CN104498433A - 一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用。本发明所述提取方法先采集人脂肪组织，用生理盐水清洗；然后机械破碎清洗后的脂肪组织，加入质量终浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶混合酶液混匀，恒温下摇床培养，培养后离心弃上清液，获得沉淀；最后向沉淀中加入生理盐水清洗、过滤、离心去上清，获得所述脂肪干细胞。本发明调整了复合胶原酶的组合形式及其配比和用量，同时以生理盐水作为整个提取方案中的辅助试剂，从脂肪组织的清洗到最终的脂肪干细胞的获得整体进行了工艺优化，使得最终提取的脂肪干细胞数量高、存活率高、活性高，成本较低，能够广泛用于脂肪干细胞制剂的制备中以及整形美容中。

Description

一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。

脂肪组织移植目前已经广泛应用在头面部整形、隆乳术、隆臀术等多种整形手术中，具有无刀口、无免疫排斥反应、形态真实、手感自然等优点。但临床实践证明，移植脂肪存在不可预知的吸收率(20％-90％)，具有移植脂肪成活率低，需要多次移植的问题；并且还可能出现移植脂肪液化、坏死；此外，坏死的脂肪颗粒还可能引起囊性纤维化和假性囊肿。为了避免上述现象的出现，降低脂肪组织自体吸收、提高自体脂肪移植后的存活率显得尤为重要。2006年，Yoshimura提出了细胞辅助脂肪移植(cell-assisted lipotransfer,CAL)的细胞疗法的新观念。ADSCs在体内环境下能够分化为成熟脂肪细胞,促进宿主干细胞向受区的定向迁移，部分分化形成新生血管内皮细胞，有助于移植脂肪组织早期血供的建立。

中国专利CN103667187A公开了一种人脂肪干细胞分离培养方法和干细胞库的构建方法，其中涉及采用D-Hanks平衡盐液、Ⅰ型胶原酶和Ⅵ型胶原酶进行分离提取脂肪干细胞的技术方案，但是采用该方案所提取的脂肪干细胞数量较少、且提取的脂肪干细胞成活率较低、活性较差。此外，由于该方案需要采用D-Hanks平衡盐液，无形中增加了脂肪干细胞大规模提取的成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用，使得所述提取方法能够显著提高脂肪干细胞数量、成活率和活性；

本发明的另一个目的在于提供一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用，使得由所述提取方法提取的脂肪干细胞制成的制剂回填后脂肪存活率显著提高；

本发明的另一个目的在于提供一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用，使得所述制剂应用于美容整形中。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种脂肪干细胞的提取方法，包括：

步骤1、采集人脂肪组织，用生理盐水清洗；

步骤2、机械破碎清洗后的脂肪组织，加入质量终浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶混合酶液混匀，恒温下摇床培养，培养后离心弃上清液，获得沉淀，所述混合酶液以生理盐水为溶剂配制；；

步骤3、向沉淀中加入生理盐水清洗、过滤、离心去上清，获得所述脂肪干细胞。

针对现有技术中的提取方法出现的脂肪干细胞数量较少、且提取的脂肪干细胞成活率较低、活性较差、成本高的问题，本发明优化整个提取工艺，在此基础上调整复合酶的用量和组成，弥补了现有技术的缺陷。

其中，作为优选，所述Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶质量比为1:1。

作为优选，步骤1具体为：

步骤1.1、采集人脂肪组织，待其中的肿胀液与脂肪组织自然分层后吸弃下方液体，加入等体积的生理盐水至脂肪组织中，反复摇晃脂肪组织后静置1-5min，吸弃下方溶液；

步骤1.2、再次加入等体积的生理盐水，500～800g离心力离心3-5min，吸弃上层脂肪油层。

作为优选，步骤3具体为：

步骤3.1、向沉淀中加入30-50mL生理盐水重悬细胞，500～800g离心力离心3-5min，弃上清液；

步骤3.2、用5-10mL生理盐水重悬沉淀，过滤细胞悬液至新的容器中，补加5-10mL生理盐水，500～800g离心力离心5-10min，弃去上清液，获得所述脂肪干细胞。

作为优选，所述恒温为37℃。

作为优选，所述摇床培养的转速为100～200r/min，时间为30-50min。

作为优选，步骤2所述离心以500～800g离心力离心5-10min。

按照本发明所述提取方法提取的脂肪干细胞在脂肪干细胞数量、成活率和活性方面，与现有专利技术CN103667187A说明书第2页0016-0017段记载的提取方案相比具有显著的提高。

因此，本发明还提供了一种脂肪干细胞制剂，包括本发明所述提取方法制备的脂肪干细胞和脂肪组织，所述脂肪干细胞和脂肪组织的的体积比为1:10-30；更优选地，体积比为1:20。

作为优选，所述脂肪组织选用脂肪干细胞自体脂肪组织，所述自体脂肪组织可以在本发明所述提取方法的步骤1时取部分清洗好的脂肪组织作为自体脂肪组织备用。

以专利技术CN103667187A说明书第2页0016-0017段记载的提取方案提取的脂肪干细胞为对照，同样和脂肪组织一同制成对照的制剂，与本发明所述制剂进行脂肪存活率的对比，结果显示，本发明制剂回填后的脂肪成活率高达82.51％，而对照制剂回填后的脂肪存活率为63.33％，明显低于本发明制剂的效果。本发明所述回填属于美容整形领域术语，指将脂肪干细胞制剂注射进需要美容整形的人体部位。

基于此，本发明还提供了所述脂肪干细胞制剂在美容整形中的应用。

作为优选，所述美容整形为头面部整形、隆乳整形、隆臀整形。

由以上技术方案可知，本发明调整了复合胶原酶的组合形式及其配比和用量，同时以生理盐水作为整个提取方案中的辅助试剂，从脂肪组织的清洗到最终的脂肪干细胞的获得整体进行了工艺优化，使得最终提取的脂肪干细胞数量高、存活率高、活性高，成本较低，能够广泛用于脂肪干细胞制剂的制备中以及整形美容中。

附图说明

图1所示为实施例2提取的脂肪干细胞培养3天时的镜检图；

图2所示为实施例1提取的脂肪干细胞培养3天时的镜检图；

图3所示为实施例2提取的脂肪干细胞培养3天时的细胞直径统计图；

其中，纵坐标以及柱形上的数字表示细胞数量，横坐标表示细胞直径，单位μm；

图4所示为实施例1提取的脂肪干细胞培养3天时的细胞直径统计图；

其中，纵坐标以及柱形上的数字表示细胞数量，横坐标表示细胞直径，单位μm；

图5所示为实施例5和实施例6制备的制剂对脂肪成活率影响的柱形图，纵坐标为脂肪成活率。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种脂肪干细胞的提取方法以及制剂和应用进行详细说明。

实施例1：本发明所述提取方法

采集人脂肪组织，待其中的肿胀液与脂肪组织自然分层后吸弃下方液体，加入等体积的生理盐水至脂肪组织中，反复摇晃脂肪组织后静置1-5min，吸弃下方溶液；

再次加入等体积的生理盐水，500～800g离心力离心3-5min，吸弃上层脂肪油层；

机械破碎清洗后的脂肪组织，加入质量终浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶混合酶液混匀，37℃恒温下以转速为100～200r/min摇床培养30-50min，培养后500～800g离心力离心5-10min，弃上清液，获得沉淀；

向沉淀中加入30-50mL生理盐水重悬细胞，500～800g离心力离心3-5min，弃上清液；

用5-10mL生理盐水重悬沉淀，过滤细胞悬液至新的容器中，补加5-10mL生理盐水，500～800g离心力离心5-10min，弃去上清液，获得所述脂肪干细胞。

实施例2：对照提取方案

以专利技术CN103667187A说明书第2页0016-0017段记载的提取方案为对照方法：

采集人脂肪组织；

获取和分离人脂肪干细胞：取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成1-2mm3大小组织块，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2-0.4％(m/v)混合胶原酶，在37℃温度条件下均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中以1600-1800转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5-10分钟，弃上清液，获得干细胞。

实施例3：脂肪干细胞数量对比

从志愿者身体抽脂，分别按照实施例1和实施例2的方法，提取脂肪干细胞，重复3次，每次进行5个样本的提取，统计细胞数量以及成活率，结果见表1。

表1 脂肪干细胞数量对比

由表1可知，采用实施例1方法所分离出来的ADSCs数量明显高于采用实施例2方法分离出来的ADSCs数量。两个提取方法均进行了三次重复试，组内间的数值相近，说明了两个提取方法的分离提取方法稳定。但是，本发明的提取数量明显高于现有方法，其数量值约为现有方法的3倍。

同时，采用实施例1方法所分离出来的ADSCs成活率明显高于采用实施例2方法分离出来的ADSCs成活率。两个提取方法均进行了三次重复试，组内间的数值相近，说明了两个提取方法对ADSCs的成活率影响相对稳定。但是，本发明的ADSCs的成活率明显高于对照组，其成活率约高于现有方法15％-17％。

实施例4：脂肪干细胞活性对比

将按照实施例1和实施例2两个方法提取的脂肪干细胞分别以相同接种量接种至无血清培养基(含有10％FBS的DMEM/F12)中在相同的环境下培养3天，然后镜检观察细胞形态和直径，以此判断细胞的活性大小，结果见图1-4。

由图1和图2可以看出，实施例2所获得的ADSCs形态梭型少分枝状、体积较大；细胞增殖速度较慢，培养至第3天，细胞仍没有融合。实施例1所获取的ADSCs形态为长梭型，体积较小；细胞的增殖速度快，在培养至第3天时，细胞已融合成片状，并出现漩涡状。

由图3和图4可以看出，实施例2所获得的ADSCs在培养至第3天时，其体积直径分布在20-28μm，明显高于正常ADSCs的直径范围16-22μm，说明实施例2提取的ADSCs培养后细胞体积增大，细胞状态下降。本发明所获取的ADSCs在培养至第3天时，其体积直径分布在16-22μm，符合正常ADSCs的直径范围(16-22μm)，说明了本发明的提取方法提取的ADSCs活性较好。

实施例5：本发明所述脂肪干细胞制剂

以实施例1提取的ADSCs为原料，按照ADSCs：脂肪组织体积比例(1:20)，用生理盐水重悬ADSCs，吹打均匀后形成悬液，把细胞悬液和填充脂肪组织分别转移至注射器中，把装细胞悬液和填充脂肪的注射器连接到三通管上，来回推挤直至充分混匀，形成制剂。

实施例6：对照脂肪干细胞制剂

以实施例2提取的ADSCs为原料，按照ADSCs：脂肪组织(来源同实施例5)体积比例(1:20)，用和实施例5等量的生理盐水重悬ADSCs，吹打均匀后形成悬液，把细胞悬液和填充脂肪组织分别转移至注射器中，把装细胞悬液和填充脂肪的注射器连接到三通管上，来回推挤直至充分混匀，形成制剂。

实施例7：脂肪干细胞制剂对脂肪成活率影响

将实施例5(样品组)和实施例6(对照组)制成的制剂以及纯脂肪组织制剂分别回填至3名体质无显著差异的志愿者的身体同一部位，回填后90天时检测其中的脂肪成活率，结果见图5。

从图5可知，纯脂肪组织制剂的存活率约为51.26％；实施例2制成的对照组制剂其存活率为63.33％；本发明制成的样品组制剂其存活率为82.51％；该结果说明了本发明所述脂肪干细胞制剂能大大的提高回填脂肪的存活率。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，包括：

步骤1、采集人脂肪组织，用生理盐水清洗；

步骤2、机械破碎清洗后的脂肪组织，加入质量终浓度为0.25％的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶混合酶液混匀，恒温下摇床培养，培养后离心弃上清液，获得沉淀，所述混合酶液以生理盐水为溶剂配制；

步骤3、向沉淀中加入生理盐水清洗、过滤、离心去上清，获得所述脂肪干细胞。

2.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶质量比为1:1。

3.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤1具体为：

步骤1.1、采集人脂肪组织，待其中的肿胀液与脂肪组织自然分层后吸弃下方液体，加入等体积的生理盐水至脂肪组织中，反复摇晃脂肪组织后静置1-5min，吸弃下方溶液；

步骤1.2、再次加入等体积的生理盐水，500～800g离心力离心3-5min，吸弃上层脂肪油层。

4.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤3具体为：

步骤3.1、向沉淀中加入30-50mL生理盐水重悬细胞，500～800g离心力离心3-5min，弃上清液；

步骤3.2、用5-10mL生理盐水重悬沉淀，过滤细胞悬液至新的容器中，补加5-10mL生理盐水，500～800g离心力离心5-10min，弃去上清液，获得所述脂肪干细胞。

5.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述恒温为37℃。

6.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，所述摇床培养的转速为100～200r/min，时间为30-50min。

7.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤2所述离心以500～800g离心力离心5-10min。

8.一种脂肪干细胞制剂，其特征在于，包括权利要求1-7任意一项所述制备方法制备的脂肪干细胞和脂肪组织，所述脂肪干细胞和脂肪组织的的体积比为1:10-30。

9.权利要求8所述脂肪干细胞制剂在美容整形中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述美容整形为头面部整形、隆乳整形、隆臀整形。