CN111235090A - 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用 - Google Patents

松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111235090A
CN111235090A CN202010069120.2A CN202010069120A CN111235090A CN 111235090 A CN111235090 A CN 111235090A CN 202010069120 A CN202010069120 A CN 202010069120A CN 111235090 A CN111235090 A CN 111235090A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
cells
mol
protective agent
single cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010069120.2A
Other languages
English (en)
Inventor
赵伟
邱坤
廖东升
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd filed Critical Chengdu Daosheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010069120.2A priority Critical patent/CN111235090A/zh
Publication of CN111235090A publication Critical patent/CN111235090A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开了一种松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，含量为0.8x106～1.25x106U/L的胶原酶，以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。同时开提供了一种制备高存活率单细胞悬液的方法，具体配合超声消融仪的消融作用能够使得组织块在极短的时间内分散为单细胞并且尽可能的保留细胞活性，不对细胞本身造成破坏。本申请极大的解决了在用于原代细胞培养和单细胞测序的应用中需要获取高活性原代细胞的技术难题。同时本发明耗时大大缩短，将整个分散过程由现有的酶消化法需要的数小时缩短到数秒内，且稳定性高，单细胞化好，细胞活性高。

Description

松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用
技术领域
本发明涉及原代细胞获取的试剂领域，尤其涉及通过动物组织获取原代活细胞的试剂领域，具体涉及松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用。
背景技术
原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
现有的原代细胞的获取方式都是通过制备细胞悬液来获取，然而细胞悬液的制备在现有的常用方式中可分为两种：一种是最为传统的物理制备方式，就是用研磨器进行手工研磨，手工研磨的弊端在于实用范围小，同时制备的单细胞悬液质量因操作者的经验而差别巨大，耗费时间非常长。另一种方式就是通过酶消化法，譬如胰蛋白酶是可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。但是实际处理过程中，单纯的将组织块置入胰蛋白酶中并不能直接获取到单细胞悬液，且对于胰蛋白酶的浓度、消化处理时间对于组织的裂解影响是非常大的，直接影响着单细胞的数量、完整度、以及存活率。现有的胰蛋白酶对于裂解组织至少需要静放2-4小时，然而，经过这么长的时间，细胞大多或死亡，或失去活性，而没有高存活率的单原代细胞是很难实现原代细胞的成功培养的，因此，含有胰蛋白酶或者同等功效的溶液对于获取高存活率、高单细胞率，确保细胞尽可能不遭受破坏非常重要。
发明内容
为了解决现有技术获取完整的，高存活率的单细胞悬液流程复杂，繁琐，不利于原代细胞培养进行的技术现状和技术问题，本申请提供一种松解保护剂，能够有效的裂解组织块，并在超声波的作用下，迅速的将组织块消融，获得单细胞悬液，且单细胞中存活细胞的比例高达90％以上，能够有效的在原代细胞获得流程上得以极大的简化，提高原代细胞的获得效率并保证原代细胞极高的存活率，解决了以存活原代细胞为实验基础和前提的诸多实验最头疼的一个技术环节。
现有技术中，无论是采用传统的物理研磨的方式，还是通过酶解的方式在整个制备过程中花费的时间都是很长的，一般都会超过2小时，而细胞在这么长的时间内大多都已经失去活性了，甚至已经死亡，后续取得的单细胞悬液无论单细胞率的高低都已经没有了价值。譬如，单细胞测序、原代细胞培养的前提是必须保证制备的单细胞悬液中单细胞率和存活率都要非常高，二者缺一不可。为了解决现有技术中针对获取高存活率的单细胞，本申请提供了一种用于快速获取高存活率、高单细胞率，同时能够将使得制备好的单细胞悬液中的存活单细胞能够长时间的存活，这对于现有单细胞测序和原代细胞培养而言可谓是解决了最困难的一环。
为了达到上述目的，本申请所采用的宋姐保护剂具体为：
