CN108070550A - 一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，其特征在于：此培养液在基础培养液的基础上，添加了肝脱细胞基质溶液，并补充了胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清。此培养液用于肝细胞的体外培养，可促进肝细胞的增殖，并提高肝细胞的活性及功能。

Description

一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液。
背景技术
肝脏是人体重要的代谢器官之一，具有代谢，生物转化，蛋白合成，解毒以及免疫等多种功能。体外肝细胞培养可用于肝脏药物的毒性研究，也可为肝细胞组织工程等提供种子细胞。然而在体外培养条件下，肝细胞所具有的极性会很快丧失，其合成，代谢等生理功能难以维持。因此如何大量获得并维持较高功能肝细胞是体外培养所面临的关键问题。
有研究表明，在肝细胞的培养液中添加一些成分可以起到促进肝细胞生长以及提高功能的作用：胰岛素可以通过作用于肝表面的受体从而增强肝细胞对葡萄糖的摄取及利用，增强肝细胞活力与功能；转铁蛋白可以结合铁及微量元素，调节肝细胞的生长增殖与功能表达；亚硒酸钠可以保护肝细胞免受氧化应激；地塞米松、胰高血糖素参与肝细胞的糖类及脂类代谢。
然而，体内肝细胞的功能受到肝组织微环境的密切调控，肝组织微环境是含有多种细胞因子、细胞外基质成分以及细胞与细胞之间相互作用的三维环境。肝组织微环境中含有重要的细胞外基质成份，如不同类型的胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白以及多种糖胺聚糖等，这些基质成分除了起到支持作用外，还通过整合素等重要信号对肝细胞的增殖和功能起到重要的调控作用。这些作用是单凭添加胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松等成分所不能代替的。
为了进一步模拟肝细胞的体内生长环境，克服目前肝细胞培养液与体内差异过大的问题，本发明制备了一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，此培养液是在基础培养液的基础上添加肝脱细胞基质溶液，并补充胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清。此培养液可促进肝细胞的增殖，并提高肝细胞的活性及功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，其特征在于：此培养液在基础培养液的基础上，添加了肝脱细胞基质溶液，并补充了胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清。
此培养液用于肝细胞的体外培养，可促进肝细胞的增殖，并提高肝细胞的活性及功能。
本发明上述方法通过以下具体技术方案予以实现：
一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，其特征在于：此培养液在基础培养液的基础上，添加了肝脱细胞基质溶液，并补充了胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清；
所述基础培养液为DMEM培养液、F12培养液、DMEM/F12培养液、MEM培养液中的一种或二种以上的混合液；
所述培养液中肝脱细胞基质溶液的浓度为5-30％(v/v)；
所述培养液中胰岛素的浓度为5-100μg/L；
所述培养液中转铁蛋白的浓度为1-10mg/L；
所述培养液中亚硒酸钠的浓度为2-10μg/L；
所述培养液中地塞米松的浓度为0.1-10μg/L；
所述培养液中胎牛血清的浓度为5-20％(v/v)。
所述肝脱细胞基质溶液为动物肝脏经过加工制成；所述肝脱细胞基质溶液的制备包括以下两个过程：
(1)肝脱细胞基质颗粒的制备：取健康动物的完整肝叶冻存于-70至-80℃；冷冻24-48h后用切片机将肝叶切成3-5mm厚的肝组织片，将肝组织片与脱细胞液按1/10-1/20(w/v，g/ml)比例混合置于恒温摇床振摇(0-4℃，100-200转/分)去除肝细胞，脱细胞液成分以及处理时间依次为：双蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、24h；双蒸水、72h。处理后的肝脱细胞组织片在-70至-80℃冷冻后，经液氮研磨仪粉碎为粒径500-1000μm大小颗粒后冷冻干燥；
(2)肝脱细胞基质颗粒的溶液化：将冷冻干燥后的肝脱细胞颗粒与1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶剂为0.1mol/L盐酸)按10mg：1mL比例混合，经搅拌36-72h(20-25℃，400-600转/分)，离心10-30min(0-4℃，8000-12000转/分)后取上清，加入1-4mol/L氢氧化钠溶液调节上清pH至8.4-8.6永久灭活胃蛋白酶后，离心20-60min(0-4℃，12000-14000转/分)后取上清，上清溶液再依次经0.8μm、0.45μm以及0.22μm无菌滤膜过滤，透过滤膜的滤液置于0-4℃保存。
所述肝细胞包括人和/或哺乳动物来源的原代肝细胞、永生化肝细胞株、干细胞来源肝细胞或肝细胞聚集体中的一种或二种以上；哺乳动物为猪、牛、猴、兔、狗、猫、小鼠、大鼠中的一种或二种以上。
本发明的优点
1.肝脱细胞基质溶液制备方法简单，成本低；
2.脱细胞基质溶液较好地保留了体内肝脏的多种细胞外基质成分、生长因子和活性分子，将其添加到培养液中能补充缺乏肝组织微环境中含有重要的细胞外基质成分，从而促进肝细胞生长，并提高所培养的肝细胞的活性及功能；
3.胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松等物质的添加，可以协同脱细胞基质溶液起作用，从而可进一步提高肝细胞的增殖和功能表达。
附图说明
图1为平面培养的C3A肝细胞在不同培养液中的明场照片。图1A所用培养液为含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，图1B为本发明含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液(基质溶液含量为5％，v/v)。
图2为平面培养C3A细胞在不同培养液中的增殖曲线。组1所用培养液为含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，组2为本发明含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液(基质溶液含量为5％，v/v)。
图3为三维海藻酸钙微球包封的HepG2肝细胞在本发明含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液中生长的明场照片。
图4为不同培养液中海藻酸钙微球包封HepG2肝细胞的增殖曲线。组1所用培养液为含有20％胎牛血清的MEM培养液组，组2为本发明含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液组(添加5％脱细胞基质溶液，v/v)，组3(添加10％脱细胞基质溶液，v/v)。
图5为不同培养液中微球包封HepG2肝细胞的白蛋白分泌水平。组1所用培养液为含有20％(v/v)胎牛血清的MEM培养液组，组2为本发明含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液组(添加5％脱细胞基质溶液，v/v)，组3(添加10％脱细胞基质溶液，v/v)。
具体实施方式
实施例1：含有肝脱细胞基质成分的培养液对平面培养的C3A细胞生长的影响
肝脱细胞基质溶液的制备：(1)肝脱细胞基质颗粒的制备：手术获取家兔的肝右叶及左外叶冻存于-80℃。冷冻24h后用切片机将肝叶切成3-5mm厚的肝组织片，将肝组织片与脱细胞液按1/10(w/v)比例混合置于恒温摇床振摇(4℃，200转/分)去除肝细胞，脱细胞液成分以及处理时间依次为：双蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、24h；双蒸水、72h。处理后的肝脱细胞组织片在-80℃冷冻后，经液氮研磨仪粉碎为粒径800-1000μm大小颗粒后冷冻干燥；
(2)肝脱细胞基质颗粒的溶液化：将冷冻干燥后的肝脱细胞颗粒与1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶于0.1mol/L盐酸)按10mg：1mL比例混合，经搅拌48h(25℃，500转/分)，离心15min(4℃，8000转/分)后取上清，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节上清pH至8.4永久灭活胃蛋白酶后，离心30min(4℃，12000转/分)后取上清，上清溶液再经0.8μm、0.45μm以及0.22μm无菌滤膜过滤后滤液置于4℃保存。
配制含有肝脱细胞基质溶液及其它添加物的DMEM/F12培养液：此培养液中肝脱细胞基质溶液的浓度为5％(v/v)、胰岛素的浓度为15μg/L、转铁蛋白的浓度为2mg/L、亚硒酸钠的浓度为2μg/L、地塞米松的浓度为1μg/L、胎牛血清的浓度为10％(v/v)，添加以上成分至DMEM/F12基础培养液中，混合均匀后调节培养液pH至7.2，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌，于4℃保存。
将培养融合度80％的C3A肝细胞消化后以1×105个/孔的密度接种于12孔板中，每孔加入1mL含有肝脱细胞基质溶液及其它添加物的DMEM/F12培养液。对照组加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，在37℃，含有5％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养，隔天换液，观察C3A细胞的形态并检测增殖。结果显示，两组C3A细胞生长状态良好，但在含有肝脱细胞基质成分的培养液中生长的C3A细胞(图1A)在培养7天时的细胞密度明显高于对照组(图1B)。CCK8法检测的增殖结果显示，含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液培养的C3A细胞从第5天起细胞增殖显著高于含血清的DMEM/F12组(图2)。
实施例2：含有肝脱细胞基质成分的培养液对三维海藻酸钙微球包封的HepG2肝细胞生长及功能的影响
