CN115125191B - 成纤维细胞转化培养基及其应用、成纤维细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种成纤维细胞转化培养基及其应用、成纤维细胞的制备方法，涉及生物技术的技术领域。该成纤维细胞转化培养基中含有血小板活性因子(PRP)，用于诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，可以使脐带间充质干细胞更好的向成纤维细胞转化，缓解了现有技术中存在的外源成纤维细胞获取困难的技术问题。

Description

成纤维细胞转化培养基及其应用、成纤维细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及一种成纤维细胞转化培养基及其应用、成纤维细胞的制备方法。
背景技术
成纤维细胞存在于皮肤真皮层，是皮肤更新和创伤愈合中的主要修复细胞，可合成和分泌胶原纤维、连接蛋白、透明质酸等细胞外基质。如果皮肤中的成纤维细胞功能受损或者数量不足，会导致皮肤老化加速和损伤修复缓慢。如何从外界获得成纤维细胞，对真皮层中的成纤维细胞进行补充，是人们广泛关注和亟待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种成纤维细胞转化培养基，该成纤维细胞能有效的诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，缓解了现有技术中存在的外源成纤维细胞获取困难的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种利用上述成纤维细胞转化培养基的成纤维细胞的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种上述成纤维细胞转化培养基或上述成纤维细胞的制备方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种成纤维细胞转化培养基，所述成纤维细胞转化培养基用于诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，所述成纤维细胞转化培养基包含血小板活性因子。
优选地，所述血小板活性因子按照如下方法制备得到：
a.去除脐带血中的红细胞，然后进行固液分离，分别获得细胞和血浆；
b.将a步骤获得的细胞进行凝血酶处理，然后反复冻融，固液分离后保留上清，制备得到血小板活性因子；
优选地，所述成纤维细胞转化培养基还包括碱性成纤维细胞生长因子；
优选地，所述成纤维细胞转化培养基还包括：基础培养基、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；
优选地，所述脐带血血清按照如下方法制备得到：先将脐带血35～37℃恒温放置，然后再放入2～6℃环境中以备离心，离心后分离血清，过滤后得到脐带血血清；
优选地，先将脐带血37℃恒温放置2h，然后再放入4℃环境中4h以备离心，离心参数优选为1500rpm离心30min。
优选地，所述成纤维细胞转化培养基包括基础培养基、血小板活性因子、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度为：
磷酸维生素C的浓度为0.9～1.1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.03～0.05mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为8～12％，血小板活性因子的浓度为8～12％。
优选地，所述基础培养基选自DMEM/F12；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度为：
磷酸维生素C的浓度为1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.04mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为10％，血小板活性因子的浓度为10％。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了成纤维细胞的制备方法，包括：使用上述成纤维细胞转化培养基培养脐带间充质干细胞，诱导脐带间充质干细胞转化为成纤维细胞。
优选地，所述脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞；
优选地，所述脐带间充质干细胞选自人脐带间充质干细胞；
优选地，所述成纤维细胞的制备方法包括：先使用脐带间充质干细胞培养基将脐带间充质干细胞制备成细胞悬液，接种于培养容器且细胞贴壁后更换为所述成纤维细胞转化培养基培养；
优选地，所述脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；
