上述组合消化的方式，反复纯化2-5次，即可达到全部清除成纤维细胞的作用。
上述各个实施例，至少能够达到如下有益效果：
1.在本发明实施例中，用于促进细胞贴壁的包被液，包括：混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被培养瓶液Ⅱ以及包被培养瓶液Ⅲ，其中，包被培养瓶液Ⅱ为10×F12，包被培养瓶液Ⅲ为NaOH溶液、NaHCO3溶液以及HEPES组成的混合液，该用于促进细胞贴壁的包被液固化到细胞培养容器底部，接种细胞后，能够促进细胞贴壁，该促进细胞贴壁能够比较高效的收集肿瘤细胞，可实现只需较小的组织样本，即能够收集满足肿瘤细胞培养所需的细胞量。
2.在本发明实施例中，由于通过清洗液清洗肿瘤组织；顺次利用细胞分散酶胶原酶和透明质酸酶，细胞消化液浓度为0.02％～0.05％的EGTA和浓度为0.2％～0.5％的Trypsin对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，其中，细胞分散酶和细胞消化液的消化性能比较温和，大大降低了对肿瘤细胞的破坏，加上促进细胞贴壁的包被液形成的包被促进肿瘤细胞贴壁，能够从量比较小不大于0.3g的肿瘤组织中得到足量的肿瘤细胞。
3.在本发明实施例中，选用的抗生素为抗生素可包括20-500μg/mL青霉素、20-500μg/mL硫酸卡那霉素、0.25～0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5～20μg/mL头孢美唑钠中的多种，大大降低了微生物对肿瘤细胞的污染率。
4.在本发明实施例中，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方法有效的去除成纤维细胞等杂质细胞，获得高纯度原代肿瘤细胞。
5.本发明实施例提供的原代肿瘤细胞分离培养方法，由于促进细胞贴壁的包被液能够缩短原代肿瘤细胞的贴壁时间，而胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方法有效的去除成纤维细胞等杂质细胞，同时无血清培养基的特有组分，均有益于缩短细胞培养周期，提高分离纯化的成功率。另外，抗生素的组成成分，可大大降低肿瘤细胞的污染率。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
还需要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
工业实用性
本发明的用于促进细胞贴壁的包被液和原代肿瘤细胞分离培养方法以及通过该方法获得的原代肿瘤细胞可以广泛应用于基础细胞生物学研究、肿瘤研究、新药研发、基因治疗、体外转基因和基因敲除研究、临床个性化治疗、分子及遗传流行病学研究等各个领域。
Claims (8)
1.一种用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，包括：
混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为40-100mM NaOH、200-300mM NaHCO3以及100-250mM HEPES组成的混合液，所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。
2.一种原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1~2h，制得包被的细胞培养容器；
通过清洗液清洗肿瘤组织；
顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；
顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；
当培养细胞的细胞汇和度达到70~90%时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：
在1-2ml DF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；
将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，第一次离心3~5min，移除上清；
向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，置于37℃ CO2培养箱中，振荡消化20~120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3~5min，移除上清；
向第二次离心后的细胞沉淀中加入3~5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。
4.根据权利要求2或3所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞，包括：
通过200-300µm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；
用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；
将重悬后的细胞接种至包被的细胞培养容器中培养；
所述包被的细胞培养容器内的细胞贴壁后，将培养基换成含抗生素的无血清培养基，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养，并每隔2~3天更换一次所述含抗生素的无血清培养基。
5.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞，包括：
去除所述含抗生素的无血清培养基；
用1~2ml EDTA-Trypsin消化处理；
显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，第四次离心3~5min；
用DF10培养基对第四次离心后的肿瘤细胞重悬，将重悬后细胞放于所述包被的细胞培养容器中，并置于37℃，5%CO2细胞培养箱中5~120min，使成纤维细胞先贴壁；
将未贴壁的原代肿瘤细胞收集起来，加入DF10培养基转入新的所述包被的细胞培养容器继续培养，反复贴壁2-6次。
6.根据权利要求2所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，
所述清洗液为含有抗生素的生理盐水、含有抗生素的PBS以及含有抗生素的培养基中的任意一种或多种；
和/或，
所述细胞分散酶，包括：胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶以及弹性蛋白酶中的任意一种或多种；
和/或，
所述细胞消化液，包括：浓度为0.02%~0.05%的EGTA和浓度为0.2%~0.5%的Trypsin。
7.根据权利要求2或5所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，
所述抗生素，包括：硫酸卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、两性霉素B、万古霉素、头孢美唑钠、亚胺培南中的任意多种；
和/或，
所述无血清培养基，包括：DF培养基和添加物，其中，所述添加物包括谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、TGF-α、BSA、氢化可的松中的任意多种。
8.根据权利要求2或5所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，
所述抗生素，包括：20-500μg/mL青霉素、20-500 μg/mL硫酸卡那霉素、0.25~0.5μg/mL两性霉素B、0.5-3μg/mL万古霉素以及5~20μg/mL头孢美唑钠中的多种；
和/或，
所述无血清培养基，包括：DF培养基、谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF以及BSA；
和/或，
所述细胞分散酶，包括：胶原酶和透明质酸酶。
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