CN107557328A - 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法 - Google Patents

一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107557328A
CN107557328A CN201711048168.XA CN201711048168A CN107557328A CN 107557328 A CN107557328 A CN 107557328A CN 201711048168 A CN201711048168 A CN 201711048168A CN 107557328 A CN107557328 A CN 107557328A
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
cell
component
kcl
nacl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711048168.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张彬
张金保
陈燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wonderful (shanghai) Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Wonderful (shanghai) Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wonderful (shanghai) Biotechnology Co Ltd filed Critical Wonderful (shanghai) Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201711048168.XA priority Critical patent/CN107557328A/zh
Publication of CN107557328A publication Critical patent/CN107557328A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于分离贴壁细胞的消化液，包括组分A、组分B和组分C；所述组分A包括以下原料：NaCl、KCl、葡萄糖、KH2PO4、Na2HPO4；所述组分B包括以下原料：分散酶、木瓜蛋白酶、NaCl、KCl、葡萄糖、KH2PO4、Na2HPO4；所述组分C包括以下原料：NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖。本发明对贴壁细胞的解离效率高，对细胞的损伤比较小，毒性小，细胞的存活率很高；可以进行多次细胞传代而不影响细胞的活力；可用于无血清培养贴壁细胞的解离实验；操作简单，减少了不同操作者之间的实验结果的差异。

Description

一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体是一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法。
背景技术
细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定的营养条件下，使其生长繁殖并维持结构何功能的一种培养技术。从体内取出的细胞首次培养即为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一个容器才能继续生长，这个过程称为传代或继代培养。目前，用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法仍然存在以下缺点：对贴壁细胞的解离效率低，对细胞的损伤比较大，毒性大，细胞的存活率较低；解离后的贴壁细胞，进行多次细胞传代会影响细胞的活力；操作繁琐，不同操作者之间的实验结果的差异大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于分离贴壁细胞的消化液，包括组分A、组分B和组分C；组分A为细胞洗涤液，组分B为细胞解离液，组分C为细胞重悬液；所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl5-11份、KCl 0.1-1份、葡萄糖0.1-2份、KH2PO4 0.01-0.1份、Na2HPO4 0.02-0.05份；所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01-0.08份、木瓜蛋白酶0.01-0.08份、NaCl 500-900份、KCl 20-70份、葡萄糖20-200份、KH2PO4 2-8份、Na2HPO4 2-8份；所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 4-10份、KCl 0.1-1份、CaCl2 0.2-0.5份、MgCl2 0.1-0.5份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-4份、葡萄糖0.5-2份。
作为本发明进一步的方案：所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl 8份、KCl0.4份、葡萄糖1份、KH2PO4 0.06份、Na2HPO4 0.0475份。
作为本发明进一步的方案：所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01-0.05份、木瓜蛋白酶0.02-0.05份、NaCl 800份、KCl 40份、葡萄糖100份、KH2PO4 6份、Na2HPO4 4.75份。
作为本发明进一步的方案：所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 8.8份、KCl0.224份、CaCl2 0.44份、MgCl2 0.19份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38份、葡萄糖0.9份。
一种用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，包括以下步骤：(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞1-3次；(2)然后加入组分B，常温静止孵育细胞2-5分钟，收集解离的细胞到无菌的离心管里；(3)取100-300g解离的细胞，进行离心2-6分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞2次。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)取200g解离的细胞，进行离心5分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明对贴壁细胞的解离效率高，解离时间是2-5分钟；对细胞的损伤比较小，毒性小，细胞的存活率很高；本发明解离后的贴壁细胞，可以进行多次细胞传代而不影响细胞的活力；本发明没有动物源成分，可以用于无血清培养贴壁细胞的解离实验；本发明操作简单，减少了不同操作者之间的实验结果的差异。
附图说明
图1为正常人表皮黑素细胞消化4倍图。
图2为正常人表皮黑素细胞消化10倍图。
图3为正常人表皮角质形成细胞消化4倍图。
图4为正常人表皮角质形成细胞消化10倍图。
图5为正常人皮肤成纤维细胞消化4倍图。
图6为正常人皮肤成纤维细胞消化10倍图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种用于分离贴壁细胞的消化液，包括组分A、组分B和组分C；组分A为细胞洗涤液，组分B为细胞解离液，组分C为细胞重悬液；所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl 5份、KCl 0.1份、葡萄糖0.1份、KH2PO4 0.01份、Na2HPO4 0.02份；所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01份、木瓜蛋白酶0.01份、NaCl 500份、KCl 20份、葡萄糖20份、KH2PO4 2份、Na2HPO4 2份；所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 4份、KCl 0.1份、CaCl2 0.2份、MgCl2 0.1-份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸1份、葡萄糖0.5份。
一种用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，包括以下步骤：(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞1次；(2)然后加入组分B，常温静止孵育细胞2分钟，收集解离的细胞到无菌的离心管里，细胞孵育时间需要灵活把握，不同细胞需要的孵育时间不同，比如293T细胞需要的孵育时间比较短，Hela细胞稍微长些等，判断的标准是细胞全部脱离培养皿或者培养瓶即可；(3)取100g解离的细胞，进行离心2分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
实施例2
一种用于分离贴壁细胞的消化液，包括组分A、组分B和组分C；组分A为细胞洗涤液，组分B为细胞解离液，组分C为细胞重悬液；所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl11份、KCl 1份、葡萄糖2份、KH2PO4 0.1份、Na2HPO4 0.05份；所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.08份、木瓜蛋白酶0.08份、NaCl 900份、KCl 70份、葡萄糖200份、KH2PO4 8份、Na2HPO4 8份；所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 10份、KCl 1份、CaCl2 0.5份、MgCl2 0.5份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸4份、葡萄糖2份。
一种用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，包括以下步骤：(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞3次；(2)然后加入组分B，常温静止孵育细胞5分钟，收集解离的细胞到无菌的离心管里，细胞孵育时间需要灵活把握，不同细胞需要的孵育时间不同，比如293T细胞需要的孵育时间比较短，Hela细胞稍微长些等，判断的标准是细胞全部脱离培养皿或者培养瓶即可；(3)取300g解离的细胞，进行离心6分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
实施例3
一种用于分离贴壁细胞的消化液，包括组分A、组分B和组分C；组分A为细胞洗涤液，组分B为细胞解离液，组分C为细胞重悬液；所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl 8份、KCl 0.4份、葡萄糖1份、KH2PO4 0.06份、Na2HPO4 0.0475份；所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01-0.05份、木瓜蛋白酶0.02-0.05份、NaCl 800份、KCl 40份、葡萄糖100份、KH2PO4 6份、Na2HPO4 4.75份；所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 8.8份、KCl0.224份、CaCl2 0.44份、MgCl2 0.19份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38份、葡萄糖0.9份。
一种用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，包括以下步骤：(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞2次；(2)然后加入组分B，常温静止孵育细胞3分钟，收集解离的细胞到无菌的离心管里，细胞孵育时间需要灵活把握，不同细胞需要的孵育时间不同，比如293T细胞需要的孵育时间比较短，Hela细胞稍微长些等，判断的标准是细胞全部脱离培养皿或者培养瓶即可；(3)取200g解离的细胞，进行离心5分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
图1为正常人表皮黑素细胞消化4倍图。图2为正常人表皮黑素细胞消化10倍图。图3为正常人表皮角质形成细胞消化4倍图。图4为正常人表皮角质形成细胞消化10倍图。图5为正常人皮肤成纤维细胞消化4倍图。图6为正常人皮肤成纤维细胞消化10倍图。
本发明的工作原理是：在特殊的PH环境下，制备纳米解离粒子，解离粒子的密度和数量会根据需要解离的细胞的多少在微环境下进行适当的调整，有利于减少解离液对细胞的损伤。解离粒子在解离细胞的时候，作用位点主要在细胞与细胞贴附介子之间，短时间内对细胞膜的损伤极小，所以不会影响到细胞的膜的完整性和细胞膜表面糖蛋白的功能，有利于细胞的存活和后续细胞的发育。
本发明对贴壁细胞的解离效率高，解离时间是2-5分钟；对细胞的损伤比较小，毒性小，细胞的存活率很高；本发明解离后的贴壁细胞，可以进行多次细胞传代而不影响细胞的活力；本发明没有动物源成分，可以用于无血清培养贴壁细胞的解离实验；本发明操作简单，减少了不同操作者之间的实验结果的差异。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (7)