一种松解保护剂，由以下组分混合而成：
浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，
含量为0.8x106～1.25x106U/L的胶原酶，
以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。
分散酶II，Dispase II，中文名分散酶II，一种非特异性金属蛋白酶，细胞生物学中常用于从不同的组织或器官分离单细胞，并用于后续细胞培养，如原代细胞的分离，细胞传代等。另外，Dispase II还可用于消除悬浮细胞培养过程中发生的细胞聚集。与其他细胞生物学常用蛋白酶(如胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶等)相比，该酶具有以下优势：1)一种快速有效且温和的细胞消化酶，对细胞损伤小，且能维持细胞膜完整性；2)来源于细菌，无支原体或其他动物病毒污染；3)稳定性强，不受温度、pH及血清组分的影响；4)可用于多种类型组织和细胞的分离等。胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。
为了更好的提高细胞的解离效果，同时处理经分散酶II和胶原酶水解后产生的明胶，本发明还包括0.065～0.174g/L的胰肽酶。
明胶：是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原具有同源性。胶原具有棒状三股螺旋结构，当其部分水解制备明胶的过程中，胶原的这种三螺旋结构发生部分分离和断裂。
为了确保细胞生长内环境中的磷酸基团浓度，提供细胞存活的内环境，同时维持盐离子平衡，确保细胞存活的盐离子环境，本发明宋姐保护剂中还包括浓度为0.05～0.08g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3～0.6x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.22mol/L的氯化钠。
为了提高分散酶II和胶原酶对组织中细胞的分散作用，还包括浓度为2.5x10-3～3.2x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5x10-3～6.5x10-3mol/L的氯化钾。目的是增加正价钙离子、镁离子和钾离子能够进一步的促进提高分散酶II和胶原酶的活性和作用。
进一步地，在提高细胞存活的内环境平衡度，还包括浓度为3.8x10-3～5.0x10- 3mol/L的碳酸氢钠。
进一步地，为了避免内环境遭受破坏，经分散的单细胞被污染，松解保护剂中还包括100U/L～120U/L的青霉素,98～110mg/L的四环素,16～25mg/L的庆大霉素。上述抗菌剂中可以选择增加其中的一种或者多种，取决于实际的实验环境和组织的情况，确保整个组织在获取单个原代细胞中始终处于无菌环境，避免细胞或者细胞悬液遭受污染。
为了更好的提高单细胞率和单细胞存活率，所述分散酶II的浓度分别为19-22g/L，所述卡那霉素的浓度分别为20-21g/L，胶原酶的含量为0.96x106～1.03x106U/L，葡萄糖浓度为0.98～1.03g/L，碳酸氢钠的浓度为4.0x10-3mol/L。
进一步地，所述一水合磷酸氢二钠的浓度为0.06g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.45x10-3mol/L和氯化钠的浓度为0.14～0.16mol/L；氯化镁和氯化钙的浓度均为3.0x10-3～3.1x10-3mol/L，氯化钾的浓度为5.4x10-3～5.6x10-3mol/L。采用上述浓度能够尽可能的使得经分散后的单细胞得以完整的保留并存活。
本申请的松解保护剂在获取高存活率单细胞悬液的应用中能够获取到相对于现有技术制备单细胞悬液显著的技术效果，主要体现在单细胞率指标和细胞存活率指标上，尤其是在细胞存活率上效果显著。
本申请还提供了一种高存活率单细胞悬液的制备方法，采用松解保护剂对目标组织块进行浸泡，再采用超声消融仪对组织块进行消融，具体包括以下步骤：
步骤S100，在无菌环境下取目标组织块，并用剪刀将组织块剪碎至不大于2mm3的小块；
步骤S200，将目标组织块置于容器中用PBS缓冲液清洗，直到PBS缓冲液目测澄清为止，其中组织块的最大外部尺寸不超过2毫米；
步骤S300，将目标组织块置于1.5毫升的EP管中，同时，在EP管中加入权利要求8中所述松解保护剂，静置5-15分钟；
步骤S400，将超声消融仪的频率调整到15-60kHz，功率调整到1-10w，将超声消融仪的振子置于EP管中，振子距离EP管底部距离保持1-2毫米，消融时间设定不超过9秒；
步骤S500，取出振子，采用300目尼龙网过滤，1000-1500r/min离心，去除上清液，取10ul单细胞沉淀置于1ml生理盐水中获得单细胞悬液。
有益效果：
本发明中提供的松解保护剂能够满足快速超声消融的要求，能够将现有的酶消化法所需要的时间从数小时缩短到数分钟内完成，大大缩短了实验的时间，提高了实验的成功性和稳定性，为细胞活性的保留提供了极大的时间保障。且将酶消化时间缩短到现有的5％，但是获得的单细胞数量及存活细胞数量远远超过现有的酶消化法，为生物工程中的单细胞测序和原代细胞培养提供了广阔的空间，使得具有高细胞活性的单细胞悬液制作的难关得以破解，为后续诸多生物实验提供便捷而高效的环境。