优选地，接种于培养容器24h后更换为所述成纤维细胞转化培养基培养。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述成纤维细胞转化培养基，或上述成纤维细胞的制备方法在制备用于皮肤修复的产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于皮肤修复的产品，该产品包含上述成纤维细胞转化培养基。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的成纤维细胞转化培养基包含血小板活性因子，能够诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化。血小板活性因子(PRP)中富含生长因子、细胞因子和抗菌肽等多种生物活性物质。本发明通过实验发现，添加血小板活性因子(PRP)的培养基能够有效的诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化。采用含有血小板活性因子(PRP)的培养基诱导得到的成纤维细胞，Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白均具有较高的表达量，说明含有血小板活性因子(PRP)的培养基可以使脐带间充质干细胞更好的向成纤维细胞转化。因此，上述成纤维细胞转化培养基，以及利用上述成纤维细胞转化培养基的成纤维细胞制备方法缓解了现有技术中存在的外源成纤维细胞获取困难的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备得到的第3代脐带间充质干细胞，细胞形态为梭形或多角犁形；
图2为实验组3中3代脐带间充质干细胞诱导得到的成纤维细胞，细胞形态为网状或者丝状；
图3a为免疫组化检测对照组细胞的Ⅰ型胶原蛋白的表达结果；
图3b为免疫组化检测实验组1细胞的Ⅰ型胶原蛋白的表达结果；
图3c为免疫组化检测实验组2细胞的Ⅰ型胶原蛋白的表达结果；
图3d为免疫组化检测实验组3细胞的Ⅰ型胶原蛋白的表达结果；
图4a为免疫组化检测对照组细胞的层粘连蛋白的表达结果；
图4b为免疫组化检测实验组1细胞的层粘连蛋白的表达结果；
图4c为免疫组化检测实验组2细胞的层粘连蛋白的表达结果；
图4d为免疫组化检测实验组3细胞的层粘连蛋白的表达结果；
图5a为免疫组化检测对照组细胞的结蛋白的表达结果；
图5b为免疫组化检测实验组1细胞的结蛋白的表达结果；
图5c为免疫组化检测实验组2细胞的结蛋白的表达结果；
图5d为免疫组化检测实验组3细胞的结蛋白的表达结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所述的血小板活性因子指的是富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，PRP是一类来源于自体或同种异体血液的生物制剂，其主要通过离心或血细胞分离方法将大量血小板富集到一部分血浆当中。PRP中富含生长因子、细胞因子和抗菌肽等多种生物活性物质。本发明不限制使用的血小板活性因子(PRP)的来源或制备方法，其可以为市售的血小板活性因子(PRP)；其制备方法可根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明等中记载的方法来进行，本发明对此不做限制。
在一些优选的实施方式中，采用如下方法制备得到的血小板活性因子(PRP)配制得到的成纤维细胞转化培养基效果更佳：
a.去除脐带血中的红细胞，然后进行固液分离，分别获得细胞和血浆；
b.将a步骤获得的细胞进行凝血酶处理，然后反复冻融，固液分离后保留上清，制备得到血小板活性因子。
该实施方式提供的血小板活性因子的制备方法，首先去除脐带血中大部分红细胞，固液分离后获得细胞和血浆，提高细胞中血小板的含量；然后将获得的细胞进行凝血酶处理和反复冻融，使得血小板活性物质充分释放，固液分离后收集富含血小板活性物质的上清，制备得到血小板活性因子。该制备方法简单方便，无需特殊设备，制备得到血小板活性因子中有效成分含量高，具有良好的诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化的作用。
在一些优选的实施方式中，所述去除脐带血中的红细胞的方法包括离心。优选地，所述离心的离心力例如可以为，但不限于100g、200g、300g、400g、500g或600g，优选为300g。经发明人研究发现，当离心的离心力在100～600g范围内时，能够避免血小板活性因子(血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等)的释放，有助于提高最终产品中血小板活性因子的含量。
优选地，所述离心的时间例如可以为，但不限于8min、9min、10min、11min或12min，优选为10min；
优选地，所述离心的温度例如可以为，但不限于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃或25℃。
通过对上述离心条件的进一步优化和调整，使得更好的去除红细胞杂质，同时避免离心过程中血小板活性因子的提前释放。
在一些优选的实施方式中，a步骤中，所述固液分离包括离心或过滤。
优选地，所述离心的离心力例如可以为，但不限于100g、200g、300g、400g、500g或600g，优选为300g。经发明人研究发现，当离心的离心力在100～600g范围内时，能够在实现血小板富集的同时，避免血小板活性物质的释放。
