CN108265023B - 一种增殖促进剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增殖促进剂及其应用，具体涉及能够促进成纤维细胞增殖的成纤维细胞增殖促进剂，及通过成纤维细胞制备得到的成纤维细胞提取物和成纤维细胞提取物冻干粉，所述增殖促进剂包括丝瓜皂苷和/或苦瓜皂苷。本发明在皮肤成纤维细胞的培养中采用了丝瓜皂苷和苦瓜皂苷组合诱导剂，有效促进了皮肤成纤维细胞源性的生物活性物质的合成和分泌，增加细胞衍生产物中有效成分的含量，提高了生产效率和皮肤成纤维细胞源性细胞衍生产物的生物学功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域，涉及一种增殖促进剂及其应用，具体涉及能够促进成纤维细胞增殖的成纤维细胞增殖促进剂，及通过成纤维细胞制备得到的成纤维细胞提取物和成纤维细胞提取物冻干粉。
背景技术
目前，各类护肤品主要以化学成分为主，再辅以植物提取物和其他营养物质制备而成，虽具有一定的效果，但因其安全性或有效性问题，具有很大局限性。由此基于安全性、功能性和自然性的“绿色护肤品”成为当前发展的趋势。
以皮肤成纤维细胞为基础资源，发挥细胞所含的生物活性物质(例如胶原蛋白、细胞因子、氨基酸、维生素等)，已被医学或生物学等领域的专业人员所广泛研究和应用实践。这些生物活性成分通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，能够有效活化细胞、促进细胞分裂、促进皮下新血管生成及胶原蛋白的分泌，从而促进皮肤的生长，再生和修复。例如，胶原蛋白能够促进多种细胞的迁移，加速创面愈合速度；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对创伤修复涉及的神经纤维化、血管和再上皮化具有调控作用，可促进皮肤创面的损伤愈合和减少疤痕的形成；转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等细胞因子能够促进上皮细胞的增殖和分化，调节细胞新成代谢，促进细胞基质(例如胶原蛋白、细胞粘附因子、纤维连接蛋白等)的合成，补充皮肤所必需养分；角质细胞生长因子(KFG)在辐射损造成的上皮细胞损伤修复方面具有重要的作用。
既往，皮肤成纤维细胞常以新鲜制备的皮肤成纤维细胞，独立或与其他成分(如角质细胞、黑色素瘤细胞、人富血小板血浆)混合通过皮下注射给药，发挥细胞生物学活性和自分泌营养因子的功能。CN104611289A公开了一种人表皮细胞和成纤维细胞同时制备的方法及其生物美容产品，通过酶消化法制备人的皮肤成纤维细胞并与人的富含血小板血浆混合，生产出含有自体活细胞的生物美容产品。基于此类的技术方案，多采用有创或微创的方式给药(如手术植入、注射等)。这种技术具有局限性，一方面由给药方式所引发的不良反应或风险恐难以避免，如感染、红肿、疼痛等；另一方面，其适用的领域亦可能相应受限，例如更适用于专业机构。
当前，以细胞条件培养基或细胞裂解物制备的细胞精华液、冻干粉或其他生物制剂已常被报道，CN103908424A公开的一种用于美容保养的精华液及其制备方法和CN103393585B公开的一种用于美容保养的成纤维细胞液的制备方法，以上两个专利通过培养成纤维细胞，收集细胞条件培养基，加入甘油等冻干赋形剂及细胞因子，制备成皮肤保养的精华液，具有促进表皮细胞新陈代谢的作用。为了避免异种来源的蛋白质可能导致的过敏、免疫排斥等反应的发生，CN10326984A公开的局部皮肤制剂，其开发了含有从自体皮成纤维细胞培养物获得的条件培养基的自体局部制剂，再将其应用于凝胶、乳膏、洗剂和软膏的制备。基于此类的技术方案，它克服了一些早期技术方案的局限，例如更适宜长期储存，采用外用方式(例如采用涂抹或者喷雾)更有利于推广和应用。但是一方面细胞自然分泌的生物活性物质含量有限，另一方面这些生物活性的透皮吸收多未被考虑，导致其功能和生物活性受到很大限制。
许多天然化合物如皂苷因其在调整皮肤成纤维细胞功能方面(例如促进细胞增殖，促进胶原蛋白，细胞因子的合成和分泌等)作用越来越受关注，并己在化妆品中得到应用。苦瓜皂苷是一种从苦瓜果实分离提取的甾体类化合物，研究表明苦瓜皂苷在体内具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、降低胆固醇、抗艾滋病毒和抗肿瘤等生理功能。但是对于苦瓜皂苷在诱导皮肤成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白和细胞因子等生物活性物质的研究方面，目前暂无相关文献报道。同时，丝瓜提取物能够提高人皮肤成纤维细胞活性并具有明显的抗氧化作用，但对于将丝瓜皂苷应用于皮肤成纤维细胞的培养和诱导暂未见报道。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供一种增殖促进剂及其应用，具体涉及能够促进成纤维细胞增殖的成纤维细胞增殖促进剂，及通过成纤维细胞制备得到的成纤维细胞提取物和成纤维细胞提取物冻干粉，所述成纤维细胞提取物冻干粉及其组合物具有促进皮肤或毛发新生、促进创伤修复、抗皮肤光老化和和减少疤痕形成等生物学功效。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种增殖促进剂，所述增殖促进剂包括丝瓜皂苷和/或苦瓜皂苷。