同时，由于采用本发明的松解剂能够长时间为细胞提供稳定的内环境和营养物质，使得细胞能够长时间的保持存活，为后续实验赢得大量的时间。不必再考虑因单细胞制作导致时间占用过多而使得细胞自然失去活力的问题。同时，采用本发明的松解保护剂配合本发明单细胞悬液制备方法能够极大的提高实验成功的稳定性，减少酶的浪费，极大的节省了因酶消耗带来的巨大经济压力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例15中1组细胞照片；
图2是实施例15中2组细胞照片；
图3是实施例15中3组细胞照片；
图4是实施例15中4组细胞照片；
图5是实施例15中5组细胞照片；
图6是实施例15中6组细胞照片；
图7是实施例15中7组细胞照片；
图8是实施例15中8组细胞照片；
图9是实施例15中9组细胞照片；
图10是实施例15中10组细胞照片；
图11是实施例16中A组流式细胞分析染色强度与细胞数量图；
图12是实施例16中B组流式细胞分析染色强度与细胞数量图；
图13是实施例16中C组流式细胞分析染色强度与细胞数量图；
图14是实施例16中D组流式细胞分析染色强度与细胞数量图；
图15是实施例17中采用实施例4的松解保护剂制备单细胞悬液进行流式细胞分析间隔60分钟进行三次采样的染色强度与细胞数量图；
图16是实施例17中采用实施例11的松解保护剂制备单细胞悬液进行流式细胞分析间隔60分钟进行三次采样的染色强度与细胞数量图；。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的相关参数是按照实施例中的组分、浓度和操作方式获得。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
单细胞悬液是通过物理作用和/或酶的作用将组织块裂解成单个的细胞的混合液，通过经过过滤能够得到相对纯净的单细胞悬液。理想的单细胞悬液是诸多生物实验的基础，也是生物实验的第一个难关，如果需要进行后续实验的单细胞悬液须保证单细胞的存活和活力。譬如：用于单细胞测序、原代细胞培养，以及流式分析实验等都需要保证单细胞具有较高的活力才得以进行。细胞的活力在离开活体组织后受时间和环境的影响非常大。
细胞或者离体组织所处环境，如果外界环境不是无菌条件，且没有相对于细胞存活的内环境或者营养都会导致细胞迅速失去活力，甚至导致细胞死亡。因此，制备单细胞悬液的时间周期要尽可能的短，时间越短，细胞的活力就会越好，存活率也会越高。
现有的物理制备法基本很难满足用于单细胞测序或者原代细胞培养的要求，其主要原因就是由于物理的对组织反复作用并不能直接导致组织的单细胞化，获得的更多的是细胞团块，要想获得理想的单细胞，或者较高比例的单细胞那么就需要延长物理作用的时间，不断的进行研磨，然而这一过程对于细胞也会产生致命的破坏，当随着物理研磨的时间加上，细胞团块逐渐单细胞化的同时，细胞壁也会遭受破坏，呈现的结果是单细胞化提高了，但是细胞的完整度却降低了，导致具备高活性的单细胞较少，难以满足现有生物实验需求。
酶解法是相对于传统物理研磨法破坏程度更小，更科学的一种方法，但是亦存在明显的弊端，主要是酶与需要处理的目标组织之间需要解除很长的时间，一般根据组织的细胞类型不同需要2-4小时才能使得细胞间的基质被消化，从而获得单个的原代细胞。然而，在用于酶消化基质的这个数小时的周期内，细胞的活力存在明显的降低，且单纯的采用酶对组织块进行分离并不能获得到理想的单细胞悬液，依然要配合到其他物理的方式进行松解打散。本申请提供一种可以同时获取高单细胞率、高存活率的松解保护剂，能够在短时间内对组织进行松解，并提供细胞存活并保持活力的营养成分。值得说明的是，由于采用本申请的松解保护剂和单细胞悬液的制备方法所需时间极短，因此，相对于现有的酶试剂，在不需要供细胞存活保持活力的营养物质亦可获得理想的，具有高存活率，单细胞率的悬液。
实施例1：
一种高存活率单细胞悬液的制备方法，采用松解保护剂对目标组织块进行浸泡，再采用超声消融仪对组织块进行消融，具体包括以下步骤：
步骤S100，在无菌环境下取目标组织块，并用剪刀将组织块剪碎至不大于2mm3的小块；
步骤S200，将目标组织块置于容器中用PBS缓冲液清洗，直到PBS缓冲液目测澄清为止，其中组织块的最大外部尺寸不超过2毫米；
步骤S300，将目标组织块置于1.5毫升的EP管中，同时，在EP管中加入权利要求8中所述松解保护剂，并置于恒温37℃静置5分钟；
步骤S400，将超声消融仪的频率调整到40kHz，功率调整到6w，将超声消融仪的振子置于EP管中，振子距离EP管底部距离保持1-2毫米，消融时间设定不超过9秒；
步骤S500，取出振子，采用400目尼龙网过滤，1500r/min离心5分钟，获取细胞沉淀，取出上清液，取10ul单细胞置于1ml生理盐水中获得单细胞悬液；
步骤S600，将步骤S500中获取的单细胞悬液采用台盼蓝常规染色；
步骤S700，将染色后的单细胞悬液分别进行流式细胞分析或用血球计数板计数。本实施例中的目标组织块采用成年小白鼠的肾脏。上述制备方法中的超声消融仪采用现有技术，具体采用本申请人于2019年2月1日申请，2019年4月19日公布，公布号为CN109652312 A的基于超声原理的手持式动植物组织消融仪技术实现，在此不做赘述。
实施例2：
本实施例是采用常规的酶消化法获取单细胞悬液，具体步骤如下：
步骤一：将选定的酶和组织块置于盛装有1-2毫升PBS缓冲液的EP管中；
步骤二：将步骤一中的EP管置于恒温37℃的环境中消化30分钟；
步骤三：消化期间间断摇晃振荡不低于5次；
步骤四：将消化后的溶液采用400目的尼龙网过滤，去除杂质和组织块，取悬液；