优选地，所述离心的时间例如可以为，但不限于8min、9min、10min、11min或12min，优选为10min；
优选地，所述离心的温度例如可以为，但不限于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃或25℃。
通过对上述离心条件的进一步优化和调整，在避免血小板活性物质释放的前提下，实现对血小板的富集。
经发明研究发现，将凝血酶和采用反复冻融的方式配合对a步骤获得的细胞进行处理，能够进一步提高血小板中有效物质的释放，提高产品中血小板有效物质的含量。
在一些优选的实施方式中，所述凝血酶处理为将a步骤获得的细胞与凝血酶溶液混合，通过凝血酶处理，以促进血小板中活性物质的释放。
优选地，所述凝血酶溶液的浓度例如可以为，但不限于800U/mL、900U/mL、1000U/mL、1100U/mL或1200U/mL，优选为1000U/mL；
优选地，所述细胞与凝血酶溶液混合的体积比例如可以为，但不限于8:1、9:1、10:1、11:1或12:1，优选为10:1；
优选地，所述凝血酶溶液为含有凝血酶的葡萄糖酸钙溶液；
优选地，所述凝血酶处理的时间例如可以为，但不限于0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。
在一些优选的实施方式中，所述反复冻融为循环进行冷冻和解冻；
优选地，所述冷冻的温度例如可以为，但不限于-196℃、-180℃、-160℃、-140℃、-120℃、-100℃、-80℃、-60℃、-40℃或-20℃，冷冻的时间为5～10min。
优选地，所述解冻的温度例如可以为，但不限于35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，解冻的时间为5～10min。
优选地，所述反复冻融的次数例如可以为，但不限于4次、5次、6次、7次或8次，优选为5次。
通过对凝血酶处理条件和反复冻融处理条件的进一步优化和调整，使得血小板中活性物质充分释放，提高产品中血小板活性物质的含量。
在一些优选的实施方式中，b步骤中，固液分离包括离心或过滤；
优选地，所述离心的离心力例如可以为，但不限于2500g、2700g、2900g、3100g、3300g或3500g，优选为3000g；
优选地，所述离心的时间例如可以为，但不限于16min、18min、20min、22min或24min，优选为20min；
优选地，所述离心的温度例如可以为，但不限于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃或25℃。
通过对上述离心条件的进一步优化和调整，使得混合溶液中固相物质充分去除。
在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞转化培养基还包括碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor；bFGF)，本发明通过实验发现，脐带间充质干细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板活性因子(PRP)的双重诱导下，可以更好的向成纤维细胞转化。经bFGF和PRP双重诱导的脐带间充质干细胞，经ELISA检测后发现细胞的Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白的表达量更高。
本发明提供的成纤维细胞转化培养基，以血小板活性因子，或更佳地以血小板活性因子和碱性成纤维细胞生长因子作为主要诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化的成分。可以理解的是，所述培养基还含有其他用于供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础成分，以及用于维持细胞生长环境的成分。
在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞转化培养基还包含基础培养基、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清。基础培养基能够为细胞的生长和增殖提供必要的物质，并具有维持细胞生长环境的作用；磷酸维生素C和脯氨酸的作用是作为成纤维细胞分泌胶原蛋白及相关蛋白的原料。
脐带血血清富含细胞生长和存活必需的细胞因子，本发明通过实验发现在培养间充质干细胞的培养基中添加脐带血血清能显著提高细胞活性。本发明不限制使用的脐带血血清的来源或制备方法，其可以为市售的脐带血血清；其制备方法可根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明等中记载的方法来进行，本发明对此不做限制。
在一些优选的实施方式中，所述脐带血清按照如下方法制备得到：先将脐带血35～37℃恒温放置，然后再放入2～6℃环境中以备离心，离心后分离血清，过滤后得到脐带血血清；优选37℃恒温放置2h，然后再放入4℃环境4h；离心参数优选为1500rpm离心30min。
