KR20160058721A - 중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편의 조합 방법, 및 조합된 중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편 제품 - Google Patents

중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편의 조합 방법, 및 조합된 중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편 제품 Download PDF

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mesenchymal stem
cartilage
allograft
adipose tissue
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시몬 보그단스키
얄링 쉬
브렌트 앳킨슨
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알로소스
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Abstract

중간엽 줄기세포(MSC)의 골연골 동종이식편, 연골 동종이식편, 조각화된 연골 동종이식편, 또는 탈세포화된, 조각화된 연골 동종이식편과의 조합 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 방법은 MSC 및 원치않는 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 동종이식편에 접종하는 단계를 포함한다.

Description

중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편의 조합 방법, 및 조합된 중간엽 줄기세포 및 연골 함유 동종이식편 제품{METHODS OF COMBINING MESENCHYMAL STEM CELLS AND CARTILAGE CONTAINING ALLOGRAFTS, AND PRODUCTS OF COMBINED MESENCHYMAL STEM CELLS AND CARTILAGE CONTAINING ALLOGRAFTS}
재생 의학은 현장에서 용이하게 입수 가능한 인간 성체 줄기세포의 풍부한 출처를 요한다.
대량으로 얻을 수 있는 지방-유래 줄기세포(ASC)는 조직 공학 전략에서 골 형성의 도입을 위해 세포 치료법으로 사용되어 왔다.
동종이식편은 줄기세포와 조합될 수 있다. 이는 동종이식편 기질 접종 전 현저한 양의 조직 처리 및 세포 처리를 요한다.
생세포가 접종된 동종이식편은 더 나은 수술적 결과를 일반적으로 제공한다.
한 실시태양에서, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 제공하는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액, 예를 들어, 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포의 이종 집단을 포함하는 기질 혈관 분획을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 골연골 동종이식편의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 접종된 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계에 의해 제조되는, 동종이식편 제품이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 제공하는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포의 이종 집단을 포함하는 기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 골연골 동종이식편의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 접종된 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하고, 상기 소화시키는 단계가 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계; 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계; 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계; 기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계에 의해 제조되고, 상기 소화시키는 단계가 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계; 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계; 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는, 동종이식편 제품이 제공된다.
한 실시태양에서, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 제공하는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액, 예를 들어, 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포의 이종 집단을 포함하는 기질 혈관 분획을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액(예를 들어, 기질 혈관 분획)을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 탈세포화된, 조각화된 연골의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액(예를 들어, 기질 혈관 분획)을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 탈세포화된, 조각화된 연골의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계에 의해 제조되는, 동종이식편 제품이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 제공하는 단계; 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포의 이종 집단을 포함하는 기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계를 포함하고, 상기 소화시키는 단계가 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계; 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계; 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법이 제공된다.
또 다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이, 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계; 기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계에 의해 제조되고, 상기 소화시키는 단계가, 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계; 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계; 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는, 동종이식편 제품이 제공된다.
한 실시태양에서, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 골연골 동종이식편을 얻는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 제공하는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 골연골 동종이식편을 제공하는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 골연골 동종이식편의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 접종된 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법에 의해 제조되는, 동종이식편 제품이 제공된다.
한 실시태양에서, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 조각화된 연골을 얻는 단계; 접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 형성하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 제공하는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 조각화된 연골을 제공하는 단계; 접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계에 의해 제조되는, 동종이식편 제품이 제공된다.
한 실시태양에서, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 제공하는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 연골을 제공하는 단계; 접종된 연골을 형성하도록 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 접종된 연골의 인큐베이션에 의해 세포 현탁액을 중간엽 줄기세포 및 연골에 부착시키는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 연골(예를 들어, 탈세포화된 연골)과의 조합 방법이 개시된다.
다른 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 연골(예를 들어, 탈세포화된 연골)과의 조합을 포함하고, 조합이, 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계; 동일한 시체 공여자로부터 연골을 얻는 단계; 접종된 연골을 형성하도록 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 중간엽 줄기세포 및 연골에 부착시키는 단계에 의해 제조되는, 동종이식편 제품이 개시된다.