1.一种用于分离贴壁细胞的消化液，其特征在于，包括组分A、组分B和组分C；组分A为细胞洗涤液，组分B为细胞解离液，组分C为细胞重悬液；所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl 5-11份、KCl 0.1-1份、葡萄糖0.1-2份、KH2PO4 0.01-0.1份、Na2HPO4 0.02-0.05份；所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01-0.08份、木瓜蛋白酶0.01-0.08份、NaCl 500-900份、KCl 20-70份、葡萄糖20-200份、KH2PO4 2-8份、Na2HPO4 2-8份；所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 4-10份、KCl 0.1-1份、CaCl2 0.2-0.5份、MgCl2 0.1-0.5份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-4份、葡萄糖0.5-2份。
2.根据权利要求1所述的用于分离贴壁细胞的消化液，其特征在于，所述组分A包括以下重量份数的原料：NaCl 8份、KCl 0.4份、葡萄糖1份、KH2PO4 0.06份、Na2HPO4 0.0475份。
3.根据权利要求1所述的用于分离贴壁细胞的消化液，其特征在于，所述组分B包括以下重量份数的原料：分散酶0.01-0.05份、木瓜蛋白酶0.02-0.05份、NaCl 800份、KCl 40份、葡萄糖100份、KH2PO4 6份、Na2HPO4 4.75份。
4.根据权利要求1所述的用于分离贴壁细胞的消化液，其特征在于，所述组分C包括以下重量份数的原料：NaCl 8.8份、KCl 0.224份、CaCl2 0.44份、MgCl2 0.19份、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.38份、葡萄糖0.9份。
5.一种如权利要求1-4任一所述的用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞1-3次；(2)然后加入组分B，常温静止孵育细胞2-5分钟，收集解离的细胞到无菌的离心管里；(3)取100-300g解离的细胞，进行离心2-6分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
6.根据权利要求5所述的用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，其特征在于，步骤(1)去除细胞培养基，用组分A洗涤细胞2次。
7.根据权利要求5所述的用于分离贴壁细胞的消化液的分离方法，其特征在于，步骤(3)取200g解离的细胞，进行离心5分钟，去除上清，然后加入组分C，用枪头或者移液管轻轻吹打重悬细胞成单细胞悬液，然后进行细胞计数和细胞接种。
CN201711048168.XA 2017-10-31 2017-10-31 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法 Pending CN107557328A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711048168.XA CN107557328A (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711048168.XA CN107557328A (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107557328A true CN107557328A (zh) 2018-01-09

