CN111000791A - 含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法 - Google Patents

含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法，包括如下步骤：制成脂肪干细胞悬液；初步扩增的脂肪干细胞；激活的脂肪干细胞；在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养；得到上清液；低温冷藏装置中冷藏储存12‑15小时；除去上清液，从而获得脂肪干细胞外泌体；制备含有脂肪干细胞外泌体的面膜。本发明具有加工成本低的优点。

Description

含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品领域，尤其是涉及一种加工成本低的含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法。
背景技术
脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞；具有易获取、来源充足、免疫排斥性低等特点。研究发现，脂肪干细胞主要是通过旁分泌而发挥修复作用的，其分泌的主要物质之一为外泌体。脂肪干细胞外泌体是一种直径介于50～150nm的亚细胞双层膜囊泡，其形成于内涵体小室，在与细胞质膜融合过程中释放到细胞外环境参与细胞间信息交流。脂肪干细胞外泌体不仅为皮肤修复提供了丰富的细胞来源，脂肪干细胞外泌体也被证实是促进创面愈合的重要物质之一。脂肪干细胞外泌体可以被成纤维细胞摄取，促进其迁移、增殖；并通过促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原合并，可以增加神经-钙黏素，增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的基因表达，以加速皮肤的修复和再生。脂肪干细胞外泌体还能通过调节成纤维细胞的分化程度来减轻皮肤瘢痕的形成。近年国内学者研究发现，脂肪干细胞外泌体在促进人成纤维细胞增值迁移及胶原沉积的过程中起到了至关重要的作用。现有分离的脂肪干细胞外泌体纯度不高、脂肪干细胞外泌体体外培养分泌量少的问题，脂肪干细胞外泌体加工价格高昂，极大地限制了脂肪干细胞外泌体在美容行业的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种外泌体加工成本低的含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法。
本发明的目的是采用如下技术方案实现：
一种含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法，包括如下步骤：
利用缓冲液清洗脂肪组织去除残留的血液和组织碎片，将清洗后的脂肪组织剪成小块，在震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，将脂肪细胞液置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，密封离心分离，去除上清液，制成脂肪干细胞悬液；
将脂肪干细胞悬液置于细胞激活培养基中进行激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；
将脂肪干细胞置于至少一种细胞培养基中加激活试剂进行脂肪干细胞悬液培养12-15小时，以便得到激活的脂肪干细胞；
将激活的脂肪干细胞从培养基中取出，加生理盐水清洗干净，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养；
将传代后的培养液离心除去细胞和细胞碎片，得到上清液；
将上清液、D-Hanks缓冲液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入低温冷藏装置中冷藏储存12-15小时；
将冷藏后的混合物离心，除去上清液，从而获得脂肪干细胞外泌体；
在洁净无菌的环境下，用全自动面膜灌装封口一体机，向装有折叠膜布的面膜包装袋内，定量灌装获得的脂肪干细胞外泌体，并封口，得含有脂肪干细胞外泌体的面膜。
可选的，所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。
可选的，所述细胞激活培养基中添加了哺乳动物血清。
可选的，所述哺乳动物血清为哺乳动物胎血清。
可选的，所述激活试剂为钙离子载体。
可选的，所述钙离子载体选自A23187或离子霉素。
可选的，所述激活试剂为腺病毒。
可选的，所述脂肪组织包括人体脂肪组织或动物脂肪组织。
可选的，所述膜布包括纳米纤维层。
可选的，所述低温保护剂为甘油。
可选的，所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。
本发明提供的含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法中的外泌体分泌量大，从而使产品加工成本低。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法，根据本发明待处理的脂肪组织可以是自体或其它动物上可接受的供体获得，首先利用缓冲液清洗脂肪组织去除残留的血液和组织碎片，在本实施例中使用D-Hanks缓冲液清洗，将清洗后的脂肪组织剪成小块，在震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液；并将脂肪细胞液置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，发明人发现利用前期在0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时能增加脂肪细胞液的活性，再密封离心分离，去除上清液，制成脂肪干细胞悬液；将脂肪干细胞悬液置于细胞激活培养基中进行激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；尽管可以在本发明的方法中可使用任何细胞激活培养基，但优选使用添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；在另一实施例中细胞激活培养基还可以添加哺乳动物血清，其中的哺乳动物血清优选为哺乳动物胎血清，例如胎牛血清，添加量为10％和15％左右。体外激活细胞最基本的营养物质是合适的培养基。这些培养基一般由生理盐水、氨基酸、维生素和其他化合物组成，它们可以直接地被细胞利用，优选RPMI1640培养基或无血清培养基AIM-V。培养基可以补充哺乳动物免疫血清，如胚胎牛免疫血清将脂肪干细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行脂肪干细胞培养12-15小时，以便得到激活的脂肪干细胞；在本发明的方法中可使用任何细胞培养基，但优选使用添加了钙离子载体的细胞培养基培养12-15小时，其中的钙离子载体选自A23187或离子霉素；在另一实施例中激活试剂也可以选择腺病毒。将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，在本发明实施例中优选经过二次的生理盐水清洗，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养，优选六代；将传代后的培养液离心除去细胞和细胞碎片，得到上清液；将上清液、D-Hanks缓冲液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，在本实施例中，低温保护剂选用甘油，先缓慢降至0℃后放入低温冷藏装置中冷藏储存12-15小时；将冷藏后的混合物离心，除去上清液，从而获得脂肪干细胞外泌体；在洁净无菌的环境下，用全自动面膜灌装封口一体机，向装有折叠膜布的面膜包装袋内，为了提高膜布的吸附量，本实施例膜布包括有纳米纤维层。
培养温度例如在30和42℃之间。在其他实施方案中，在32和40℃之间，或在37和38℃之间，或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。
本发明涉及的含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法的制备方法。本发明人发现当在其中加入钙离子载体或腺病毒后，被激活的脂肪干细胞进入人体后可以激发外泌体的分泌量，是其它培养方式分泌量的2-3倍。通过使脂肪干细胞与有激活试剂接触，可以激活这些脂肪干细胞，被激活的脂肪干细胞具有可以激发分泌的功能水平，并通过进一步传代培养使其外泌体的分泌量进一步增多。
钙离子载体是一种特殊金属离子物质，它可以自由通过脂质双分子层和可溶性脂质。有两种离子载体：载体或通道形成的离子，像腺病毒为载体，在特殊的离子周围形成一个像笼状般的结构，可以在疏水性双分子层疏水区进行自由扩散；通道形成的离子，如革兰氏阳性菌，在双层分子膜中形成连续的液体的极面，允许离子扩散通过。另外，除了上述所述的载体外，本发明适合的离子载体包括钙离子载体A23187(钙霉素)、钠盐、镁盐等。如钙离子载体A23187，这些载体能够对PH梯度的变化作出反应，以聚集钙离子。钙离子载体A23187具有一个酸性羧基团，它可以在整个生物膜中与其他阳离子进行交换，当离子交换完成之后，则回到膜的另一端。离子载体的有效浓度在0.05-0.5ug/毫升，离子载体的有效浓度是脂肪干细胞激活的有效浓度。
上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种含有脂肪干细胞外泌体的面膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
利用缓冲液清洗脂肪组织去除残留的血液和组织碎片，将清洗后的脂肪组织剪成小块，在震荡箱中消化20min～60min，然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，将脂肪细胞液置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，密封离心分离，去除上清液，制成脂肪干细胞悬液；
将脂肪干细胞悬液置于细胞激活培养基中进行激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的脂肪干细胞；
将脂肪干细胞置于至少一种细胞培养基中加激活试剂进行脂肪干细胞悬液培养12-15小时，以便得到激活的脂肪干细胞；
将激活的脂肪干细胞从培养基中取出，加入生理盐水清洗干净，然后加入酶液消化处理，在脂肪干细胞长到80％～90％融合后传三到六代培养；
将传代后的培养液离心除去细胞和细胞碎片，得到上清液；
将上清液、D-Hanks缓冲液、低温保护剂三者的体积百分比2～4:2～4:1进行混合，先缓慢降至0℃后放入低温冷藏装置中冷藏储存12-15小时；
将冷藏后的混合物离心，除去上清液，从而获得脂肪干细胞外泌体；
在洁净无菌的环境下，用全自动面膜灌装封口一体机，向装有折叠膜布的面膜包装袋内，定量灌装获得的脂肪干细胞外泌体，并封口，得含有脂肪干细胞外泌体的面膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞激活培养基中添加了哺乳动物血清。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述哺乳动物血清为哺乳动物胎血清。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述激活试剂为钙离子载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述钙离子载体选自A23187或离子霉素。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述激活试剂为腺病毒。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述脂肪组织包括人体脂肪组织或动物脂肪组织。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述膜布包括纳米纤维层。
10.如权利要求1所述的一种用于美容保养的脂肪干细胞液的制备方法，其特征在于：所述低温保护剂为甘油。
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