다른 실시태양이 또한 개시된다.
본 발명의 예시적 실시태양이 다음의 도면에서 도시되고, 여기에서:
도 1은 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 예시적인 조합 방법의 흐름도를 나타내고;
도 2는 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 예시적인 조합 방법의 흐름도를 나타내고;
도 3은 예시적인 골연골 동종이식편을 나타내고;
도 4는 연골 대조 샘플의 H&E 염색을 나타내고;
도 5는 지방 유래 줄기세포 접종된 연골의 H&E 염색을 나타낸다.
달리 기술되지 않는 한, 인간 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포 또는 MSC로 일반적으로 나타낸다. MSC는 둘 이상의 별개의 발달 경로에 따라 분화할 수 있는 다분화능 세포이다. 지방-유래 줄기세포 또는 ASC는 지방 조직으로부터 유래한 줄기세포이다. 기질 혈관 분획 또는 SVF는 MSC를 포함하는 조직의 소화 후 얻어지는 원심분리된 세포 펠릿을 일반적으로 나타낸다. 일부 실시태양에서, 기질 혈관 분획은 MSC 및 원치않는 세포(비-중간엽 줄기세포)를 포함하는, 이종 세포 집단을 포함한다. 한 실시태양에서, SVF 펠릿은 복수의 유형의 줄기세포를 포함할 수 있다. 이들 줄기세포는, 예를 들어, 조혈 줄기세포, 상피 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 다른 줄기세포(즉, 원치않는 세포)는 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골)에 부착되지 않지만 이들은 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골)에 부착되는 것에 의해 다른 줄기세포로부터 여과된다. 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골)에 부착되지 않는 다른 세포는 이들 원치않는 세포에 또한 포함될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본원에서 기술하는 동종이식편(예를 들어, 골연골 동종이식편, 연골 동종이식편, 조각화된 연골 동종이식편, 탈세포화된 연골 동종이식편, 또는 탈세포화된 조각화된 연골 동종이식편)에 접종되는 기질 혈관 분획(SVF)은 중간엽 줄기세포 증식의 중간 단계 없이 동종이식편에 직접 접종된다. 기질 혈관 분획을 얻는 방법은, 예를 들어, 본원에 참조문헌으로 포함된 WO 2010/059565에 개시되어 있다.
일부 실시태양에서, 지방 유래 줄기세포는 시체로부터 단리되고 유동 세포분석법 및 삼-계통 분화(골 형성, 연골 형성 및 지방 생성)를 사용하여 특성화된다. 최종 생성물은 미세구조를 위해 조직학 및 세포 계수를 위해 생화학적 분석기를 사용하여 특성화될 수 있다. 이 일관된 세포-기재 제품은 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골) 재생에 유용할 수 있다.
조직 공학 및 재생 의학 접근법은 신체 조직 재생에 큰 가능성을 제공한다. 이식 전 스캐폴드 내의 세포의 접종 및 시험관 내 배양에 기반한 가장 폭넓게 연구되는 조직 공학 접근법은, 세포 출처 및 세포 증식 및 분화를 통제하는 능력이다. 많은 연구자들이 지방 조직-유래 줄기세포(ASC)가 복수의 분화 능력을 갖는다는 것을 입증했다. 예를 들어, 참조문헌으로 포함된 다음을 참조하기 바란다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
또한, 지방 조직은 아마도 가장 풍부하고 접근 가능한 성체 줄기세포 출처일 것이다. 지방 조직 유래 줄기세포는 조직 재생을 위한 큰 잠재력을 갖는다. 그럼에도 불구하고, ASC 및 골수-유래 줄기세포(BMSC)는 세포질 부피에 비해 풍부한 소포체 및 큰 핵을 가져 섬유아세포 특성을 나타내, 성장 및 형태학과 관련하여 매우 유사하다. 예를 들어, 참조문헌으로 포함된 다음을 참조하기 바란다:
Figure pct00004
도 1은 골연골 동종이식편의 줄기세포와의 조합 방법의 흐름도이다. 한 실시태양에서, 동종이식편을 접종하기 위해 기질 혈관 분획(예를 들어, 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 이종 세포 집단)을 사용할 수 있다. 용어 "접종"은 동종이식편 내 또는 적어도 이에 부착한 줄기세포의 첨가 및 배치에 관한 것이나, 특정 방법에 제한되지 않는다는 것은 본원으로부터 명백할 것이다.
