CN106011055A - 一种高得率人原代软骨细胞制备方法 - Google Patents

一种高得率人原代软骨细胞制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞体外培养领域，具体公开了一种高得率人原代软骨细胞制备方法。所述方法包括以下步骤：获取软骨组织，以眼科剪刀将软骨组织剪碎；加入胰酶消化，吸弃上清液；加入II型胶原酶消化过夜后，过滤，加入培养基终止消化，1000‑1500rpm离心5min，获取软骨细胞沉淀后种植于培养皿中培养，得到高得率人原代软骨细胞。本发明主要在于软骨组织块的剪碎和离心速度上进行改进。本发明通过将离心转速提高至1000‑1500rpm，既不至于破坏软骨细胞，又极大地提高了软骨细胞的得率。与传统的软骨细胞制备方法相比，本发明方法在软骨细胞的得率上提高了约3.55倍，且经实验验证所得软骨细胞有良好的细胞形态。

Description

一种高得率人原代软骨细胞制备方法
技术领域
本发明属于细胞体外培养领域，涉及一种人原代软骨细胞的制备方法，具体涉及一种高得率人原代软骨细胞制备方法。
背景技术
在机体中，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，在筛选防治骨关节炎药物时，需要在体外培养人原代软骨细胞。然而，通常人原代软骨细胞在体外培养经过3-4次传代后，细胞形态逐渐变得肥大，软骨细胞特异性基因II型胶原和蛋白多聚糖等表达丢失，因而其表型和体内软骨细胞表型差异较大，因此不适合用于科研研究需要。为保证药物筛选实验等科研研究的顺利开展，通常取传代1-3次的细胞进行实验，这就需要大量的软骨细胞。
传统的软骨细胞培养方法，一般包括以下步骤：取做膝关节置换手术病人的关节软骨，DPBS清洗干净，眼科剪刀剪碎成细小碎片，加入0.25％(m/v)胰酶于37℃消化30min，然后吸弃上清液，再加1mL的0.02％(m/v)II型胶原酶消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基终止消化，800rpm离心5min得软骨细胞沉淀，将软骨细胞培养于含10％(v/v)FBS高糖DMEM培养基中，置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养。
目前传统的人原代软骨细胞培养方法，存在软骨细胞得率不高的问题，因此研发一种高得率人原代软骨细胞制备方法很有必要。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种高得率原代软骨细胞的制备方法，该方法可以显著提高软骨细胞原代培养的效率。本发明通过改进关键的培养步骤，得到大量的软骨细胞。通过提高软骨细胞原代培养的得率，为研究骨关节炎的发病机制和筛选相关药物奠定了实验基础，提高了科研效率。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种高得率人原代软骨细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：取做膝关节置换手术病人的关节软骨，剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，然后放入盛有DPBS缓冲液的离心管中，振荡清洗数次，直至残留的血液漂洗干净；
步骤(2)：以眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm×1mm碎片；
步骤(3)：加入胰酶消化，吸弃上清液；然后加入0.02％(m/v)II型胶原酶，消化过夜后，细胞悬液过滤，加入含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基终止消化，1000-1500rpm离心5min，获取软骨细胞沉淀；
步骤(4)：将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基中，得到高得率人原代软骨细胞。
步骤(3)所述的加入胰酶消化是指加入0.25％(m/v)胰酶于37℃消化30min。
步骤(3)所述的过滤是指用100μm细胞滤网过滤。
步骤(3)所述的离心转速优选为1000rpm。
DPBS缓冲液为杜氏磷酸缓冲液，全称为：Dulbecco's Phosphate BufferedSaline。
步骤(3)所述的0.02％(m/v)II型胶原酶为不含FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基配制得到。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明主要在于软骨组织块的剪碎和离心速度上进行改进。特别强调用眼科剪将软骨剪碎成1mm×1mm的碎片，这样的大小更利于酶的消化。同时既往的研究中一般用800rpm的转速离心软骨细胞，但由于软骨细胞消化后，在一定较高浓度的软骨基质中，常规的离心方法不容易使其沉淀，往往所得沉淀极少，因此本发明通过增加离心转速(将离心转速提高至1000-1500rpm)，这样的离心转速既不至于破坏软骨细胞，又极大地提高了软骨细胞的得率。
与传统的软骨细胞制备方法相比，本发明方法在软骨细胞的得率上提高了约3.55倍(参见本发明的表1)，且经实验验证所得软骨细胞有良好的细胞形态。
附图说明
图1为本发明实施例1中制得的原代软骨细胞的光镜示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
在该实施例1中基于实施过程需要，实施中使用的仪器设备以下:
HH-6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)、Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)、3K30型冷冻高速离心机(德国Sigma公司)、5450型小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、Class II Type B2型生物安全柜(新加坡Esco公司)、CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)、Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国Nexcelom公司)、DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。
实施过程按以下步骤进行：
经伦理委员会同意及患者知情，取关节置换患者膝关节软骨组织作为培养的软骨细胞；将获取的软骨组织称重，再放入DPBS缓冲液中(15mL离心管)振荡清洗3次，然后倒入10cm的培养皿中，以眼科剪刀将软骨组织切成1mm×1mm大小后加入0.25％(m/v)胰酶于37℃消化30min，吸弃上清液，然后加入0.02％(m/v)II型胶原酶于37℃、5％(v/v)CO2培养箱内消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Gibco公司，高糖DMEM培养基也购自Gibco公司)中，24h后，光镜下可见细胞均贴壁，长势良好。然后，用0.25％(m/v)胰酶将软骨细胞消化，运用细胞计数仪进行计数。
实施例2
在该实施例中基于实施过程需要，实施中使用的仪器设备以下:
HH-6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)、Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)、3K30型冷冻高速离心机(德国Sigma公司)、5450型小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、Class II Type B2型生物安全柜(新加坡Esco公司)、CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)、Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国Nexcelom公司)、DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。
实施过程按以下步骤进行：
经伦理委员会同意及患者知情，取关节置换患者膝关节软骨组织作为培养的软骨细胞；将获取的软骨组织于DPBS缓冲液中(15mL离心管)振荡清洗3次，然后倒入10cm的培养皿中，以眼科剪刀将软骨组织切成1mm×1mm大小后加入0.25％(m/v)胰酶消化30min，然后吸弃上清液，加入0.02％(m/v)II型胶原酶于37℃，5％(v/v)CO2培养箱内消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基终止消化，1200rpm离心5min，弃上清，将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Gibco公司，高糖DMEM培养基也购自Gibco公司)中，24h后，光镜下可见细胞均贴壁，长势良好。然后，用0.25％(m/v)胰酶将软骨细胞消化，运用细胞计数仪进行计数。
实施例3
在该实施例中基于实施过程需要，实施中使用的仪器设备以下:
HH-6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)、Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)、3K30型冷冻高速离心机(德国Sigma公司)、5450型小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、Class II Type B2型生物安全柜(新加坡Esco公司)、CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)、Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国Nexcelom公司)、DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)。
实施过程按以下步骤进行：
经伦理委员会同意及患者知情，取关节置换患者膝关节软骨组织作为培养的软骨细胞；将获取的软骨组织于DPBS缓冲液中(15mL离心管)振荡清洗3次，然后倒入10cm的培养皿中，以眼科剪刀将软骨组织切成1mm×1mm大小后加入0.25％(m/v)胰酶消化30min，然后吸弃上清液，加入0.02％(m/v)II型胶原酶于37℃，5％(v/v)CO2培养箱内消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基终止消化，1500rpm离心5min，弃上清，将软骨细胞沉淀分别种植于6-8个10cm直径的培养皿，约70％-80％的密度，培养于含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM高糖培养基(FBS为胎牛血清，购自Gibco公司，高糖DMEM培养基也购自Gibco公司)中，24h后，光镜下可见细胞均贴壁，长势良好。然后，用0.25％(m/v)胰酶将软骨细胞消化，运用细胞计数仪进行计数。
实施例4
传统方法培养软骨细胞：包括以下步骤：
取做膝关节置换手术病人的关节软骨，DPBS清洗干净，眼科剪刀剪碎成细小碎片，加入0.25％(m/v)胰酶于37℃消化30min，然后吸弃上清液，再加1mL的0.02％(m/v)II型胶原酶消化过夜，消化后将细胞悬液用100μm细胞滤网过滤，加入含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基终止消化，800rpm离心5min细胞培养于含10％(v/v)胎牛血清高糖DMEM培养基中，置于37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养。
以下表1为分别采用传统方法和本发明方法(实施例1，2和3)进行三次细胞制备实验后获得的软骨细胞得率。体外培养人膝关节软骨细胞，以每克软骨组织，体外分离培养24h，经过0.25％(m/v)胰酶消化后所获得的细胞数量作为软骨细胞得率来进行计算比较。结果表明本发明方法(实施例1)的细胞得率是传统方法细胞得率的约3.55倍(4.08×106/1.15×106)。
表1实施例1，2，3和传统方法的软骨细胞得率
方法 第一次细胞数量 第二次细胞数量 第三次细胞数量 细胞平均数量
传统方法 1.25×106个/g软骨 1.06×106个/g软骨 1.13×106个/g软骨 1.15×106个/g软骨
实施例1 4.04×106个/g软骨 4.12×106个/g软骨 4.09×106个/g软骨 4.08×106个/g软骨
实施例2 4.00×106个/g软骨 4.09×106个/g软骨 4.02×106个/g软骨 4.04×106个/g软骨
实施例3 4.04×106个/g软骨 4.08×106个/g软骨 4.06×106个/g软骨 4.06×106个/g软骨
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高得率人原代软骨细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：取做膝关节置换手术病人的关节软骨，剔除干净软组织，剩余透明的软骨组织，然后放入盛有DPBS缓冲液的离心管中，振荡清洗，直至残留的血液漂洗干净；
步骤(2)：以眼科剪刀将软骨组织剪碎成1mm×1mm碎片；
步骤(3)：加入胰酶消化，吸弃上清液；然后加入0.02％(m/v)II型胶原酶，消化过夜后，细胞悬液过滤，加入含10％(v/v)FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基终止消化，1000-1500rpm离心5min，获取软骨细胞沉淀；
步骤(4)：将软骨细胞沉淀种植于培养皿中，培养于含10％(v/v)FBS的高糖DMEM培养基中，得到高得率人原代软骨细胞。
2.根据权利要求1所述的高得率人原代软骨细胞制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的0.02％(m/v)II型胶原酶为不含FBS的高糖DMEM培养基配制得到。
3.根据权利要求1所述的高得率人原代软骨细胞制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的加入胰酶消化是指加入0.25％(m/v)胰酶于37℃消化30min。
4.根据权利要求1所述的高得率人原代软骨细胞制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的过滤是指用100μm细胞滤网过滤。
5.根据权利要求1所述的高得率人原代软骨细胞制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心转速为1000rpm。
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