在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞转化培养基包括基础培养基、血小板活性因子、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度优选如下：
磷酸维生素C的浓度为0.9～1.1mmol/L，优选为1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.03～0.05mmol/L，优选为0.04mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12μg/L，例如可以为但不限于为8μg/L、9μg/L、10μg/L、11μg/L或12μg/L，优选为10μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为8～12％，例如可以为但不限于为8％、9％、10％、11％或12％，优选为10％；
按照体积百分比计，血小板活性因子的浓度为8～12％，例如可以为但不限于为8％、9％、10％、11％或12％，优选为10％。
在一些优选的实施方式中，所述成纤维细胞转化培养基的基础培养基选自DMEM/F12，还包括血小板活性因子、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度为：
磷酸维生素C的浓度为1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.04mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为10％；
按照体积百分比计，血小板活性因子的浓度为10％。
可以理解的是，上述成纤维细胞转化培养基中各物质的浓度指的是各物质的工作浓度，当成纤维细胞转化培养基以储备液形式存在，或成纤维细胞转化培养基中的一种或多种成分以储备液形式存在，在使用时稀释或配置成上述工作浓度时，上述情形的成纤维细胞转化培养基也属于本发明的保护范围。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种成纤维细胞的制备方法，包括使用上述成纤维细胞转化培养基培养脐带间充质干细胞，诱导脐带间充质干细胞转化为成纤维细胞。
在一些优选的实施方式中，所述脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞。
本发明提供的成纤维细胞转化培养可以诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，本发明不限制脐带间充质干细胞的物种来源，具有向成纤维细胞转化潜能的脐带间充质干细胞均可以使用本申请提供的成纤维细胞转化培养基进行转化。所述脐带间充质干细胞优选为人脐带间充质干细胞，经上述成纤维细胞转化培养基诱导培养后，得到人成纤维细胞。
成纤维细胞可合成和分泌胶原纤维、连接蛋白、透明质酸等细胞外基质，是皮肤更新和创伤愈合中起主要修复作用的细胞，因此根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述成纤维细胞转化培养基，或上述成纤维细胞的制备方法在制备用于皮肤修复的产品中的应用。具体的应用实例例如可以为但不限于为：所述用于皮肤修复的产品为包含上述成纤维细胞转化培养基的产品；所述用于皮肤修复的产品包括成纤维细胞，所述成纤维细胞采用上述成纤维细胞制备方法制备得到；所述用于皮肤修复的产品包括成纤维细胞分泌产生的胶原纤维、连接蛋白、透明质酸等细胞外基质，所述成纤维细胞由上述成纤维细胞制备方法制备得到。
基于上述发明构思，本发明还提供了一种用于皮肤修复的产品，该产品包含上述成纤维细胞转化培养基。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实验仪器：
1、培养箱：日本三洋，型号MCO-20AIC；THERMO3951；
2、超净台：苏净安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD；
3、显微镜：Olympus，型号CKX41-F32FL；
4、离心机：Thermo，型号Heraeus Multifuge X1；
5、酶标分析仪:天石，型号SM-3。
实验材料：
1、第3代脐带间充质干细胞。(自制，制备方法参见实施1)
2、注射用0.9％生理盐水：四川科伦药业股份有限公司。
3、培养瓶：美国康宁(25ml、75ml)。
4、胰酶：Hyclone。
5、成纤维细胞诱导基础培养基DMEM/F12(Procell)。
6、血小板活性因子(PRP)(制备方法参见实施例4)。
7、bFGF成纤维细胞生长因子：元禾生物。
8、L(+)-抗坏血酸钠盐(非无菌磷酸维生素C)：Sigma-Aldrich。
9、L-脯氨酸(非无菌)：Sigma-Aldrich。
10、Human Collagen I Monoclonal Antibody(5D8-G9)小鼠/IgG1单抗：ThermoFisher Scientific。
11、Human/Mouse Desmin Antibody：Thermo Fisher Scientific。
12、Human Laminin alpha 4Antibody：Thermo Fisher Scientific。
13、2-step plus Poly-HRP Anti Mouse IgG Detection System(with DABSolution)：eBioscience。
14、人I型胶原蛋白(ColⅠ)试剂盒(ELISA)：酶联生物。
15、人层粘连蛋白α5(LNα5)试剂盒(ELISA)：酶联生物。
16、人结蛋白(Desmin)试剂盒(ELISA)：酶联生物。
实施例1
第3代脐带间充质干细胞的制备：
取一段脐带(约10cm)两端扎紧，于75％乙醇中消毒3min后，用生理盐水冲洗2遍，剔除多余组织，充分剪碎成组织小块(直径约1-2mm)接种到25ml培养瓶中，于37℃，5％CO2孵箱中，用间充质原代培养基。待细胞长至铺满瓶底80％左右时，用胰酶消化并用间充质传代培养基传至第3代。第3代脐带间充质干细胞如图1所示，细胞形态为梭形或多角犁。
实施例2
脐带血血清的制备：
1、将乙肝、丙肝、艾滋和梅毒检测阴性的脐带血采集好后，将采集袋放入37℃恒温箱2小时，再放入4℃冰箱4小时以备离心。
2、将准备好的采血袋对称放入离心机，按1500rpm离心30分钟后放入4℃冰箱备用。
3、取出4℃离心好的采血袋，注意轻拿轻放，以免将下层血块和血清混层。用50ml无菌注射器抽取血清，用滤器在百级净化操作台上对血清进行过滤，将滤出的血清进行分装后，即为人脐带血血清，送-20℃冰箱储存。
实施例3
在基础培养基(DMEM/F12)中加入不同比例的脐带血血清对间充质干细胞生长的影响：
分别在基础培养基(DMEM/F12)中加入比例为0％、5％、10％、15％和20％的脐带血血清，做5例复孔。经过96小时的培养，用CCK8试剂盒检测间充质干细胞生长的活性。实验结果如表1所示，在基础培养基(DMEM/F12)中加入10％的脐带血血清进行间充质干细胞培养96小时后，细胞的活性最佳。
表1
实施例4
血小板活性因子(PRP)的制备方法，包括如下步骤：
(1)取一份公共废弃脐血(有母血并且不超36h，脐血采集量超过80mL)，将母血贴上条码后送检核酸和酶免检测。
(2)将脐血用接合机接上空的三联采血袋进行第一次离心，离心条件为300g，10min，22℃，在分浆夹中将血浆、白膜层和少量红细胞分离至三联袋的另一个袋中，并将主袋中的大部分红细胞热合并丢弃。
(3)将以上离心出来的血浆、白膜层和少量红细胞进行第二次离心(离心条件为300g，10mins，22℃)，并分离获得上层富含雌激素的脐血浆，此时剩余的部分富含血小板、少量浆和少量红细胞(富含血小板的部分)。
(4)将富含血小板的部分用注射器吸出，转移至15mL离心管中，加入总体积(富含血小板的部分的体积)10％的1000U/ml的凝血酶/葡萄糖酸钙溶液，充分混匀后静置1小时。
(5)静置1小时后，将15ml离心管置于-196℃的液氮中，使其充分冻结5分钟，再取出至于37℃水浴箱中解冻5分钟；重复以上冻融过程5次，再次离心，离心条件为3000g，20min，22℃，吸上清，得到血小板活性因子。
本实施例中，还实验了如下制备方法：
步骤1)中第一次离心的离心力和步骤2)中第二次离心的离心力分别为100g、600g、1200g和2400g；以及，步骤1)中第一次离心的离心力和步骤2)中第二次离心的离心力采用300g前提下，只采用凝血酶激活法或只采用冻融激活法制备PRP；检测各制备方法制备得到的PRP中活性因子成分，结果如下表所示：
表2不同制备方法对PRP中活性因子成分的影响
从上述实验结果可以看出，以300g离心力离心，将凝血酶和反复冻融配合对血小板细胞进行处理，相较于凝血酶和反复冻融单独处理，能够进一步提高血小板活性物质的释放。因此，后续实施例采用300g离心力离心，将凝血酶和反复冻融配合对血小板细胞进行处理的方法制备得到的PRP。
实施例5
PRP血清联合bFGF诱导人脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化
在6孔板板底放置一张20mm×20mm大小的盖玻片，取生长状态良好的第3代间充质细胞，经胰酶消化细胞后，用对照组培养基制成单细胞悬液，接种在2个6孔板中(1×104个细胞/孔接种)，24h后换液分为4组，即：对照组、实验组1、实验组2、实验组3，各做3个复孔。在各组中添加1mmol/L磷酸维生素C和0.04mmo/L脯氨酸可作为成纤维细胞分泌胶原蛋白及相关蛋白的原料。
对照组：在培养基(DMEM/F12)中加入1mmol/L磷酸维生素C、0.04mmo/L脯氨酸、体积分数为10％的脐带血血清。
实验组1：在对照组的基础上，加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。
实验中2：在对照组的基础上，加入体积分数为10％的实施例4制备的PRP(血小板活性因子)。
实验组3：在对照组的基础上，加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子和体积分数为10％的实施例4制备的PRP(血小板活性因子)。
1.进行细胞诱导10天后，对各组细胞进行形态学观察，并做鉴定。实验组3诱导后的细胞如图2所示，实验组3提供的培养基将3代脐带间充质干细胞诱导为成纤维细胞，细胞形态为网状或者丝状。
2.诱导为成纤维细胞的相关蛋白表达的免疫组化鉴定，本实验鉴定的相关蛋白为Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白。
对照组第3代脐带间充质干细胞的Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白的免疫组化的鉴定结果分别如图3a、4a和5a所示。
采用bFGF将3代脐带间充质干细胞诱导为成纤维细胞的实验组1的Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白的免疫组化的鉴定结果分别如图3b、4b和5b所示。
采用PRP将3代脐带间充质干细胞诱导为成纤维细胞的实验组2的Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白的免疫组化的鉴定结果分别如图3c、4c和5c所示。
采用bFGF联合PRP将3代脐带间充质干细胞诱导为成纤维细胞的试实验组3的Ⅰ型胶原蛋白、层粘连蛋白和结蛋白的免疫组化的鉴定结果分别如图3d、4d和5d所示。
从图3a～3d的对比可以看出，各实验组Ⅰ型胶原蛋白的表达均高于对照组，且实验组3表达最高；从图4a～4d的对比可以看出，各实验组层粘连蛋白的表达均高于对照组，且实验组3表达最高。从图5a～5d的对比可以看出，各实验组结蛋白的表达均高于对照组，且实验组3表达最高。
从上述实验结果可以看出PRP可以将脐带间充质干细胞诱导为成纤维细胞；并且脐带间充质干细胞在bFGF和PRP的双重诱导下，可以更好的向成纤维细胞转化。
3.诱导为成纤维细胞的相关蛋白表达的ELISA定量分析，结果如表2所示，各实验组成纤维细胞相关蛋白的表达均高于对照组(间充质干细胞组)，且实验组3表达最高。
表2
从上述可以看出，脐带间充质干细胞在bFGF和PRP的双重诱导下，可以更好的向成纤维细胞转化。
上述各组细胞爬片免疫组化步骤如下：
(1)取出细胞爬片,用冷丙酮固定20分钟后，用PBS浸泡5分钟2次。
(2)打孔液浸泡2分钟后，用PBS洗涤2分钟×3次。
(3)与E-IR-R213A(3％H2O2)一起孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性，用PBS洗涤分钟×3次。
(4)甩干后将E-IR-R213D(Normal Goat Blocking Buffer)添加到片中，在37℃下孵育30分钟。
(5)用吸水纸擦干切片周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，加入适当稀释比例的一抗，4℃过夜后，用PBS清洗，2分钟×3次。
(6)加入E-IR-R213B(Helper)，室温孵育20分钟。用PBS洗涤，2分钟×3次。
(7)加入E-IR-R213C(Polyperoxidase-anti-Mouse/Rabbit IgG)，室温孵育20～30分钟。用PBS洗涤，2分钟×3次。
(8)1mL E-IR-R213F(DAB Substrate)中加入1滴E-IR-R213E(DAB Concentrate)，充分混合后滴加到细胞贴片上显色。
(9)离子水冲洗切片，终止显色反应，然后进行复染、脱水、透明化、封片等工序。
用ELISA法检测上述各组细胞成纤维细胞相关蛋白的含量的步骤如下：
用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每1×106个细胞中加入150～200μLPBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清用ELISA法检测各组成纤维细胞相关蛋白的含量；ELISA检测步骤参见各试剂盒说明书。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (19)

1.成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述成纤维细胞转化培养基用于诱导脐带间充质干细胞向成纤维细胞转化，所述成纤维细胞转化培养基包含血小板活性因子；
所述血小板活性因子按照如下方法制备得到：
a.去除脐带血中的红细胞，然后进行固液分离，分别获得细胞和血浆；
b.将a步骤获得的细胞进行凝血酶处理，然后反复冻融，固液分离后保留上清，制备得到血小板活性因子。
2.根据权利要求1所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述去除脐带血中的红细胞的方法包括离心；
所述离心的离心力为100～600g；
所述离心的时间为8～12min；
所述离心的温度为0～25℃；和/或，
a步骤中，所述固液分离包括离心或过滤；
所述离心的离心力为100～600g；
所述离心的时间为8～12min；
所述离心的温度为0～25℃；和/或，
b步骤中，所述固液分离包括离心或过滤；
所述离心的离心力为2500～3500g；
所述离心的时间为16～24min；
所述离心的温度为0～25℃。
3.根据权利要求2所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述去除脐带血中的红细胞的方法包括离心；