예시적인 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 방법은 체 외 방법이다. 방법은 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 원치않는 세포는 조혈 줄기세포 및 다른 기질 세포를 포함할 수 있다. 방법은 중간엽 줄기세포 및 적어도 일부 또는 모든 원치않는 세포를 포함하는 세포 현탁액(예를 들어, 기질 혈관 분획)을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 이 소화 단계에 이어 중간엽 줄기세포를 농축하기 위해 일부의 원치않는 세포 및 다른 구성성분을 반대로 감소시킬 수 있다.
이어서, 방법은 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계를 포함한다. 이에 이어 중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액이 골연골 동종이식편에 부착(예를 들어, 적합한 인큐베이션 조건하에서 접종된 동종이식편을 인큐베이션함으로써)시킬 수 있다. 바람직한 생성물을 제공하기 위해, 방법은 접종된 골연골 동종이식편으로부터 원치않는 세포를 제거하기 위해 접종된 골연골 동종이식편을 헹구는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 동종이식편 제품은 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함할 수 있고 조합은 위의 예시적인 실시태양에 의해 제조된다.
한 실시태양에서, 지방 조직은 시체 공여자로부터 얻어지거나 회수될 수 있다. 통상적인 공여자는 1천 8백만 MSC를 포함하는 2 리터의 지방을 낸다. 한 실시태양에서, 골연골 동종이식편은 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 올 수 있다. 다른 실시태양에서, 지방 조직은 연골 또는 골연골 대체/재생 수술을 받을 환자로부터 얻어질 수 있다. 또한, 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골) 및 지방 조직 둘 다는 동일한 시체 공여자로부터 얻어질 수 있다. 지방 세포는 지방 흡인을 사용하여 제거될 수 있다. 지방 조직, 다른 조직, 및 골연골 동종이식편의 다른 출처 및 출처의 조합이 사용될 수 있다.
임의적으로, 지방 조직은 소화 전 또는 도중에 세척될 수 있다. 세척은 10 분 이상 동안 37 ℃에서 75 RPM에서 열 진탕기를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 지방 조직 세척은 지방 조직과 실질적으로 동일한 부피의 PBS로의 세척을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 지방 조직 세척은 약 37 ℃에서 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 PBS로의 세척을 포함한다.
예를 들어, 지방 조직 세척은 조직을 교반하는 단계 및 약 3 내지 5 분 동안 상분리시키는 단계를 포함할 수 있다. 이에 이어 상청액 용액을 흡인해낼 수 있다. 세척은 맑은 하층액이 얻어질 때까지 지방 조직 세척을 복수 회 반복하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 지방 조직 세척은 지방 조직과 실질적으로 동일한 부피의 성장 배지로의 세척을 포함할 수 있다.
도 2는 조각화된 연골(예를 들어, 탈세포화된 조각화된 연골)의 줄기세포와의 조합 방법의 흐름도이다. 한 실시태양에서, 동종이식편을 접종하기 위해 기질 혈관 분획(예를 들어, 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 이종 세포 집단)을 사용할 수 있다.
다른 예시적인 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서, 방법은 체 외 방법이다. 방법은 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 원치않는 세포는 조혈 줄기세포 및 다른 기질 세포를 포함할 수 있다. 방법은 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액(예를 들어, 기질 혈관 분획)을 형성하기 위해 지방-유래 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 이 소화 단계에 이어 MSC를 자연적으로 선택하고 중간엽 줄기세포를 농축하기 위해 일부의 원치않는 세포 및 다른 구성성분을 제거할 수 있다.
