CN110408591A - 一种可获得高活性软骨细胞的消化液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体外组织细胞分离技术领域，提供了一种可获得高活性软骨细胞的消化液，将Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶相互复配，提高了消化液的消化速率，本发明通过在消化液中添加人血白蛋白，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶不受损伤及具有较高的活性；在消化添加细胞保护剂，对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。

Description

一种可获得高活性软骨细胞的消化液

技术领域

本发明属于体外组织细胞分离技术领域，具体涉及一种可获得高活性软骨细胞的消化液。

背景技术

软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌II型胶原(typeIIcollagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持关节软骨的功能。在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡；而软骨细胞主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复一直以来都是医学界的难题之一。近来年随着组织工程技术和新型生物材料的出现，自体软骨细胞移植在治疗软骨损伤在国内外都有相关应用。临床上，软骨组织材料不足，软骨细胞量有限，且培养增值能力不足限制了其发展。

针对软骨组织材料的不足，从有限的软骨组织中提取足够量及活性高的软骨细胞成为后续软骨细胞培养的关键。目前，软骨细胞分离方法较为常见的是通过Ⅱ型胶原酶消化法来进行获取，但是该方法存在较多的缺点，主要包括：(1)Ⅱ型胶原酶虽然属于温性消化酶，但是依然存在对细胞的损伤作用，特别在消化过度的时候，对细胞的损伤十分明显；(2)Ⅱ型胶原酶易受温度、PH、其他蛋白酶等方面的影响而发生变性，所以Ⅱ型胶原酶在使用的过程中极易出现活性丧失，降低消化作用，严重的将导致无法实现对软骨细胞的消化分离。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种快速高效分离软骨细胞的方法，通过添加相关保护剂，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶活性，同时对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。本发明通过以下技术方案实现该目的：

本发明的目的在于提供一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其技术点在于：以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.1~0.2g/L

Ⅳ型胶原酶 0.05~0.5g/L

人血白蛋白 5~20g/L

细胞保护剂 2~8g/L。

在本发明的有的实施例中，所述的基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

在本发明的有的实施例中，所述的DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

在本发明的有的实施例中，所述的Ⅳ型胶原酶的分子量为68~130KD。

在本发明的有的实施例中，所述的人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

在本发明的有的实施例中，所述的细胞保护剂为美司钠、石雷佐生或者氨磷汀中的至少一种。

在本发明的有的实施例中，所述的消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.3~0.5mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积10~15倍的消化液，37℃消化17~20小时。

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用150~250目滤网过滤，收集滤液，1000~2000r/min离心2~8min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.1~0.3%台盼蓝染色，活细胞率90~95%，CO₂培养箱孵育。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，将Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶相互复配，提高了消化液的消化速率，本发明通过在消化液中添加人血白蛋白，缓冲其他外源性蛋白酶对Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶的分解作用，保证Ⅱ型胶原酶不受损伤及具有较高的活性；在消化添加细胞保护剂，对软骨细胞起到良好的保护作用，有效防止其在消化过程中受到损伤，有利于得到数量更多、活性更高的软骨原代细胞。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明提供一种可获得高活性软骨细胞的消化液，以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.15g/L

Ⅳ型胶原酶 0.0.25g/L

人血白蛋白 12.5g/L

美司钠 5g/L。

其中，基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

其中，DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

其中，Ⅳ型胶原酶的分子量为100KD。

其中，人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

其中，消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.4mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积12.5倍的消化液，37℃消化18.5小时。

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤，收集滤液，1500r/min离心5min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.2%台盼蓝染色，活细胞率92.5%，CO₂培养箱孵育。

实施例2

本发明提供一种可获得高活性软骨细胞的消化液，以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.1g/L

Ⅳ型胶原酶 0.5g/L

人血白蛋白 20g/L

石雷佐生 2g/L。

其中，基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

其中，DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

其中，Ⅳ型胶原酶的分子量为130KD。

其中，人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

其中，消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.3mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积10倍的消化液，37℃消化20小时。

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用150目滤网过滤，收集滤液，2000r/min离心2min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.1%台盼蓝染色，活细胞率90%，CO₂培养箱孵育。

实施例3

本发明提供一种可获得高活性软骨细胞的消化液，以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.2g/L

Ⅳ型胶原酶 0.05g/L

人血白蛋白 5g/L

氨磷汀 8g/L。

其中，基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

其中，DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

其中，Ⅳ型胶原酶的分子量为68KD。

其中，人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

其中，消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.5mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积15倍的消化液，37℃消化20小时。

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用250目滤网过滤，收集滤液，2000r/min离心8min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.3%台盼蓝染色，活细胞率95%，CO₂培养箱孵育。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：以完全培养基为基础液体，所述的可获得高活性软骨细胞的消化液含有以下成分：

Ⅱ型胶原酶 0.1~0.2g/L

Ⅳ型胶原酶 0.05~0.5g/L

人血白蛋白 5~20g/L

细胞保护剂 2~8g/L。

2.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的基础液体为8v/v％的血清的DMEM培养基。

3.根据权利要求2所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的DMEM培养基中含有氯化钙、硝酸铁、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾、丁二酸、丁二酸那、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡哆辛、葡萄糖、丙酮酸钠和酚红。

4.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的Ⅳ型胶原酶的分子量为68~130KD。

5.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的人血白蛋白是质量分数为5wt%100mL或者质量分数为20wt%50mL的人血白蛋白注射剂。

6.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的细胞保护剂为美司钠、石雷佐生或者氨磷汀中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的一种可获得高活性软骨细胞的消化液，其特征在于：所述的消化液的使用方法如下：

S1选取不同年龄组组织的活力高的兔子，耳静脉空气注射法处死后，无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨，剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜，放入盛有PBS液的培养皿中；

S2将分离得到的软骨组织剁碎成0.3~0.5mm的组织块，移入25cm²培养瓶，用含双抗的PBS液冲洗软骨3次；

S3加入软骨体积10~15倍的消化液，37℃消化17~20小时；

S3在倒置显微镜下观察，当游离出单个细胞后，加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化；

S4将细胞团吹打成单个细胞后用150~250目滤网过滤，收集滤液，1000~2000r/min离心2~8min；

S5弃上清，加入DS培养液重悬，0.1~0.3%台盼蓝染色，活细胞率90~95%，CO₂培养箱孵育。