制备肝脱细胞基质溶液：(1)制备肝脱细胞基质颗粒：获取实验用小型猪的完整的肝左叶冻存于-80℃。冷冻48h后将肝叶切成3-5mm厚的肝组织片，将肝组织片与依次与以下脱细胞液按1/10(w/v)比例混合置于恒温摇床振摇(4℃，200转/分)去除肝细胞：双蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、24h；双蒸水、72h。处理后的肝脱细胞组织片在-80℃冷冻后，经液氮研磨仪粉碎为粒径400-600μm大小颗粒后冷冻干燥；(2)肝脱细胞基质颗粒的溶液化：将冷冻干燥后的肝脱细胞颗粒与1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶剂为0.1mol/L盐酸)按10mg：1mL比例混合，经搅拌48h(20℃，600转/分)，离心30min(4℃，12000转/分)后取上清，加入1mol/L氢氧化钠溶液调节上清pH至8.6永久灭活胃蛋白酶后，离心40min(0-4℃，12000转/分)后取上清，上清溶液再依次经0.8μm、0.45μm以及0.22μm无菌滤膜过滤，透过滤膜的滤液置于4℃保存。
配制含有肝脱细胞基质溶液及其它添加物的MEM培养液：加入相应体积肝脱细胞基质溶液及其它添加成分至MEM培养液中，混合均匀后调节培养液pH至7.2，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌，于4℃保存。
将HepG2肝细胞按2×106cells每1mL 1.8％(w/v)海藻酸钠溶液的比例混匀，使用静电液滴发生器将混匀悬液滴入0.1mol/L氯化钙溶液中钙化30min，获得粒径为500μm左右的海藻钙凝胶包封HepG2微球，将微球置于不同培养液中在37℃，含有5％二氧化碳的细胞培养箱中进行培养：组1所用培养液为含有20％(v/v)胎牛血清的MEM培养液，组2为本发明含有肝脱细胞基质成分的MEM培养液(添加5％脱细胞基质溶液，v/v)，组3为为本发明含有肝脱细胞基质成分的MEM培养液(添加10％脱细胞基质溶液，v/v)。组2及组3培养液的其他添加成分均为胰岛素的浓度为80μg/L、转铁蛋白的浓度为5mg/L、中亚硒酸钠的浓度为10μg/L、地塞米松的浓度为8μg/L、胎牛血清的浓度为20％(v/v)。实验结果表明：三组细胞生长状态良好，图3为组3的HepG2细胞培养至第7天时的明场照片。CCK8法检测细胞增殖结果显示，含有肝脱细胞基质成分的培养液中培养的微球化HepG2细胞(组2与组3)从第7天的细胞增殖显著高于含有20％胎牛血清的MEM培养液对照组组1，而添加10％脱细胞基成分的组3中HepG2细胞增殖高于添加5％脱细胞基质成分组2(图4)。ELISA法检测三组细胞在培养第10天时的白蛋白分泌，结果显示：添加脱细胞基质成分组(组2与组3)的白蛋白分泌均显著高于对照组(组1)，添加10％脱细胞基质溶液组3中HepG2细胞白蛋白分泌显著高于添加5％脱细胞基质溶液组2(图5)。

Claims (5)

1.一种含有肝脱细胞基质成分的肝细胞培养液，其特征在于：此培养液在基础培养液的基础上，添加了肝脱细胞基质溶液，并补充了胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、地塞米松及胎牛血清；
所述基础培养液为DMEM培养液、F12培养液、DMEM/F12培养液、MEM培养液中的一种或二种以上的混合液；
所述培养液中肝脱细胞基质溶液的浓度为5-30％(v/v)；
所述培养液中胰岛素的浓度为5-100μg/L；
所述培养液中转铁蛋白的浓度为1-10mg/L；
所述培养液中亚硒酸钠的浓度为2-10μg/L；
所述培养液中地塞米松的浓度为0.1-10μg/L；
所述培养液中胎牛血清的浓度为5-20％(v/v)。
2.按照权利要求1所述的肝细胞培养液，其特征在于：
所述肝脱细胞基质溶液为动物肝脏经过加工制成；所述肝脱细胞基质溶液的制备包括以下两个过程：
(1)肝脱细胞基质颗粒的制备：取健康动物的完整肝叶冻存于-70至-80℃；冷冻24-48h后用切片机将肝叶切成3-5mm厚的肝组织片，将肝组织片与脱细胞液按1/10-1/20(w/v，g/ml)比例混合置于恒温摇床振摇(0-4℃，100-200转/分)去除肝细胞，脱细胞液成分以及处理时间依次为：双蒸水、72h；1％(v/v)Triton X-100和0.1％(v/v)氨水溶液、48h；0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、24h；双蒸水、72h。处理后的肝脱细胞组织片在-70至-80℃冷冻后，经液氮研磨仪粉碎为粒径500-1000μm大小颗粒后冷冻干燥；
(2)肝脱细胞基质颗粒的溶液化：将冷冻干燥后的肝脱细胞颗粒与1mg/mL胃蛋白酶溶液(溶剂为0.1mol/L盐酸)按10mg：1mL比例混合，经搅拌36-72h(20-25℃，400-600转/分)，离心10-30min(0-4℃，8000-12000转/分)后取上清，加入1-4mol/L氢氧化钠溶液调节上清pH至8.4-8.6永久灭活胃蛋白酶后，离心20-60min(0-4℃，12000-14000转/分)后取上清，上清溶液再依次经0.8μm、0.45μm以及0.22μm无菌滤膜过滤，透过滤膜的滤液置于0-4℃保存。
3.按照权利要求2所述的肝细胞培养液，其特征在于：
所述动物包括猪、牛、猴、兔、狗、猫、小鼠、大鼠中的一种或二种以上。
4.一种权利要求1-3任一所述肝细胞培养液的应用，其特征在于：此培养液用于肝细胞的体外培养。
5.按照权利要求4所述肝细胞培养液的应用，其特征在于：所述肝细胞包括人和/或哺乳动物来源的原代肝细胞、永生化肝细胞株、干细胞来源肝细胞或肝细胞聚集体中的一种或二种以上；哺乳动物为猪、牛、猴、兔、狗、猫、小鼠、大鼠中的一种或二种以上。
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