이어서, 방법은 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액(예를 들어, 기질 혈관 분획)을 조각화된 연골에 첨가하는 단계를 포함한다. 이에 이어 중간엽 줄기세포가 부착할 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 중간엽 줄기세포 및 조각화된 연골에 부착(예를 들어, 적합한 인큐베이션 조건하에서 접종된 조각화된 연골을 인큐베이션함으로써)시킬 수 있다. 바람직한 제품을 제공하기 위해, 방법은 접종된 조각화된 연골로부터 원치않는 세포를 제거하기 위해 접종된 조각화된 연골을 헹구는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 동종이식편 제품은 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함할 수 있고, 조합은 위의 예시적인 실시태양에 의해 제조된다.
한 실시태양에서, 지방 조직은 시체 공여자로부터 얻어질 수 있다. 통상적인 공여자는 1천 8백만 MSC를 포함하는 2 리터의 지방을 낸다. 한 실시태양에서, 조각화된 연골은 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 올 수 있다. 다른 실시태양에서, 지방 조직은 환자로부터 얻어질 수 있다. 또한, 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골) 및 지방 조직 둘 다는 동일한 시체 공여자로부터 얻어질 수 있다. 지방 세포는 지방 흡인을 사용하여 제거될 수 있다. 지방 조직, 다른 조직, 및 조각화된 연골의 다른 출처 및 출처의 조합이 사용될 수 있다.
임의적으로, 지방 조직은 소화 전 또는 도중 세척될 수 있다. 세척은 10 분 이상 동안 37 ℃에서 75 RPM에서 열 진탕기를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 지방 조직 세척은 지방 조직과 실질적으로 동일한 부피의 PBS로의 세척을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 지방 조직 세척은 약 37 ℃에서 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 PBS로의 세척을 포함한다.
예를 들어, 지방 조직 세척은 조직을 교반하는 단계 및 약 3 내지 5 분 동안 상분리시키는 단계를 포함할 수 있다. 이에 이어 상청액 용액을 흡인해낼 수 있다. 세척은 맑은 하층액이 얻어질 때까지 지방 조직 세척을 복수 회 반복하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 지방 조직 세척은 지방 조직과 실질적으로 동일한 부피의 성장 배지로의 세척을 포함할 수 있다.
세포 현탁액 소화는 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 조직을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 1 용액과 혼합된 세포 현탁액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 현탁액 소화는 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
세포 현탁액 소화는 기질 혈관 분획으로 나타낼 수 있는 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 2를 참조). 접종 전, 실험실 스폰지 또는 다른 메커니즘을 사용하여 펠릿으로부터 세포를 가볍게 두드려 건조할 수 있다.
여러 실시태양에서, 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골(예를 들어, 탈세포화된 조각화된 연골)에 첨가하는 단계는 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골, 예를 들어, 탈세포화된 연골 또는 탈세포화된 조각화된 연골)로의 접종을 위한 세포 펠릿의 사용을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포가 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골에 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액은 접종된 동종이식편에 부착되게 된다. 일부 실시태양에서, 접종된 골연골 이식편(또는 접종된 연골 또는 접종된 조각화된 연골, 예를 들어, 접종된 탈세포화된 연골 또는 접종된 탈세포화된 조각화된 연골)은 적절한 인큐베이션 조건하에서 일정 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시태양에서, 접종된 골연골 이식편(또는 접종된 연골 또는 접종된 조각화된 연골, 예를 들어, 접종된 탈세포화된 연골 또는 접종된 탈세포화된 조각화된 연골)은 가습되는 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 일부 실시태양에서, 접종된 골연골 이식편(또는 접종된 연골 또는 접종된 조각화된 연골, 예를 들어, 접종된 탈세포화된 연골 또는 접종된 탈세포화된 조각화된 연골)은 배양 배지 및/또는 하나 이상의 성장 인자의 존재하에서 인큐베이션된다. 일부 실시태양에서, 인큐베이션 후, 접종된 골연골 이식편(또는 접종된 연골 또는 접종된 조각화된 연골, 예를 들어, 접종된 탈세포화된 연골 또는 접종된 탈세포화된 조각화된 연골)은 동종이식편으로부터 원치않는 세포를 제거하기 위해 헹궈진다. 헹굼 단계 후, 실험실 스폰지 또는 다른 메커니즘을 사용하여 세포를 가볍게 두드려 건조할 수 있다.