本发明用丝瓜皂苷和/或苦瓜皂苷用于培养成纤维细胞，有效促进了成纤维细胞的表达和分泌胶原蛋白和天然细胞因子，增加细胞衍生产物中有效成分的含量，有利于提高皮肤成纤维细胞源性的生物活性(如I型胶原蛋白和BFGF、PDGF、VEGF、TGF-β细胞因子)的产量，提高了生产效率和皮肤成纤维细胞源性细胞衍生产物的生物学功效。
根据本发明，发明人发现采用丝瓜皂苷和苦瓜皂苷的混合物进行成纤维细胞增殖的效果好于采用单个皂苷进行增殖，丝瓜皂苷和苦瓜皂苷协同作用，共同促进成纤维细胞的表达。
优选地，所述丝瓜皂苷的质量浓度为5-20μg/mL，例如可以是5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL，优选为8-20μg/mL，最优选为10μg/mL，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述苦瓜皂苷的质量浓度为10-100μg/mL，例如可以是10μg/mL、12μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、23μg/mL、25μg/mL、28μg/mL、30μg/mL、32μg/mL、35μg/mL、38μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL、55μg/mL、58μg/mL、60μg/mL、62μg/mL、65μg/mL、68μg/mL、70μg/mL、72μg/mL、75μg/mL、78μg/mL、80μg/mL、82μg/mL、85μg/mL、88μg/mL、90μg/mL、92μg/mL、95μg/mL、98μg/mL或100μg/mL，优选为30-70μg/mL，进一步优选为40-60μg/mL，最优选为50μg/mL，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
作为最优选的技术方案，所述增殖剂效果最好的是采用50μg/mL苦瓜皂苷和10μg/mL丝瓜皂苷的混合物。
第二方面，本发明提供一种成纤维细胞提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备成纤维细胞；
(2)将步骤(1)制备得到的成纤维细胞转接入添加有如第一方面所述的增殖促进剂的培养基中培养，离心收集上清；
(3)将步骤(2)培养的成纤维细胞加入消化酶消化后，离心，收集成纤维细胞超声破碎，得到成纤维细胞裂解液；
(4)将步骤(2)的上清液和步骤(3)的裂解液过滤、浓缩、除菌得到成纤维细胞提取物。
根据本发明，所述成纤维细胞来自皮肤、骨髓、肌肉或肾脏中的任意一种或至少两种的组合，优选为皮肤。
优选地，步骤(1)所述的制备成纤维细胞包括如下具体步骤：采集组织样本，对组织样本进行预处理，采用酶消化的方法获得成纤维细胞进行培养，每2-4天，优选3天更换一次细胞培养液；待细胞融合度达到80-90％时，按1:(1-5)，优选1:3的比例进行传代培养，获得皮肤成纤维细胞系。
根据本发明，所述预处理先用高浓度的青霉素和链霉素清洗是为了保证皮肤样本的无菌，而低浓度的青霉素和链霉素则是一般性清洗样本，洗掉多余的抗生物，以免对后续细胞的培养造成影响，所述预处理包括如下步骤：采用含有1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次，再采用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次。
优选地，所述酶消化包括如下具体步骤：采用质量体积比为0.1-0.5％，优选为0.25％的中性蛋白酶37℃消化1-4小时，优选2小时，分离真皮、表皮；收集真皮，采用质量体积比为0.05-0.3％，优选0.1％的Ⅳ型胶原酶37℃消化1-4小时，优选2小时。
优选地，步骤(2)所述的成纤维细胞为传代次数3-6代的成纤维细胞。
优选地，步骤(2)所述的成纤维细胞为生长至70-80％融合时进行转接培养。
优选地，步骤(2)所述的培养基为无酚红DMEM高糖液体培养基。
优选地，步骤(2)所述的培养基中还包括血清替代物。
优选地，所述血清替代物占所述培养基的体积百分比为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、15％、16％、18％或20％，优选为8-15％，进一步优选为10％，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述丝瓜皂苷的质量浓度为5-20μg/mL，例如可以是5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL，优选为8-20μg/mL，最优选为10μg/mL，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述苦瓜皂苷的质量浓度为10-100μg/mL，例如可以是10μg/mL、12μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、23μg/mL、25μg/mL、28μg/mL、30μg/mL、32μg/mL、35μg/mL、38μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、45μg/mL、48μg/mL、50μg/mL、52μg/mL、55μg/mL、58μg/mL、60μg/mL、62μg/mL、65μg/mL、68μg/mL、70μg/mL、72μg/mL、75μg/mL、78μg/mL、80μg/mL、82μg/mL、85μg/mL、88μg/mL、90μg/mL、92μg/mL、95μg/mL、98μg/mL或100μg/mL，优选为30-70μg/mL，进一步优选为40-60μg/mL，最优选为50μg/mL，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述离心的转速为800-1500rpm，例如可以是800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm，优选为1300rpm。
优选地，所述离心的时间为3-8分钟，例如可以是3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟或8分钟，优选为5分钟，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤(3)所述的消化为加入质量体积比为0.1-0.5％，优选为0.25％的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1-4小时，例如可以是1小时、2小时、3小时或4小时，优选2小时。
优选地，所述离心的转速为800-1500rpm，例如可以是800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm，优选为1300rpm，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述离心的时间为3-8分钟，例如可以是3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟或8分钟，优选为5分钟，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述超声破碎的条件为1-5℃，100-200W，超声1-4s，间隔3-6s，80-100个循环，优选为4℃，150W，超声2s，间隔4s，99个循环。
优选地，步骤(4)所述过滤的滤膜孔径为0.2-0.6μm，例如可以是0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.28μm、0.3μm、0.32μm、0.35μm、0.38μm、0.4μm、0.42μm、0.45μm、0.48μm、0.5μm、0.52μm、0.55μm、0.58μm或0.6μm，优选为0.45μm，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述浓缩采用超滤离心管进行离心浓缩。
优选地，所述超滤离心管的截留分子量为1-5KD，例如可以是1KD、2KD、3KD、4KD或5KD，优选为3KD，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述浓缩为浓缩到原体积的1/10-1/5，例如可以是1/10、1/9、1/8、1/7、1/6或1/5，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述除菌采用过滤除菌。
优选地，所述过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。
作为优选技术方案，一种成纤维细胞提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备皮肤成纤维细胞：采集组织样本，对组织样本进行预处理：采用含有1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次，再采用含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次，采用采用质量体积比为0.1-0.5％的中性蛋白酶37℃消化1-4小时，分离真皮、表皮；收集真皮，采用质量体积比为0.05-0.3％的Ⅳ型胶原酶37℃消化1-4小时的方法获得成纤维细胞进行培养，每2-4天更换一次细胞培养液；待细胞融合度达到80-90％时，按1:(1-5)的比例进行传代培养，获得皮肤成纤维细胞系；
(2)将步骤(1)制备得到的传代次数3-6代的成纤维细胞生长至70-80％融合时转接入添加有如第一方面所述的增殖促进剂，所述增殖促进剂为50μg/mL苦瓜皂苷和10μg/mL丝瓜皂苷的混合物，所述培养基为无酚红DMEM高糖液体培养基中培养，所述培养基还含有5-20％的血清替代物，800-1500rpm离心3-8分钟收集上清；