Family

ID=61032465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711048168.XA Pending CN107557328A (zh) 2017-10-31 2017-10-31 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107557328A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235090A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 成都导胜生物技术有限公司 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用
CN113088486A (zh) * 2021-03-03 2021-07-09 广东为象生物科技有限公司 用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1974763A (zh) * 2006-12-13 2007-06-06 青岛市中心医院 一种收集贴壁细胞的方法
CN101443445A (zh) * 2006-03-17 2009-05-27 塞拉提斯股份公司 用于增殖人胚泡衍生干细胞的培养系统和方法
CN102906244A (zh) * 2010-07-29 2013-01-30 泰尔茂株式会社 片状细胞培养物解离系统
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和系统
CN105296428A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 广州医科大学附属第三医院 一种提高诱导多能干细胞的体外分化造血效率的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101443445A (zh) * 2006-03-17 2009-05-27 塞拉提斯股份公司 用于增殖人胚泡衍生干细胞的培养系统和方法
CN1974763A (zh) * 2006-12-13 2007-06-06 青岛市中心医院 一种收集贴壁细胞的方法
CN102906244A (zh) * 2010-07-29 2013-01-30 泰尔茂株式会社 片状细胞培养物解离系统
CN103476924A (zh) * 2011-04-15 2013-12-25 普拉里斯坦有限公司 收获细胞的方法和系统
CN105296428A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 广州医科大学附属第三医院 一种提高诱导多能干细胞的体外分化造血效率的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
无天20101225: "PBS缓冲液配制", 《百度文库》 *
朴英实等: "《分子病理生物学实验技术指南》", 31 December 2015 *
肖锐: "《抑制SMN2外显子7剪接的调控蛋白的鉴定和作用机制研究》", 31 December 2016 *
雷根生物: "HEPES缓冲液（1*，含钙镁）", 《百度文库》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235090A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 成都导胜生物技术有限公司 松解保护剂及其制备高存活率单细胞悬液的方法及其应用
CN113088486A (zh) * 2021-03-03 2021-07-09 广东为象生物科技有限公司 用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法
CN113088486B (zh) * 2021-03-03 2023-06-16 广东为象生物科技有限公司 用于分离贴壁细胞的无酶解离液及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bischoff Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle
CN103667176B (zh) 鲤疱疹病毒ⅱ型敏感的异育银鲫脑组织细胞系及其建立方法和应用
CN101818127B (zh) 一种小鼠精原干细胞分离培养方法
Ziomek et al. Properties of polar and apolar cells from the 16-cell mouse morula
CN104087550B (zh) 一种大鼠心肌细胞的培养方法
CN105238748A (zh) 一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法
CN106834218A (zh) 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法
CN104911145B (zh) 一种高活力原代软骨细胞的制备方法
CN108300689A (zh) 一种分离与原代培养胎盘壁蜕膜间充质干细胞的方法
CN104988121A (zh) 一种神经元、星形胶质细胞共培养体的建立方法
CN106801032A (zh) 人羊膜上皮干细胞库的构建方法
CN104031879A (zh) 一种体外分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法
CN107557328A (zh) 一种用于分离贴壁细胞的消化液及其分离方法
CN104974980B (zh) 一种人类羊膜上皮细胞的分离方法
CN103966159A (zh) 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法
CN104152408B (zh) 亚全能干细胞的制备方法
CN106434536B (zh) 人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法
CN107779429A (zh) 一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法
Watson et al. ULTRASTRUCTURAL MORPHOLOGY OF MICROTHAMNION ZOOSPORES 1
CN106834217A (zh) 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用
CN107541497A (zh) 人垂体腺瘤细胞株及其用途
CN107227296A (zh) 一种骨髓单核细胞分离、鉴定及诱导分化的方法
CN108277200A (zh) 一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法
CN107460166A (zh) 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
CN111321117A (zh) 一种三维培养扩增造血干细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180109