所述离心的离心力为300g；
所述离心的时间为10min；和/或，
a步骤中，所述固液分离包括离心或过滤；
所述离心的离心力为300g；
所述离心的时间为10min；和/或，
b步骤中，所述固液分离包括离心或过滤；
所述离心的离心力为3000g；
所述离心的时间为20min。
4.根据权利要求1所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述凝血酶处理为将a步骤获得的细胞与凝血酶溶液混合；
所述凝血酶溶液的浓度为800～1200U/mL；
所述细胞与凝血酶溶液混合的体积比为8:1～12:1；
所述凝血酶溶液为含有凝血酶的葡萄糖酸钙溶液；
所述凝血酶处理的时间为0.5～2h；
所述反复冻融为循环进行冷冻和解冻；
所述反复冻融的次数为4～8次。
5.根据权利要求4所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述凝血酶溶液的浓度为1000U/mL；
所述细胞与凝血酶溶液混合的体积比为10:1；
所述凝血酶处理的时间为1h；
所述冷冻的温度为-196～-20℃，冷冻的时间为5～10min；
所述解冻的温度为35～40℃，解冻的时间为5～10min；
所述反复冻融的次数为5次。
6.根据权利要求1-5任一项所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述成纤维细胞转化培养基还包括碱性成纤维细胞生长因子。
7.根据权利要求6所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述成纤维细胞转化培养基还包括：基础培养基、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清。
8.根据权利要求7所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述脐带血血清按照如下方法制备得到：先将脐带血35～37℃恒温放置，然后再放入2～6℃环境中以备离心，离心后分离血清，过滤后得到脐带血血清。
9.根据权利要求8所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述脐带血血清按照如下方法制备得到：先将脐带血37℃恒温放置2h，然后再放入4℃环境中4h以备离心，离心参数为1500rpm离心30min。
10.根据权利要求6所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述成纤维细胞转化培养基包括基础培养基、血小板活性因子、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度为：
磷酸维生素C的浓度为0.9～1.1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.03～0.05mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为8～12％，血小板活性因子的浓度为8～12％。
11.根据权利要求10所述的成纤维细胞转化培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM/F12；各物质在所述成纤维细胞转化培养基中的浓度为：
磷酸维生素C的浓度为1mmol/L；
脯氨酸的浓度为0.04mmol/L；
碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L；
按照体积百分比计，脐带血血清的浓度为10％，血小板活性因子的浓度为10％。
12.成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括：使用权利要求1-11任一项所述的成纤维细胞转化培养基培养脐带间充质干细胞，诱导脐带间充质干细胞转化为成纤维细胞。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞选自人脐带间充质干细胞。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞的制备方法包括：先使用脐带间充质干细胞培养基将脐带间充质干细胞制备成细胞悬液，接种于培养容器且细胞贴壁后更换为所述成纤维细胞转化培养基培养。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基、磷酸维生素C、脯氨酸和脐带血血清。
17.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，接种于培养容器24h后更换为所述成纤维细胞转化培养基培养。
18.权利要求1-11任一项所述的成纤维细胞转化培养基，或权利要求12-17任一项所述的成纤维细胞的制备方法在制备用于皮肤修复的产品中的应用。
19.用于皮肤修复的产品，其特征在于，包含权利要求1-11任一项所述的成纤维细胞转化培养基。
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