步骤五：将步骤四中获取的悬液离心，去除上清液，保留细胞沉淀；离心转速1500r/min，离心时间5分钟；
步骤六：台盼蓝常规染色，将染色后的单细胞悬液用血球计数板计数。
本实施例中的目标组织块采用成年小白鼠的肾脏。
实施例3：
本实施例是采用常规的酶消化法获取单细胞悬液，具体步骤如下：
步骤一：将选定的酶和组织块置于盛装有1-2毫升PBS缓冲液的EP管中；
步骤二：将步骤一中的EP管置于恒温37℃的环境中消化180分钟；
步骤三：消化期间间断摇晃振荡不低于15次；
步骤四：将消化后的溶液采用400目的尼龙网过滤，去除杂质和组织块，取悬液；
步骤五：将步骤四中获取的悬液离心，去除上清液，保留细胞沉淀；离心转速1500r/min，离心时间5分钟；
步骤六：台盼蓝常规染色，将染色后的单细胞悬液用血球计数板计数。本实施例中的目标组织块采用成年小白鼠的肾脏。
实施例4：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度为22g/L的分散酶II和35g/L卡那霉素，含量为0.8x106U/L的胶原酶，以及0.7g/L的葡萄糖。
实施例5：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度为22g/L的分散酶II和35g/L卡那霉素，含量为0.85x106U/L的胶原酶，0.7g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶。
实施例6：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度为22g/L的分散酶II和35g/L卡那霉素，含量为0.8x106U/L的胶原酶，0.7g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.08g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.6x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.22mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10- 3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为6.5x10-3mol/L的氯化钾。
实施例7：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为19g/L的分散酶II，含量为0.96x106U/L的胶原酶，0.98g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.06g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.16mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10- 3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5.6x10-3mol/L的氯化钾，35g/L卡那霉素，100U/L的青霉素,98mg/L的四环素,25mg/L的庆大霉素。
实施例8：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度为2g/L的分散酶II，含量为0.1x106U/L的胶原酶，0.98g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.06g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.16mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5.6x10-3mol/L的氯化钾，35g/L卡那霉素，100U/L的青霉素,98mg/L的四环素,25mg/L的庆大霉素。
实施例9：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为5g/L的分散酶II，含量为0.2x106U/L的胶原酶，0.98g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.06g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.16mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5.6x10-3mol/L的氯化钾，35g/L卡那霉素，100U/L的青霉素,98mg/L的四环素,25mg/L的庆大霉素。
实施例10：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为20g/L的分散酶II，含量为0.8x106U/L的胶原酶，0.98g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.06g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.16mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5.6x10-3mol/L的氯化钾，35g/L卡那霉素，100U/L的青霉素,98mg/L的四环素,25mg/L的庆大霉素。