(3)将步骤(2)培养的成纤维细胞加入质量体积比为0.1-0.5％的胰蛋白酶-EDTA37℃消化1-4小时后，800-1500rpm离心3-8分钟，收集成纤维细胞超声破碎，破碎调节：1-5℃，100-200W，超声1-4s，间隔3-6s，80-100个循环，得到成纤维细胞裂解液；
(4)将步骤(2)的上清液和步骤(3)的裂解液在滤膜孔径为0.2-0.6μm过滤、采用截留分子量为1-5KD的超滤离心管离心浓缩到原体积的1/10-1/5，过0.22μm的滤膜除菌得到成纤维细胞提取物。
第三方面，本发明提供如第二方面所述的制备方法制备得到的成纤维细胞提取物。
第四方面，本发明提供一种成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，所述方法包括将如第三方面所述的成纤维细胞提取物制备为冻干粉剂。
本发明中，所述制备得到的皮肤成纤维细胞提取物冻干粉相比于现有技术中的精华液或是其他形式的美容产品，具有其生物活性成分性质稳定，保存期较长，生物活性物质不易降解、不易失效等优点，其还含有细胞生长因子、胶原蛋白、氨基酸、维生素等多种生物活性物质，这些生物活性物质具有促进皮肤或毛发新生、促进创伤修复、抗皮肤光老化和和减少疤痕形成等生物学功效。
优选地，所述方法包括如下具体步骤：向成纤维细胞提取物中加入冻干赋形剂，过滤除菌，分装进行真空冷冻干燥，得到成纤维细胞提取物冻干粉。
根据本发明，所述冻干赋形剂为甘露糖醇、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、人血白蛋白中的任意一种或至少两种的混合物，优选为甘露糖醇和人血白蛋白的混合物，采用上述混合物的赋形剂对细胞因子的保护效果更佳。
优选地，所述冻干赋形剂的质量体积浓度为1-20％，例如可以是1％、2％、3％、5％、6％、8％、10％、12％、13％、15％、16％、18％或20％，优选为1-15％，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述冻干赋形剂为质量体积浓度5-15％的甘露糖醇和质量体积浓度1-5％的人血白蛋白的混合物。
优选地，所述向成纤维细胞提取物中加入冻干赋形剂后成纤维细胞提取物的蛋白浓度为50-600μg/mL，例如可以是50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL或600μg/mL，优选为200-600μg/mL，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。
优选地，所述真空冷冻干燥的条件为-45～-60℃，真空度5-15Pa，干燥20-50小时，优选为-50℃，真空度10Pa，干燥24-48小时。
本发明中，所述成纤维细胞提取物冻干粉采用5mL的无菌西林瓶进行分装，分装体积为1-3mL/瓶，其中每瓶成纤维细胞提取物冻干粉的I型胶原蛋白含量不低于30ug/瓶，总细胞因子含量优选为大于5000pg/瓶，其中转化生长因子(TGF)含量不低于2500pg，人血小板衍生生长因子(PDGF)含量不低于3500pg，人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量不低于80pg。
作为优选技术方案，所述成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，包括如下步骤：向成纤维细胞提取物中加入质量体积浓度5-15％的甘露糖醇和质量体积浓度1-5％的人血白蛋白的混合物的冻干赋形剂，加入冻干赋形剂后所述成纤维细胞提取物的蛋白浓度为50-600μg/mL，0.22μm的滤膜过滤除菌，5mL西林瓶分装1-3mL/瓶进行真空冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为-45～-60℃，真空度5-15Pa，干燥20-50小时，得到成纤维细胞提取物冻干粉。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的制备方法制备得到的成纤维细胞提取物冻干粉。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含如第五方面所述的成纤维细胞提取物冻干粉和溶媒。
本发明中，所述组合物形成的溶液采用涂抹或喷雾等方式外用，具有促进细胞的增殖和分化，调节细胞新成代谢，预防和减少疤痕形成等生物学功效。
根据本发明，所述溶媒用于溶解所述的成纤维细胞提取物冻干粉并增强其生物学效应，进一步的，本发明所述的溶媒的有利于促进吸收和增强相关生物学效应，所述溶媒包括无菌水、保湿剂或透皮吸收剂中的任意一种或至少两种的混合物，优选为无菌水、保湿剂和透皮吸收剂的混合物。
优选地，所述保湿剂的质量体积浓度为0.01-5％，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.06％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述保湿剂包括丙三醇、丙二醇或透明质酸中的一种或至少两种的混合物，优选为丙三醇、丙二醇和透明质酸的混合物。