여러 실시태양에서, 방법은 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골의 헹굼 후 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골, 예를 들어, 탈세포화된 연골 또는 탈세포화된 조각화된 연골)을 동결 보존 배지에 두는 것을 포함할 수 있다. 이 동결 보존 배지는 최종 생성물을 저장하기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 방법은 최종 생성물을 저장하기 위해 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골을 헹군 후 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골을 동결 상태로 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 동결 상태는 약 -80 ℃일 수 있다.
다른 실시태양에서, 피콜리(Ficoll) 밀도 용액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 일정 부피의 PBS 및 일정 부피의 피콜리 밀도 용액을 지방 용액에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. PBS의 부피는 5 ml일 수 있고 피콜리 밀도 용액의 부피는 25 ml 및 1.073 g/ml의 밀도일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 지방 용액을 실온 근처에서 약 30 분 동안 약 1160 g에서 원심분리하는 것을 또한 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 방법은 브레이크를 사용하지 않고 지방 용액의 원심분리를 멈추는 것을 포함할 수 있다.
중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 임의적이고 이어서 유핵 세포를 포함하는 위 층 및 계면을 채취하고, 적혈구 및 세포 잔여물의 아래 층을 버리는 것을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 유핵 세포의 위 층의 양의 약 두 배 부피의 D-PBS를 첨가하고, 세포를 포함하는 용기를 뒤집어 채집된 세포를 세척하는 것을 또한 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 감속 도중 브레이크를 사용하여 채취한 세포를 펠릿화 하기 위해 채취한 세포를 원심분리하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 중간엽 줄기세포의 농도를 반대로 감소시키는 것은 채집된 세포를 실온 근처에서 약 5 분 동안 약 900 g에서 원심분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 원치않는 세포를 반대로 감소시키는 것은 채집된 세포를 원심분리한 후 상청액을 버리고, 채집된 세포를 성장 배지에 재현탁하는 것을 포함할 수 있다.
종래의 방법은 공여자 무릎의 한 부위로부터의 이식편이 동일한 공여자 무릎, 그러나 손상된 부위에 이식되는 자가 골연골 이식편을 사용했다. 그러나, 이 방법은 환자에게 외상을 초래하고 새로운 손상 부위를 만든다. 자가이식편에 의해 발생하는 외상을 방지하는 동종이식편이 현재 사용된다. 비-처리된 골연골 동종이식편은 면역 반응성의 문제가 있다. 처리된 골연골 동종이식편은 생존 세포가 없거나, 생존능력이 감소되거나, 또는 재생이 될 수 없는 완전히 분화한 세포를 갖는 문제가 있다. 따라서, 재생의 단계적인 반응을 반복하기 위해 생존 MSC를 포함하는 연골 이식편을 제공할 필요가 있다.
연골의 표면은 그 본질상, 세포에 부착되지 않는다. 중간엽 줄기세포는 부착 의존적이지만, 연골과 같은 생물학적 조직이 아닌 조직 배양 플라스틱에 부착되는 것으로 해당 기술분야에서 정의되었다. 놀랍게도, 본원에서 제공하는 방법은 연골에 결합하는 생존 MSC를 허용한다.
본원에서 제공하는 방법은 MSC가 본원에 기술한 비-합성 골연골 또는 연골(예를 들어, 탈세포화된 연골) 스캐폴드에 부착시키는 동종이식편 처리를 기술한다. 실시예의 방법은 생존 MSC가 부착될 수 있도록 연골 이식편으로부터 세포를 제거하는 블렌딩 및 처리 방법을 나타낸다.