实施例11：
松解保护剂，由以下组分混合而成：浓度均为40g/L的分散酶II，含量为1.1x106U/L的胶原酶，0.98g/L的葡萄糖，0.065g/L的胰肽酶；浓度为0.06g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.16mol/L的氯化钠；浓度为2.5x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5.6x10-3mol/L的氯化钾，35g/L卡那霉素，100U/L的青霉素,98mg/L的四环素,25mg/L的庆大霉素。
实施例12：
一种酶溶液，由下述组分构成：200-300IU/mL的Ⅰ型胶原酶，0.4g/L的氯化钾，0.4g/L的氯化镁，8g/L的分散酶IV，以及PBS缓冲液。
实施例13：
一种酶溶液，由Hank’s液，0.9％的氯化钠注射液，2.1g/L的青霉素，1.5g/L的硫酸卡那霉素，105mg/L的胶原酶组成。
实施例14：
一种酶溶液，由PBS缓冲液，80mg/L链酶蛋白酶，2.1g/L的青霉素，1.5g/L的硫酸卡那霉素，128mg/L的胰蛋白酶组成。
实施例15：
如图1-10所示，为了真实的反应现有的酶消化技术与本申请的松解保护剂在本申请公开的获取单细胞悬液技术之间的区别，本实施例以对照实验的方式进行区分。
按照分组的方式进行实验：
1组：将小白鼠的肾脏用实施例4中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液；见图1所示内容。
2组：将小白鼠的肾脏用实施例5中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液；见图2所示内容。
3组：将小白鼠的肾脏用实施例6中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液；见图3所示内容。
4组：将小白鼠的肾脏用实施例7中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液；见图4所示内容。
5组：将小白鼠的肾脏用实施例12中的酶溶液，按照实施例2的制备方法制备单细胞悬液；见图5所示内容。
6组：将小白鼠的肾脏用实施例13中的酶溶液，按照实施例2的制备方法制备单细胞悬液；见图6所示内容。
7组：将小白鼠的肾脏用实施例14中的酶溶液，按照实施例2的制备方法制备单细胞悬液；见图7所示内容。
8组：将小白鼠的肾脏用实施例12中的酶溶液，按照实施例3的制备方法制备单细胞悬液；见图8所示内容。
9组：将小白鼠的肾脏用实施例13中的酶溶液，按照实施例3的制备方法制备单细胞悬液；见图9所示内容。
10组：将小白鼠的肾脏用实施例14中的酶溶液，按照实施例3的制备方法制备单细胞悬液；见图10所示内容。
采用血球计数板的方式对1-10组制备的单细胞悬液中的细胞数采用随机统计的方式进行采集，每组采集3次，分别记录随机3次采集到的细胞数量，并计算每组对应细胞数量的平均值，平均值以取整的方式记录。采集的细胞数量越多表示单细胞化越好，单细胞悬液中的单细胞浓度越高，效果越好；细胞数量越少表示松解保护剂或者酶溶液对于组织块的裂解分散能力越差，同时，也表明制备单细胞悬液的方法效果越差。
详情见表1所示。
组别 实验方法 第一次采集 第二次采集 第三次采集 平均细胞数量(个)
1 实施例4+实施例1 28 19 34 27
2 实施例5+实施例1 36 22 31 29
3 实施例6+实施例1 32 28 34 31
4 实施例7+实施例1 27 24 40 30
5 实施例12+实施例2 1 2 1 1
6 实施例13+实施例2 3 0 0 1
7 实施例14+实施例2 0 1 0 0
8 实施例12+实施例3 4 2 11 5
9 实施例13+实施例3 3 4 6 4
10 实施例14+实施例3 7 3 4 4
表1血球计数板计数法对1-10组获取的细胞数量一览表
由表1所示的内容可以看出，采用常规的酶溶液裂解分散组织获得单细胞悬液的方法具有微弱的效果，可以分离组织块处于表面的细胞，但是实际能够采集到的细胞的数量非常有限完全不能满足后续实验的要求。效果最好的8组采集到的数量最大也只有7个，约为本申请公开的松解保护剂和制备单细胞悬液方法获取的20％-25％，效果最差的为0，则并未真实的采集到单细胞；从数据上分析可以看出：
1-4组为本申请的方案，获取的平均细胞数约分别为27、29、31和30，数据值接近，排除实验操作等因素导致的实验数据失真的问题，数据反映客观实际的程度高。
5-7组为现有的酶溶液分散裂解组织块获取单细胞悬液的方式，采用37℃恒温环境酶消化30分钟，分别获得1、1和0个，平均获得的单细胞数量不足1个；然而5-7组中采用的酶均是本领域常用的酶类型，涵盖胶原酶、链酶蛋白酶和胰蛋白酶；但是获取到的细胞平均数量差距不超过1，说明并不是酶的问题，亦不是消化环境的问题。因为本领域普通技术人员均公知37℃的温度是酶最佳的活性温度，那么说明采用常规的酶消化法短时间消化并不能通过常规离心的方式获取到理想的单细胞，这一点也再次应证了为什么现有技术中的酶消化法都是会消化2-5小时之久，根据不同组织情况和酶的类型，具体时间不同，但是往往都会超过3个小时以上，否则实验结果就会如5-7组一样不能有效的获取到相对量的单细胞。