优选地，所述保湿剂为质量体积浓度1-5％的丙三醇、质量体积浓度1-5％的丙二醇和质量体积浓度0.01-1％的透明质酸的混合物。
优选地，所述透皮吸收剂的质量体积浓度为0.01-1％，例如可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.06％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.6％、0.8％或1％，及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述透皮吸收剂为薄荷醇。
第七方面，本发明提供如第三方面所述的成纤维细胞提取物和/或如第五方面所述的成纤维细胞提取物冻干粉用于创面组织修复及皮肤修复和护理。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在皮肤成纤维细胞的培养中采用了丝瓜皂苷和苦瓜皂苷组合诱导剂，有效促进了皮肤成纤维细胞源性的生物活性物质的合成和分泌，增加细胞衍生产物中有效成分的含量，提高了生产效率和皮肤成纤维细胞源性细胞衍生产物的生物学功效；
(2)本发明所提供的皮肤成纤维细胞提取物冻干粉含有细胞生长因子、胶原蛋白、氨基酸、维生素等多种生物活性物质，具有促进皮肤或毛发新生、促进创伤修复、抗皮肤光老化和和减少疤痕形成等生物学功效；
(3)通过对皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的稳定性和安全性进行检测，结果显示，人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉性质稳定、功效显著，不易突变，动物试验证明其无毒性，使用安全可靠；
(4)本发明提供的含成纤维细胞提取物冻干粉的组合物，由冻干粉和溶媒两部分组成，具有性质稳定、储存期长等特点，更有利于促进细胞因子等生物活性物质的保存和皮肤的吸收，可广泛应用于临床创面修复愈合及皮肤美容保养和有更好的推广和应用前景；
(5)本发明取材方便，原料来源充足，皮肤组织的采集简便易行，通过一次采集皮肤组织，存储皮肤成纤维细胞，可满足多次使用需求。皮肤成纤维细胞增殖能力强，培养后数目可达1×109以上，由此提取的皮肤成纤维细胞提取物数量充足，可满足长期的皮肤美容保养需求。
附图说明
图1为本发明人皮肤成纤维细胞流式分析结果，其中，图1(a)为细胞阳性表达FSP1，图1(b)为Vimentin(波形蛋白)皮肤成纤维细胞特征性表面抗原；
图2为本发明人皮肤成纤维提取物冻干粉细胞增殖活性实验结果；
图3为本发明人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对超氧化物歧化酶活性影响；
图4为本发明人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对谷胱甘肽氧化酶活性影响；
图5为本发明人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对细胞迁移的影响；
图6为本发明人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉稳定性实验结果，其中，图6(a)为外观结果，图6(b)为溶解性结果；
图7为本发明含人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的美容护肤精华液。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
酶联免疫分析试剂盒：购自R&D Biosciences；
超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒：Cayman；
C57小鼠：广东省动物实验中心；
成年白色家兔：广东省动物实验中心。
实施例1：皮肤成纤维细胞的原代分离、培养、传代及鉴定
(1)皮肤成纤维细胞的原代分离、培养、传代
碘酒擦拭皮肤，皮下注射微量麻醉剂后，由专业医务人员用医用皮肤取样器取皮肤组织，得到大小约直径3mm的皮肤块，经检验检疫合格后(证实无HIV、HBV等传染性疾病)，将皮肤置于含1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的PBS溶液中，充分洗去组织块上的血迹，适当剪掉结蒂组织并把剩下皮肤组织剪成4-8块，再将组织块转移至含有含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的PBS溶液的培养皿中充分洗涤；将皮肤组织块剪碎转移至15mL离心管中，加入1-2mL质量体积比为0.25％的中性蛋白酶37℃消化1-3小时，分离表皮和真皮组织，将真皮收集至15mL离心管中，用0.1％-0.5％Ⅳ型胶原酶37℃消化1-3小时，去掉胶原酶，PBS清洗，离心收集皮肤成纤维细胞。加入含有体积分数10％血清替代物的无酚红DMEM高糖培养基(含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，充分吹匀后移入37℃，5％CO2，100％湿度的细胞培养箱中培养，每3天补加新鲜的细胞培养液。约14天后细胞生长达约80-90％融合时，使用胰酶消化液(0.25％(w/w)胰蛋白酶+0.02％(w/w)EDTA)消化细胞，按5000-6000cell/cm2传代培养，记为P1代皮肤成纤维细胞，以后均按照以上方法传代培养。
(2)人皮肤成纤维细胞鉴定
收集P3代细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原，检测得到细胞阳性表达FSP1和Vimentin皮肤成纤维细胞特征性表面抗原，结果如图1所示，与文献报告的皮肤成纤维细胞特征一致，说明所分离培养细胞为人皮肤成纤维细胞。
实施例2：成纤维细胞提取物冻干粉制备流程
(1)人皮肤成纤维细胞提取物溶液的制备
将生长状态良好的人皮肤成纤维细胞用T-175培养瓶传代扩增，培养液为含10％(v/v)血清替代物的无酚红DMEM高糖培养基(青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，pH7.2)。待细胞融合度达到80％-90％后，使用胰酶消化液(0.25％(w/w)胰蛋白酶+0.02％(w/w)EDTA)消化细胞，按5000-6000cell/cm2传代培养。当细胞传代至P6-P8代时，停止传代培养，收集各代次的皮肤成纤维细胞上清液，-80℃保存，待处理。采用胰酶消化，离心收集皮肤成纤维细胞进行超声破碎，超声破碎条件为：4℃，400W，超声3s，间隔4s，99个循环。将超声破碎完成后细胞裂解液在12000rpm，4℃条件下离心10min，收集细胞裂解上清液。将多次收集的人皮肤成纤维细胞培养上清液从-80℃取出，置于室温解冻，与细胞裂解上清液混合，即为所得的皮肤成纤维细胞提取物原溶液。
(2)人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的制备
将制备的人皮肤成纤维细胞提取物原溶液采用0.45μm滤器过滤，再采用截留分子量为3KD的超滤离心管对人皮肤成纤维细胞提取物有原液进行浓缩，直至剩余的体积约为原体积的1/5～1/10为止。测定人皮肤成纤维细胞提取物蛋白浓度，根据测定的人皮肤成纤维细胞提取物的蛋白浓度，调节蛋白质浓度至600μg/mL。加入5-10％(m/v)冻干赋形剂甘露糖醇并采用0.22μm滤膜进行过滤除菌，按1mL/瓶分装至无菌的5mL西林瓶中，然后移至-80℃冰箱过夜预冻，次日在-50℃，10Pa条件下真空冷冻干燥24-48小时，制备获得人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉。最终制备的人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉蛋白的含量为600μg/瓶。
实施例3：丝瓜皂苷和苦瓜皂苷组合物对皮肤成纤维细胞胶原合成、细胞因子分泌的影响
取经过鉴定，生长状态良好的P3-P5代皮肤成纤维细胞进行培养，收集细胞调整细胞密度为5×104cell/mL，接种细胞至六孔板中，每孔2mL。细胞培养24h后去掉原培养液，按照表1所示加入含有丝瓜皂苷和苦瓜皂苷组合刺激物的皮肤成纤维细胞培养基进行培养。待细胞培养3天后，收集各组的细胞培养上清液。采用人I型胶原蛋白(Collagen I)、人转化生长因子(TGF-β)、人血小板衍生生长因子(PDGF-AB)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)酶联免疫分析试剂盒，按照试剂盒说明书标准步骤对人皮肤成纤维细胞分泌的胶原蛋白和主要的细胞因子含量进行测定。
结果如表2所示，与空白对照组相比，加入丝瓜皂苷或苦瓜皂苷的实验组均能促进人皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白的合成和TGF、PDGF、bFGF等细胞因子的分泌。在含有10μg/mL的丝瓜皂苷和50μg/mL苦瓜皂苷的组合物对皮肤成纤维细胞胶原合成和细胞因子的分泌促进效应最为显著，Collagen I、TGF、PDGF、bFGF的浓度分别达到了220.15±5.28μg/mL、9547.26±144.41pg/mL、580.31±30.52pg/mL、100.90±7.34pg/mL，显著高于10μg/mL的丝瓜皂苷或者50μg/mL苦瓜皂苷的单一实验组中生物活性成分的浓度。
表1.皂苷组合物对皮肤成纤维细胞胶原和细胞因子分泌影响实验设计
表2.不同实验组胶原分泌和细胞因子分泌Elisa检测结果
实施例4：CCK-8法检测皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对细胞增殖活力的影响
采用标准的皮肤成纤维细胞系，收集对数期细胞，用含10％FBS的DMEM高糖培养基配制细胞悬液，调整细胞密度为5×104cell/ml细胞悬液，将细胞接种至96孔培养板内，每孔100μL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养；细胞培养24h后去掉原培养液，各组分别加入蛋白终浓度为20μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL人