CN107460166A - 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107460166A
CN107460166A CN201710873595.5A CN201710873595A CN107460166A CN 107460166 A CN107460166 A CN 107460166A CN 201710873595 A CN201710873595 A CN 201710873595A CN 107460166 A CN107460166 A CN 107460166A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ghr
sarcoblasts
breeder
centrifugation
culture method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710873595.5A
Other languages
English (en)
Inventor
林树茂
李升广
张绮琼
郭金彪
岳孝亭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN201710873595.5A priority Critical patent/CN107460166A/zh
Publication of CN107460166A publication Critical patent/CN107460166A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞的体外培养领域，具体涉及一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。本发明以GHR基因缺失型突变体矮小型鸡的鸡胚为材料，采用胶原酶和胰酶消化法和差速贴壁法进行GHR基因缺失型突变体矮小型鸡成肌细胞的分离培养，并采用免疫荧光法进行特异性鉴定，为鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养提供了一种新方法。

Description

一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞的体外培养领域，具体涉及一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。
背景技术
成肌细胞位于骨骼肌细胞膜和细胞基膜之间，主要来源于动物胚胎的中胚层，属于单核梭型细胞。动物的成肌细胞最早于1961年从青蛙的骨骼肌肌纤维中发现并分离培养。研究表明，成肌细胞在动物的骨骼肌生长、发育、修复与维持中发挥极其重要的作用。
通过多年的研究，人们发现体外分离培养培养的成肌细胞可广泛应用在遗传分析、基因功能鉴定、基因治疗、组织工程等许多领域。成肌细胞主要以单核小圆形细胞分布于肌纤维外周。当骨骼肌遭受外界刺激或受到损伤后，成肌细胞被激活并表达生肌调节因子，融合形成新的肌核从而导致骨骼肌纤维的肥大和延伸，使骨骼肌的结构和功能得以恢复。
目前已发现的矮小型鸡共有8种类型，其中由性连锁矮小型基因(dw)引起的矮小型鸡，因GHR基因缺失突变引起，在鸡的育种实践中具有广泛用途，主要是这一突变可使鸡的体重降低30％左右，具有体型变小、耗料减少、饲养成本降低等优点。因此，开展对GHR基因缺失突变引起的性连锁矮小鸡的骨骼肌生长、发育的遗传机制的研究具有重要的理论和实践意义。因此，需要对GHR缺失型矮小鸡的成肌细胞进行体外分离培养培养，以为矮小型鸡骨骼肌生长和发育的细胞生物学机制及分子机理研究提供技术和手段支持。
发明内容
本发明的目的是提供是鸡提供GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)取孵化至11天龄的GHR缺失型矮小鸡鸡胚，用75％的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒；沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开，取出鸡胚并保持胚体完整，将两侧腿部从胚体分离出来，置于含20％FBS的DMEM培养液中；
(2)剔除血管、脂肪，用洗涤液洗涤3次后，将肌肉组织剪碎后放入离心管中，离心后静置，分离后在离心管底部得到肌肉组织；
(3)将0.1％的胶原酶Ⅰ加入离心管中，消化30分钟；加入0.25％的胰酶，继续消化1小时，再加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化；
(4)使用200目筛过滤并收集滤液，离心后除去上清液，得到成肌细胞；
(5)加入含15％FBS的DMEM培养液使细胞重新悬浮，然后转移至培养皿中，置于细胞培养箱中培育；
(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90％时，除去原来的培养液后，用PBS溶液冲洗；加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1分钟，最后加入含血清的完全培养基终止消化；
(7)离心除去上清液后，加入含血清的完全培养基中，按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后，即得鸡GHR缺失型突变体成肌细胞。
优选地，步骤(2)中的洗涤液为pH 7.4的含双抗的PBS溶液。
优选地，步骤(2)中离心的转速为1000转/分钟，时间为1-2min。
优选地，步骤(3)中消化的温度为37℃
优选地，步骤(4)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。
优选地，步骤(6)中的PBS溶液含双抗且不含Ca2+和Mg2+。
优选地，步骤(7)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。
本发明的有益效果：本发明以GHR基因缺失型突变体矮小型鸡的鸡胚为材料，采用胶原酶和胰酶消化法和差速贴壁法进行GHR基因缺失型突变体矮小型鸡成肌细胞的分离培养，并采用免疫荧光法进行特异性鉴定，为鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养提供了一种新方法。
附图说明
图1是使用本发明的分离培养方法培养6小时时细胞的生长状态；
图2是本发明的使用本发明的分离培养方法培养48小时时细胞的生长状态；
图3是对分离培养的细胞进行细胞核染色后的显微镜图片；
图4是对分离培养的细胞中的肌肉特异表达蛋白进行免疫荧光标记后观察到的图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
以下实施例使用的主要材料的来源：
M199培养基，DMEM培养基购自美国Gibco公司；
胰蛋白酶、I型胶原酶购自美国Sigma公司；
胎牛血清(FBS)购买自美国life公司。
实施例1鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养
(1)取孵化至11天龄的GHR缺失型矮小鸡鸡胚，用75％的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒；沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开，取出鸡胚并保持胚体完整，将两侧腿部从胚体分离出来，置于含有20％FBS的DMEM培养液中；
(2)剔除血管、脂肪，用pH 7.4的含双抗的PBS溶液洗涤3次后，将肌肉组织剪碎并放入离心管中，在1000转/分钟转速下离心1min后静置，分离后在离心管底部得到肌肉组织；
(3)将0.1％的胶原酶Ⅰ加入离心管中，在37℃消化30分钟；然后加入0.25％的胰酶，继续消化1小时，最后加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化；
(4)使用200目筛过滤并收集滤液，在1000转/分钟转速下离心5min后除去上清液，得到成肌细胞；
(5)加入含15％FBS的DMEM培养液使细胞重新悬浮，然后转移至培养皿中，置于细胞培养箱中培育；
(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90％时，除去原来的培养液，用含双抗的无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液冲洗；然后加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1分钟，最后加入含血清的完全培养基终止消化；
(7)在1000转/分钟的转速下离心5min后除去上清液，加入含血清的完全培养基中，按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后，即得鸡GHR缺失型突变体成肌细胞。
由图1可以看出，经过6小时培养后细胞贴壁生长，大部分细胞呈梭形或纺锤形。其形态特征是细胞有两极、体积较小、胞核的折光性较强。由图2可以看出，经过48小时培养后细胞密度达到90％以上，增殖迅速，细胞形态呈现长梭型，并且平行排列，呈现规律性，细胞之间紧密相邻。
实施例2鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的鉴定
经过48h培养后，采用成肌细胞的特异标志DAPI、Desmin进行细胞免疫荧光鉴定。具体操作为：当观察到24孔培养板中的细胞生长密度达到90％以上时，用PBS清洗细胞2-3次，每次清洗时间为5分钟。然后除去PBS，再向24孔培养板中加入200～300μL 4％的多聚甲醛，在室温下固定20分钟。然后加入PBS清洗3次，每次清洗每5分钟。除去PBS，每孔加入1mL的1‰Triton破膜液，在室温下破膜15-20分钟，最后将破膜液吸干。然后，每孔加入200μL与二抗相同宿主的血清封闭液，室温下密封30分钟，再将封闭液除去，不用清洗，然后加入desmin或者MyHC一抗，放入4℃的冰箱中过夜，保持培养板平整。第2天取出培养板，用PBS清洗3次，每次清洗3分钟，接着往每个孔中加入经1：50稀释的FITC溶液，避光孵育1小时。用PBS清洗3次，每次清洗5分钟，再向每个孔中加入200μLDAPI，染核5分钟。最后使用PBS清洗3次，每次清洗5分钟。往载玻片上添加一滴GLYCEROL封片液，在荧光显微镜下观察并且拍照。
由图3可以看出，用DAPI对分离培养后的细胞核染色，可在荧光显微镜下管产道细胞核成蓝色。由图4可以看出，对分离培养的细胞中的肌肉特异表达蛋白进行免疫荧光标记后，可在荧光显微镜下观察到蓝色。染色的结果表明分离培养的是鸡GHR缺失型突变体的成肌细胞。

Claims (7)

1.一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取孵化至11天龄的GHR缺失型矮小鸡鸡胚，用75％的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒；沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开，取出鸡胚并保持胚体完整，将两侧腿部从胚体分离出来，置于含有20％FBS的DMEM培养液中；
(2)剔除血管、脂肪，用洗涤液洗涤3次后，将肌肉组织剪碎后放入离心管中，离心后静置，分离后在离心管底部得到肌肉组织；
(3)将0.1％的胶原酶Ⅰ加入离心管中，消化30分钟；加入0.25％的胰酶，继续消化1小时，再加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化；
(4)使用200目筛过滤并收集滤液，离心后除去上清液，得到成肌细胞；
(5)加入含15％FBS的DMEM培养液使细胞重新悬浮，然后转移至培养皿中，置于细胞培养箱中培育；
(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90％时，除去原来的培养液后，用PBS溶液冲洗；加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1分钟，最后加入含血清的完全培养基终止消化；
(7)离心除去上清液后，加入含血清的完全培养基中，按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后，即得鸡GHR缺失型突变体成肌细胞。
2.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中的洗涤液为pH 7.4的含双抗的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中离心的转速为1000转/分钟，时间为1-2min。
4.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中消化的温度为37℃。
5.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。
6.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(6)中的PBS溶液含双抗且不含Ca2+和Mg2+。
7.根据权利要求1所述的一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(7)中离心的转速为1000转/分钟，离心时间为5-7min后。
CN201710873595.5A 2017-09-25 2017-09-25 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法 Pending CN107460166A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710873595.5A CN107460166A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710873595.5A CN107460166A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107460166A true CN107460166A (zh) 2017-12-12

Family

ID=60553683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710873595.5A Pending CN107460166A (zh) 2017-09-25 2017-09-25 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107460166A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774630A (zh) * 2018-06-13 2018-11-09 中国科学院成都生物研究所 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
CN109337865A (zh) * 2018-12-11 2019-02-15 浙江大学 一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886060A (zh) * 2010-07-20 2010-11-17 东北农业大学 牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法
CN105505861A (zh) * 2015-12-29 2016-04-20 邬江 一种动物肌卫星细胞的分离培养技术
CN105886458A (zh) * 2016-06-07 2016-08-24 江苏省家禽科学研究所 一种机械法提取鸡胚成肌细胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886060A (zh) * 2010-07-20 2010-11-17 东北农业大学 牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法
CN105505861A (zh) * 2015-12-29 2016-04-20 邬江 一种动物肌卫星细胞的分离培养技术
CN105886458A (zh) * 2016-06-07 2016-08-24 江苏省家禽科学研究所 一种机械法提取鸡胚成肌细胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李方华等: "北京油鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及成肌诱导分化的研究", 《中国农业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108774630A (zh) * 2018-06-13 2018-11-09 中国科学院成都生物研究所 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
CN109337865A (zh) * 2018-12-11 2019-02-15 浙江大学 一种原代鸡成肌细胞培养试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hay et al. Secretion of collagen by corneal epithelium: I. Morphology of the collagenous products produced by isolated epithelia grown on frozen-killed lens
CN101818127B (zh) 一种小鼠精原干细胞分离培养方法
CN103930542A (zh) 棕色脂肪细胞组合物及方法
CN105543164A (zh) 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
CN102433296A (zh) 一种人气道上皮细胞的培养方法
CN106591224B (zh) 高纯度鸡前体肌内脂肪细胞的分离纯化及构建其与肌卫星细胞共培养体系的方法
CN105385650B (zh) 一种鱼类肠道上皮细胞的分离方法
CN110551689A (zh) 一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用
CN105483078A (zh) 一种鸡小肠上皮细胞的分离及原代培养方法
CN106011055A (zh) 一种高得率人原代软骨细胞制备方法
CN107779429A (zh) 一种人皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法
CN107460166A (zh) 一种鸡ghr缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
CN108251378A (zh) 一种过表达ptgds基因的间质干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN108486156A (zh) 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
CN113215083B (zh) 一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系
CN107858322B (zh) 一种海马原代细胞培养体系的建立方法
CN109402045A (zh) 一种水牛精原干细胞样细胞的体外培养及传代方法
Bhatia et al. Introduction to Pharmaceutical Biotechnology, Volume 3: Animal tissue culture and biopharmaceuticals
CN104928319B (zh) hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法
CN105936888B (zh) 人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法
WO2021012718A1 (zh) 用于牙髓再生的多能干细胞MDPSCs及其分离培养方法和应用
CN106635990A (zh) 一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法
CN106906177A (zh) 一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法
CN111925980A (zh) 一种鸡卵泡颗粒的体外培养方法
CN110331162A (zh) 一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171212