8-10组为按照5-7组的酶溶液和实施例3的方式进行，相对于5-7组的区别在于延长了酶消化的时间，即从消化30分钟延长到消化180分钟。其他条件不变，从最终获得的单细胞数量为5、4和4个可以看出，不同的酶之间在延长消化时间后出现的差异并不明显，时间延长了6倍，获取的单细胞数量增长了5倍，说明采用现有的酶消化法是可行的，只是消化的时间需要达到数小时之久，但是最终获取的单细胞数量虽会随着时间的延长而增多，但是绝对值依然不够高，远远小于本发明所获取到的细胞数量。由此可以显而易见的发现，1-4组的松解保护剂和单细胞悬液制备方法能够有效的快速获取到足够量的单细胞，细胞的分散理解效果非常好，相对于现有技术效果显著。
实施例16：
本实施例主要是通过染色的方式检验分散酶II和胶原酶浓度对所获取的单细胞中具有活力的细胞的情况。具体检验方式如下：
具体结合附图11-14所示，本实施例按照本申请松解保护剂的优选配方，将分散酶II和胶原酶的浓度由低到高进行配置，然后将不同酶浓度配置的松解保护剂分别按照实施例1的方法步骤制备并染色观察：
A组：将小白鼠的胰腺用实施例8中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液并采用台盼蓝染色。如图11所示，虽然悬液中具有大量的单细胞存在，但是被台盼蓝染色后，数量集聚的峰值基本靠近染色强度最高的位置，那么说明虽然按照实施例1，即本申请公开的单细胞悬液制备方法能够有效的将胰腺组织块单细胞化，但是绝大部分的细胞已经遭受到不同程度的破话，亦即是绝大部分的单细胞的活性极低，甚至已经死亡。
B组：将小白鼠的胰腺用实施例9中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液并采用台盼蓝染色。如图12所示，随着分散酶II和胶原酶的浓度增高，细胞被染色的数量和程度与A组呈现的集聚在高染色强度区域有所区别，虽然峰值依然处于与A组相近的位置，但是中低染色强度中的细胞数量分布略有增加，由于A组和B组的区别仅仅只有酶的浓度，那么说明在实施例8和实施例9中酶的浓度区间范围内，具有活性的细胞数量占比随着酶的浓度增加而增加的。此处所指酶的浓度具体为分散酶II和胶原酶的浓度。
C组：将小白鼠的胰腺用实施例10中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液并采用台盼蓝染色。如图13所示，单细胞数量集聚的峰值对应的颜色强度从A、B组的700+下降到不足500，说明随着分散酶II和胶原酶浓度进一步增加，活性细胞的数量亦在增长。
D组：将小白鼠的胰腺用实施例11中的松解保护剂，按照实施例1的制备方法制备单细胞悬液并采用台盼蓝染色。如图14所示内容，单细胞数量集聚峰值进一步下降至260左右的低染色强度，处于高于600以上的高染色强度对应的单细胞数量明显下降，这说明采用实施例11的松解保护剂配合实施例1的制备方法能够有效的获取活细胞，从图14中可以显而易见的看出，具备活性的细胞占单细胞总数的绝大部分，足以满足当前单细胞测序即原代细胞培养的条件。
值得说明的是，本实施例采用台盼蓝染色的主要原因是台盼蓝能够轻易的将死细胞，被破坏的细胞进行染色，但是对于完整的活性细胞则不易染色，通过采用流式细胞分析，结合呈现的染色强度与细胞数量的关系，能够轻易的判别单细胞中活性细胞的情况。
由图11-14所示内容可显而易见的知晓，分散酶II浓度在40g/L和胶原酶浓度在1.1x106U/L以内，单细胞活性随着酶的浓度增加而增加。经申请人屡次实验发现，除浓度意外分散酶II和胶原酶二者需要配合使用对于单细胞活性的保留具有良好效果。将二者择一作用，采用同样的实验环境和实验方法其效果都会大大折扣，同理，将分散酶II替换为I型、Ⅲ型或者Ⅳ型虽能够获取到活性单细胞，但是效果亦不如分散酶II稳定，同时与胶原酶配合的效果亦会下降。
实施例17：
本实施例是将实施例4和实施例11的松解保护剂分别采用实施例1的方法制备单细胞悬液并采用台盼蓝染色，并每间隔60分钟进行流式细胞分析，通过三次分析观察细胞活性和细胞死亡情况。具体如图15所示，实施例4的松解保护剂由于只有用于分散细胞的成分和细胞存活所必须的营养物质，并相对于实施例11缺少了细胞生存的稳定内环境，经过近3小时的常温静置，细胞活性明显降低，存在大量被染色细胞，说明死亡细胞的数量呈急剧增加态势。
如图16所示，由于实施例11为本申请经过反复试验获得的优选配比，在同样条件下，经过近3小时分别观察细胞死亡情况，虽然整体死亡细胞呈上升态势，随着静置时间越长死亡希望的数量越多，但是细胞活性的保留度依然很高，活性细胞绝对值依然处于较大量级，说明实施例11中的配比配合实施例1的制备方法获取高存活率的单细胞效果是明显优于现有技术的，且制备的时间相对于现有技术而言极大的缩短。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.松解保护剂，其特征在于，由以下组分混合而成：
浓度均为14～58g/L的分散酶II和卡那霉素，
含量为0.8x106～1.25x106U/L的胶原酶，
以及0.7g～2.2g/L的葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的松解保护剂，其特征在于，还包括0.065～0.174g/L的胰肽酶。
3.根据权利要求1或2所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为0.05～0.08g/L的一水合磷酸氢二钠、浓度为0.45x10-3～0.6x10-3mol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.22mol/L的氯化钠。
4.根据权利要求1或3所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为2.5x10-3～3.2x10-3mol/L的氯化钙和等浓度的氯化镁，以及浓度为5x10-3～6.5x10-3mol/L的氯化钾。
5.根据权利要求4所述的松解保护剂，其特征在于，还包括浓度为3.8x10-3～5.0x10- 3mol/L的碳酸氢钠。
6.根据权利要求5所述的松解保护剂，其特征在于，还包括100U/L～120U/L的青霉素,98～110mg/L的四环素,16～25mg/L的庆大霉素。
7.根据权利要求6所述的松解保护剂，其特征在于，所述分散酶II的浓度分别为19-22g/L，所述卡那霉素的浓度分别为20-21g/L，胶原酶的含量为0.96x106～1.03x106U/L，葡萄糖浓度为0.98～1.03g/L，碳酸氢钠的浓度为4.0x10-3mol/L。
8.根据权利要求7所述的松解保护剂，其特征在于，所述一水合磷酸氢二钠的浓度为0.06g/L、磷酸二氢钾的浓度为0.45x10-3mol/L和氯化钠的浓度为0.14～0.16mol/L；氯化镁和氯化钙的浓度均为3.0x10-3～3.1x10-3mol/L，氯化钾的浓度为5.4x10-3～5.6x10-3mol/L。
9.根据权利要求4-8任一项所述的松解保护剂在获取高存活率单细胞悬液中的应用。
10.高存活率单细胞悬液的制备方法，其特征在于：采用权利要求8中的松解保护剂对目标组织块进行浸泡，再采用超声消融仪对组织块进行消融，具体包括以下步骤：
步骤S100，在无菌环境下取目标组织块,并用剪刀将组织块剪碎至不大于2mm3的小块；
步骤S200，将目标组织块置于容器中用PBS缓冲液清洗，直到PBS缓冲液目测澄清为止，其中组织块的最大外部尺寸不超过2毫米；
步骤S300，将目标组织块置于1.5毫升的EP管中，同时，在EP管中加入权利要求8中所述松解保护剂，静置5-15分钟；
步骤S400，将超声消融仪的频率调整到15-60kHz，功率调整到1-10w，将超声消融仪的振子置于EP管中，振子距离EP管底部距离保持1-2毫米，消融时间设定不超过9秒；
步骤S500，取出振子，采用300目尼龙网过滤，1000-1500r/min离心，去除上清液，取10ul单细胞沉淀置于1ml生理盐水中获得单细胞悬液。
CN202010069120.2A 2020-01-21 2020-01-21 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用 Pending CN111235090A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010069120.2A CN111235090A (zh) 2020-01-21 2020-01-21 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010069120.2A CN111235090A (zh) 2020-01-21 2020-01-21 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111235090A true CN111235090A (zh) 2020-06-05

Family

ID=70876280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010069120.2A Pending CN111235090A (zh) 2020-01-21 2020-01-21 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111235090A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234658A (zh) * 2021-06-30 2021-08-10 成都导胜生物技术有限公司 一种基于研磨制备存活单细胞的方法
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557328A (zh) * 2017-10-31 2018-01-09 妙顺（上海）生物科技有限公司 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法
CN109536449A (zh) * 2018-12-25 2019-03-29 中国医学科学院北京协和医院 从异常组织中分离单细胞的方法
CN109652312A (zh) * 2019-02-01 2019-04-19 成都导胜生物技术有限公司 基于超声原理的手持式动植物组织消融仪
CN110055222A (zh) * 2019-04-29 2019-07-26 北京和合医学诊断技术股份有限公司 包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法
CN110408591A (zh) * 2019-08-23 2019-11-05 杨慧慧 一种可获得高活性软骨细胞的消化液