중간엽 줄기세포는 비-면역원성이고 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골의 연골을 재생한다. 원치않는 세포는 일반적으로 부착 비의존적이다. 이는 원치않는 세포는 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골에 일반적으로 부착되지 않는다는 것을 의미한다. 원치않는 세포는 면역원성일 수 있다. 헹굼 도중 세포 정제를 위해, 중간엽 줄기세포는 골연골 동종이식편 또는 조각화된 연골에 부착되는 반면 조혈 줄기세포와 같은 원치않는 세포는 헹궈져 나가 골연골 이식편(또는 연골 또는 조각화된 연골) 위에 실질적으로 균일한 중간엽 줄기세포 집단을 남긴다.
세포외 기질을 광물화하고 연골을 생성하는 능력은 MSC에 유일한 것은 아니다. 사실, ASC는 유사한 조건하에서 연골세포로 분화하는 유사한 능력을 갖는다. 인간 ASC는 다른 세포 출처와 대비되는 특유의 이점을 제공한다. ASC의 다분화능 특성 및 인체 내의 이들의 풍부함은 이들 세포를 조직 공학 응용에서 바람직한 출처로 만든다.
또한, 이 방법 및 조합 제품은 조직의 관련 생물학적 특성을 변화시키지 않는 처리를 수반한다. 지방/줄기세포의 처리는 항생제, 세포 배지, 콜라게나아제의 사용을 수반할 수 있다. 이들 중 어느 것도 줄기세포의 관련 생물학적 특성에 영향을 미치지 않는다. 이들 중간엽 줄기세포의 관련 생물학적 특성은 재생 및 회복을 중심으로 한다. 줄기세포의 처리는 계속해서 분화하고 회복하는 세포의 능력을 변화시키지 않는다.
자극 또는 환경적 신호가 없으면, 중간엽 줄기세포(MSC)는 미분화한 채로 유지되고 뼈, 연골, 지방, 및 근육과 같은 조직을 형성하는 능력을 유지한다. 골전도성 매트릭스에 부착되면, MSC는 체내에서 골아세포 계통을 따라 분화하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 참조문헌으로 포함된 다음을 참조하기 바란다:
Figure pct00005
도 3을 참조하면, 및 한 실시태양에서, 골연골 동종이식편(10)이 도시되고, 이는 시체로부터의 연골(15) 및 골(20)을 포함할 수 있다. 골연골 동종이식편은 무릎(25) 또는 연골이 손실된 다른 관절 부위에 배치될 수 있다. 이 기술은 연골이 손실된 큰 부위가 있거나 뼈 및 연골이 둘 다 손실된 경우 사용될 수 있다. 공여자 동종이식편은 박테리아, 간염 바이러스, 및 HIV를 포함할 수 있는 오염물질 유무를 시험해야 한다. 골연골 동종이식편 및 지방-유래 중간엽 줄기세포 둘 다를 위해 동일한 공여자를 갖는 것는 시험 부담을 줄이고 다른 가능한 문제를 최소화할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 설명을 위해 제공되지만, 청구된 발명을 제한하지 않는다.
지방-유래 줄기세포와 조합된 연골
목표는 지방 유래 줄기세포가 처리된 및 근원 관절 연골에 부착되는지를 확인하는 것이었다.
ASC는 연골에 부착되고, 연골 회복 및 재생을 촉진한다.
실험 설계:
Figure pct00006
물질 및 방법:
샘플 제조: 무릎 관절 표면에서 미리 깎고 -80 ℃에서 냉동한 연골 조각을 해동하고 PBS에 담근 채로 "하이(Hi)"(22,000 rpms)에서 약 2 분 동안 블렌딩(워링 블렌더(Waring Blender))했다. 생성된 입자는 약 1 mm x 2-3 mm x 1 mm였다. 이어서 입자를 헹구고 체에서 물기를 제거하고 여섯 개의 5 ml 샘플로 나누고 6-웰 플레이트에 두었다. 접종 전, 연골 샘플을 소독된 거즈로 가볍게 두드려 건조했다. 연골을 포함하는 세 웰에 각각 200 ㎕ 세포 현탁액을 접종했다. 연골만 포함하는 다른 세 웰은 비접종된 대조물로 남겨두었다. 빈 6-웰 플레이트를 세 웰은 세포가 있고 세 웰은 세포가 없게 동일한 방식으로 접종했다. 웰을 가습되는 인큐베이터에서 37 ℃ 및 5 % CO2에서 한 시간 동안 인큐베이션 하고, 이어서 5 ml DMEM-F12/10%FBS/1%PSA에 담그고 36 시간 동안 인큐베이션했다. 6-웰 플레이트 내의 모든 샘플을 세포 계수를 위해 CCK-8 분석기를 사용하여 시험하고 조직학을 위해 연골 샘플을 채취했다.
세포 계수: CCK -8 분석기
세포 계수 키트-8(CCK-8, 도진도 몰레큘러 테크놀로지스(Dojindo Molecular Technologies), 매릴랜드)은 세포 증식 분석기 내의 생존 세포 수 측정을 위한 섬세한 색도 분석법을 가능하게 한다. 세포 내의 탈수소효소의 활성에 의해 생성된 포르마잔 염료의 양은 생세포의 수에 정비례한다. 샘플을 PBS로 헹구고 이어서 가볍게 두드려 건조했다. 성장 배지 및 CCK-8 용액을 10:1의 비로 웰에 첨가하고 2 시간 동안 37 ℃에서 배양하고 460 nm로의 여기 세트 및 650 nm로의 방출 세트가 있는 플레이트 판독기에서 평가했다. ASC만 있는 경우(계대=1)에 기초한 표준 곡선으로부터 결과를 삽입했다.
조직학
연골 샘플을 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린(시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스)에 고정하고, 밤새 프로세서(시타델(Citadel) 2000; 써모 쉔돈(Thermo Shandon), 펜실베니아주 피츠버그)에 두고, 파라핀에 매립했다. 시료를 5 ㎛로 자르고 유리 슬라이드에 올리고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했다. 보통의 광학 현미경을 사용하여 매트릭스 및 세포 형태학을 위해 시료를 분석했다.
결과
세포 계수: 연골 위의 세포 수는 6 웰 플레이트에서 배양한 ASC만 있는 대조물과 현저하게 상이했다.
Figure pct00007
도 4는 연골 대조물(10X 확대)의 H&E 염색을 나타낸다. 근원 연골 매트릭스의 공극 내에 생세포가 없음을 주지하기 바란다.
도 5는 ASC 접종된 연골(10X 확대)의 H&E 염색을 나타낸다. 공극 내의 생세포 핵을 주지하기 바란다.
연골만 있는 대조물에서, 생세포는 없었고, 죽은 세포 잔여물만이 관찰되었다. 세포는 모두 죽고 공극만 남은 것으로 보였다. ASC 접종된 연골에서, 모든 접종된 세포는 연골로부터의 종래의 세포에 의해 남겨진 공극에 재편된 것으로 보인다. 탈세포화된 구역이 부족한 연골 표면에는 생세포가 없었다.
결론
ASC는 연골 매트릭스에 부착되지 않았지만, 이들은 기존의 연골 세포로부터 남겨진 공극 내에 재편되었다.
전술한 발명을 이해의 명확성을 위해 설명 및 실시예를 통해 자세히 기술했지만, 당업자는 청구된 청구항의 범위 내에서 특정 변형 및 수정이 가해질 수 있음을 알 것이다. 또한, 본원에 제공한 각 참조문헌은 각 참조문헌이 개별적으로 참조문헌으로 포함된 것과 같은 정도로 전체로서 참조문헌으로 포함된다.

Claims (36)

  1. 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계;
    중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
    접종된 골연골 동종이식편을 형성하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 첨가하는 단계; 및
    중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하는,
    중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법.
  2. 제1항에 있어서, 지방 조직을 얻는 단계가 시체 공여자로부터의 회수를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골연골 동종이식편이 시체 공여자로부터 오고, 지방 조직을 얻는 단계가 골연골 동종이식편과 동일한 시체 공여자로부터의 회수를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액을 포함하는 지방을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가, 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 세포 현탁액을 연골에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 세포 현탁액을 골연골 동종이식편 내의 탈세포화된 공극에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 현탁액을 연골에 주입하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 접종된 골연골 동종이식편으로부터 원치않는 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 동종이식편 제품.
  12. 제11항에 있어서, 지방 조직이 시체 공여자로부터 회수되고, 골연골 동종이식편이 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 회수되는, 동종이식편 제품.
  13. 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계;
    기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
    접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및
    중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하고,
    상기 소화시키는 단계가, 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계;
    시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계;
    펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는,
    중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법.
  14. 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이 제13항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 동종이식편 제품.
  15. 제14항에 있어서, 지방 조직이 시체 공여자로부터 회수되고, 골연골 동종이식편이 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 회수되는, 동종이식편 제품.
  16. 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계;
    중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
    접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및
    중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계를 포함하는,
    중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법.
  17. 제16항에 있어서, 지방 조직을 얻는 단계가 시체 공여자로부터의 회수를 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 조각화된 연골이 시체 공여자로부터 오고, 지방 조직을 얻는 단계가 조각화된 연골과 동일한 시체 공여자로부터의 회수를 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액을 포함하는 지방을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가 시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 조직을 소화시키는 단계가, 펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 세포 현탁액을 조각화된 연골 조각에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 세포 현탁액을 조각화된 연골 조각 내의 공극에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 현탁액을 첨가하는 단계가 현탁액을 조각화된 연골 조각에 주입하는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 조각화된 연골로부터 원치않는 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된, 동종이식편 제품.
  27. 제26항에 있어서, 지방 조직이 시체 공여자로부터 회수되고, 조각화된 연골이 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 회수되는, 동종이식편 제품.
  28. 중간엽 줄기세포를 원치않는 세포와 함께 갖는 지방 조직을 얻는 단계;
    기질 혈관 분획을 얻도록 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
    접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 및
    중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 탈세포화된, 조각화된 연골에 부착시키는 단계를 포함하고,
    상기 소화시키는 단계가, 콜라게나아제 I 용액을 제조하고, 용액을 0.2 ㎛ 여과 유닛을 통해 여과하고, 지방 용액을 콜라게나아제 I 용액과 혼합하고, 콜라게나아제 I 용액과 혼합된 지방 용액을 진탕 플라스크에 첨가하는 단계;
    시각적으로 매끄러운 외관의 지방조직을 제공하기 위해 약 45 내지 60 분 동안 약 75 RPM에서 연속적인 교반으로 진탕기를 두는 단계;
    펠릿을 제공하기 위해 성숙한 지방세포를 포함하는 상청액을 흡인하는 단계를 포함하는,
    중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합 방법.
  29. 중간엽 줄기세포의 탈세포화된, 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이 제28항의 방법에 의해 제조된, 동종이식편 제품.
  30. 제29항에 있어서, 지방 조직이 시체 공여자로부터 회수되고, 조각화된 연골이 지방 조직과 동일한 시체 공여자로부터 회수되는, 동종이식편 제품.
  31. 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계;
    동일한 시체 공여자로부터 골연골 동종이식편을 얻는 단계;
    접종된 골연골 동종이식편을 형성하도록 골연골 동종이식편을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및
    중간엽 줄기세포가 부착될 수 있는 시간 동안 세포 현탁액을 골연골 동종이식편에 부착시키는 단계를 포함하는,
    중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합 방법.
  32. 중간엽 줄기세포의 골연골 동종이식편과의 조합을 포함하고, 조합이 제31항의 방법에 의해 제조되는, 동종이식편 제품.
  33. 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계;
    동일한 시체 공여자로부터 조각화된 연골을 얻는 단계;
    접종된 조각화된 연골을 형성하도록 조각화된 연골을 접종하기 위해 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계; 및
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    중간엽 줄기세포의 조각화된 연골과의 조합 방법.
  34. 중간엽 줄기세포의 조각화된 연골과의 조합을 포함하고, 조합이 제33항에 기재된 방법에 의해 제조된, 동종이식편 제품.
  35. 시체 공여자의 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 단계;
    동일한 시체 공여자로부터 연골을 얻는 단계;
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    중간엽 줄기세포의 연골과의 조합 방법.
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