CN112574947A - 一种软骨细胞的体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种软骨细胞的体外培养方法，包括以下步骤：关节表面削下软骨组织片，在添加了双抗的PBS中，反复清洗；将清洗过后的软骨组织置于培养基中，将软骨组织切成碎片，再用含双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织；收集切碎的软骨组织离心，加入消化液，消化；离心收集细胞，加入PBS清洗细胞，在细胞团中加入培养液制成细胞悬液，计数细胞，调节细胞密度；接种，加入FBS的低糖DMEM培养基，再放置于饱和湿度培养箱中培养；细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代培养。本申请最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足，以该方法培养获得的乳腺上皮细胞比传统实验室方法获得的细胞活力更高，数量更多、更易贴壁。

Description

一种软骨细胞的体外培养方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种软骨细胞的体外培养方法。
背景技术
骨关节炎是一种慢性退行性骨关节病，多发于老年人，大部分以膝关节退变为主，其中软骨细胞的死亡又是软骨退行性病变的关键。关节软骨是一种白色的高密度结缔组织，连接着关节，充当接头的承重材料，具有良好的摩擦、润滑和磨损特点。由于关节软骨周围缺乏淋巴、血管、神经，其周围软骨细胞不能迅速增殖，软骨损伤后不能自我修复，软骨细胞埋藏在软骨间质内，它所存在的部位为一小腔，称为软骨陷窝，广泛存在于关节结缔组织中，但软骨细胞在体外通过相对适宜的环境可迅速增殖、分泌细胞外基质，为修复损伤的软骨提供原材料。
由于软骨细胞和软骨属于增殖能力极弱的终末未分化细胞，缺乏再生能力，所以自身修复甚为困难。传统的自体软骨移植术和异体软骨移植可取得一定的治疗效果，但由于软骨来源及数量有限，难以满足修复损伤软骨，就目前而言，利用体外软骨细胞培养修复损伤软骨越来越受到青睐。
软骨细胞作为软骨组织中唯一细胞成分，是软骨组织移植工程中一个重要来源，是体外软骨细胞移植术的关键，所以软骨细胞的取材和培养相当重要，但目前对软骨细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高软骨细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种软骨细胞的体外培养方法，培养速度快，耗时短，操作简单，细胞活率高，细胞形态整齐、增殖旺盛，为科研领域提供一种全新的培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种软骨细胞的体外培养方法，包括以下步骤：
步骤(1)、清洗关节组织后，从关节表面削下软骨组织片，在添加了双抗的PBS中，反复清洗至无明显的血红色、污渍以及可能误带的滑膜组织；
步骤(2)、将清洗过后的软骨组织置于培养基(可以为基础培养基)中，然后在培养基中用镊子和十字刀片将软骨组织切成碎片，再用含双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织；
步骤(3)、收集切碎的软骨组织离心，弃上清，加入消化液，培养箱中静置过夜或采用分阶段消化，直至软骨组织基本消失，溶液变得混沌为止；
步骤(4)、离心收集细胞，加入PBS清洗细胞，在细胞团中加入培养液制成细胞悬液，计数细胞，调节细胞密度；
步骤(5)、接种，加入FBS的低糖DMEM培养基，再放置于饱和湿度培养箱中培养；
步骤(6)、细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代，消化，传代培养；
所述步骤(1)-步骤(6)按照顺序依次进行。
优选的是，步骤(1)的PBS中添加了3-5％双抗，清洗3-5次。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)的PBS中添加3％双抗。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)的PBS中添加4％双抗。
上述任一方案中优选的是，步骤(1)的PBS中添加5％双抗。
上述任一方案中优选的是，步骤(2)中在培养基中用镊子和十字刀片将软骨组织切成小于1mm3大小碎片，再用含3-5％双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中分阶段消化，即每消化1h就用40μm细胞滤网过滤，离心一次，将分离后的软骨细胞放入培养液中保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织片消化完全。
上述任一方案中优选的是，步骤(3)中收集切碎的软骨组织500r/min离心5分钟，弃上清，按组织块与消化液的体积比例为1：10的量加入消化液，放置于37℃的培养箱中静置过夜，期间可予移液枪吹打软骨3-5次。
上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，以1500r/min离心10min收集细胞，弃上清，加入PBS清洗细胞，清洗2次，以除去消化液的残留以及部分细胞碎片。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，以1*105-1*106个/ml的密度接种，放置于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，加入含9-11％FBS的低糖DMEM培养基。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，加入含9％FBS的低糖DMEM培养基。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，加入含10％FBS的低糖DMEM培养基。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，加入含11％FBS的低糖DMEM培养基。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，低糖DMEM培养基为DMEM/Ham’12 1:1培养基，内包括8-12％FBS，0.8-1.2％双抗，1.5-2.5mmol/L谷氨酰胺，40-60mg/L抗坏血酸。含丰富营养液的Ham’S F12培养基和含丰富维生素的DMEM培养基的1：1混合物，用于滋养软骨细胞的生长。
FBS的作用：提供对维持细胞指数生长的激素。提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。起酸碱度缓冲液作用。提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
双抗即青霉素和链霉素属广谱抗生素，抗菌谱宽。青霉素阻碍细胞壁合成，导致细胞泄漏；链霉素作用于核糖体，阻碍蛋白翻译。自然环境下，对青霉素不敏感的微生物绝大多数对链霉素敏感，反之亦然。因此两种抗生素搭配可以控制几乎全部常见细菌。
谷氨酰胺在细胞培养中是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，参与蛋白质的合成和核酸代谢。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，低糖DMEM培养基内包括8％FBS，0.8％双抗，1.5mmol/L谷氨酰胺，40mg/L抗坏血酸。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，低糖DMEM培养基内包括10％FBS，1％双抗，2mmol/L谷氨酰胺，50mg/L抗坏血酸。
上述任一方案中优选的是，步骤(5)中，低糖DMEM培养基内包括12％FBS，1.2％双抗，2.5mmol/L谷氨酰胺，60mg/L抗坏血酸。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代，去除培养液，用PBS清洗3次后，用质量分数为0.1-0.15％胰蛋白酶消化，按1∶2比例进行传代培养。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，用质量分数为0.1胰蛋白酶消化。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，用质量分数为0.125％胰蛋白酶消化。
上述任一方案中优选的是，步骤(6)中，用质量分数为0.15％胰蛋白酶消化。
上述任一方案中优选的是，原代消化液中含有0.1-0.15％胰蛋白酶，0.15-0.25％胶原酶II，传代消化液中含有0.1-0.15％胰蛋白酶，0.015-0.025％EDTA。
上述任一方案中优选的是，原代消化液中含有0.1％胰蛋白酶，0.15％胶原酶II，传代消化液中含有0.1％胰蛋白酶，0.015％EDTA。
上述任一方案中优选的是，原代消化液中含有0.125％胰蛋白酶，0.2％胶原酶II，传代消化液中含有0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA。
上述任一方案中优选的是，原代消化液中含有0.15％胰蛋白酶，0.25％胶原酶II，传代消化液中含有0.15％胰蛋白酶，0.025％EDTA。
本申请的软骨细胞的体外培养方法，缩短分离时间、减少污染以及对细胞的损伤，对提取细胞使用的酶、培养细胞的方法、培养基等进行优化，最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足，以该方法培养获得的软骨细胞比传统实验室方法获得的细胞活力更高，数量更多，可传代性更强，分化率更高，且培养方法，方法简单，方便操作，省时省力。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例1
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种软骨细胞的体外培养方法，样本可以选用猪或牛，本实施例选用猪，包括如下步骤：
(1).严格按照无菌要求，彻底清洗关节组织。
(2).用手术刀小心从猪关节表面削下软骨组织片，稍后在添加了双抗的PBS中。反复清洗除去软骨表面的血液，用添加了3-5％双抗的PBS清洗3-5次，至无明显的血红色，污渍以及可能误带的滑膜组织。新鲜软骨呈乳白浅蓝色，半透明状，略带弹性。
(3).将清洗过后的软骨组织置于培养基中，然后在培养基中用镊子和十字刀片将软骨组织切成约1mm3大小碎片；再用含3-5％双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织；
(4).收集切碎的软骨组织500r/min离心5分钟，弃上清，按组织块与消化液的体积比例为1：10的量加入消化液，放置于37℃的培养箱中静置过夜；期间可予移液枪吹打软骨3-5次，使消化下的软骨细胞脱离软骨组织，并使软骨组织与消化液混匀，直至软骨组织基本消失；溶液变得混沌为止。或采用分阶段消化，即每消化1h就40um细胞滤网过滤，离心一次，将分离后的软骨细胞放入培养液种保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织片消化完全。
(5).以1500r/min离心10min收集细胞。弃上清，加入PBS清洗细胞，1500r/min离心10min，收集细胞，清洗2次，以除去消化液的残留以及部分细胞碎片，在细胞团中加入培养液制成细胞悬液，计数细胞，调节细胞密度。
(6).以1*105-1*106个/ml的密度接种，加入含10％FBS的低糖DMEM培养基进行培养，生长培养基为：DMEM/Ham’12(1:1),10％FBS，1％双抗，2mmol/L谷氨酰胺，50mg/L抗坏血酸；再放置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。
(7).细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代，去除培养液，用PBS清洗3次后，用质量分数为0.125％胰蛋白酶消化，按1∶2比例进行传代培养。
本实施例采用的原代消化液：0.125％胰蛋白酶，0.2％胶原酶II，传代消化液：0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA
实施例2：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(4)中采用分阶段消化，即每消化1h就用40μm细胞滤网过滤，离心一次，将分离后的软骨细胞放入培养液中保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织片消化完全。
实施例3：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，加入含9％FBS的低糖DMEM培养基进行培养。
细胞活率检测
采用实验室常规传统台盼蓝法测定细胞活率。采用步骤(7)中的去除培养液的细胞液，离心重悬后，吸取少量细胞悬液与台盼蓝以9：1进行混合，在3min内用细胞计数板分别计算染色与未染色细胞数。
细胞活率＝未染色细胞数/细胞总数×100％
实验结果，先后四次取平均值，根据公式得出实施例1-3的平均值为98.46％、95.52％、90.21％，细胞活率较高，其中实施例1的培养方法所获得的细胞活率最高。
实施例4：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，加入含11％FBS的低糖DMEM培养基进行培养。
实施例5：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，低糖DMEM培养基内包括8％FBS，0.8％双抗，1.5mmol/L谷氨酰胺，40mg/L抗坏血酸。
实施例6：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(6)中，低糖DMEM培养基内包括12％FBS，1.2％双抗，2.5mmol/L谷氨酰胺，60mg/L抗坏血酸。
实施例7：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(7)中，用质量分数为0.1％胰蛋白酶消化。
实施例8：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(7)中，用质量分数为0.15％胰蛋白酶消化。
实施例9：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(7)中，原代消化液中含有0.1％胰蛋白酶，0.15％胶原酶II，传代消化液中含有0.1％胰蛋白酶，0.015％EDTA。
实施例10：
一种软骨细胞的体外培养方法，和实施例1相似，不同的是，步骤(7)中，原代消化液中含有0.15％胰蛋白酶，0.25％胶原酶II，传代消化液中含有0.15％胰蛋白酶，0.025％EDTA
其中，对实施例3～10培养的表皮干细胞进行检测，结果表明采用本申请的培养方法培养的表皮干细胞，细胞活力较高，数量多，其中实施例1的培养方法所获得的细胞活率最高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、清洗关节组织后，从关节表面削下软骨组织片，在添加了双抗的PBS中，反复清洗至无明显的血红色、污渍以及可能误带的滑膜组织；
步骤(2)、将清洗过后的软骨组织置于培养基中，然后在培养基中用镊子和十字刀片将软骨组织切成碎片，再用含双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织；
步骤(3)、收集切碎的软骨组织离心，弃上清，加入消化液，培养箱中静置过夜或采用分阶段消化，直至软骨组织基本消失，溶液变得混沌为止；
步骤(4)、离心收集细胞，加入PBS清洗细胞，在细胞团中加入培养液制成细胞悬液，计数细胞，调节细胞密度；
步骤(5)、接种，加入FBS的低糖DMEM培养基，再放置于饱和湿度培养箱中培养；
步骤(6)、细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代，消化，传代培养；
所述步骤(1)-步骤(6)按照顺序依次进行。
2.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(1)的PBS中添加了3％-5％双抗，清洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(2)中在培养基中用镊子和十字刀片将软骨组织切成小于1mm3大小碎片，再用含3-5％双抗的PBS充分冲洗切碎的软骨组织。
4.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(3)中分阶段消化，即每消化1h就用40μm细胞滤网过滤，离心一次，将分离后的软骨细胞放入培养液中保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织片消化完全。
5.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(3)中收集切碎的软骨组织500r/min离心5分钟，弃上清，按组织块与消化液的体积比例为1：10的量加入消化液，放置于37℃的培养箱中静置过夜，期间可予移液枪吹打软骨3-5次。
6.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(4)中，以1500r/min离心10min收集细胞，弃上清，加入PBS清洗细胞，清洗2次，以除去消化液的残留以及部分细胞碎片。
7.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(5)中，以1*105-1*106个/ml的密度接种，放置于37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。
8.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(5)中，加入含9％-11％FBS的低糖DMEM培养基。
9.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤(6)中，细胞融合并覆盖瓶底80％～90％时，即可传代，去除培养液，用PBS清洗3次后，用质量分数为0.1-0.15％胰蛋白酶消化，按1∶2比例进行传代培养。
10.根据权利要求1所述的一种软骨细胞的体外培养方法，其特征在于，原代消化液中含有0.1％-0.15％胰蛋白酶，0.15％-0.25％胶原酶II，传代消化液中含有0.1％-0.15％胰蛋白酶，0.015％-0.025％EDTA。
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