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107557328A (zh) * 2017-10-31 2018-01-09 妙顺（上海）生物科技有限公司 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法
CN109536449A (zh) * 2018-12-25 2019-03-29 中国医学科学院北京协和医院 从异常组织中分离单细胞的方法
CN109652312A (zh) * 2019-02-01 2019-04-19 成都导胜生物技术有限公司 基于超声原理的手持式动植物组织消融仪
CN110055222A (zh) * 2019-04-29 2019-07-26 北京和合医学诊断技术股份有限公司 包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法
CN110408591A (zh) * 2019-08-23 2019-11-05 杨慧慧 一种可获得高活性软骨细胞的消化液

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法
CN113234658A (zh) * 2021-06-30 2021-08-10 成都导胜生物技术有限公司 一种基于研磨制备存活单细胞的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lasfargues et al. A method for the continuous cultivation of mammary epithelium
Karnovsky The fine structure of mitochondria in the frog nephron correlated with cytochrome oxidase activity
CN111235090A (zh) 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用
JPH01281048A (ja) 新規酵素製剤を用いる穀類の浸漬方法
CN115354018B (zh) 一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用
CN113308437A (zh) 用于快速培养骨转移癌类器官的培养基、方法以及试剂盒
CN113736734B (zh) 一种用于灵长类动物神经元分离的试剂盒及方法
Lukondeh et al. Evaluation of Kluyveromyces marxianus as a source of yeast autolysates
WO1994016099A1 (en) Media for isolation and stabilization of cells
AU611508B2 (en) Method for culturing pearls
Takai et al. Comparative Studies of Karyotypes and Distributions of Nucleolus Organizer Regions in Pomacentrid Fishes I
Luria et al. Differentiation of hepatic and hematopoietic cells and synthesis of blood serum proteins in organ cultures of the liver
CN111748518B (zh) 心肌细胞的分离试剂和分离方法
Mallette et al. Growth in culture of trypsin dissociated thyroid cells from adult rats
CN109479873B (zh) 一种脂肪组织保存液及其应用
CN113512530A (zh) 一种单细胞悬液制备试剂盒
CN112322586A (zh) 一种肿瘤组织消化液及其方法
Litchfield et al. Evidence for carbonic anhydrase in marine and freshwater algae: With 4 figures and 3 tables in the text
CN114698630B (zh) 一种胎盘组织保存液及其制备方法与应用
CN114480195B (zh) 一种幽门螺杆菌快速增菌培养试剂及其制备方法
CN112410287B (zh) 一种青海湖裸鲤胚胎培养液及其制备方法
LU501373B1 (en) A method for constructing a broiler muscle cell heat stress model
Brooks The isolation of epithelial cells from the rat epididymis
EP0857202B1 (en) Method for inhibiting chymopapain and papain enzyme activity with polysaccharides of animal origin
Frolova et al. Preparation of a Single-Cell Suspension from Tumor Biopsy Samples for Single-Cell RNA Sequencing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination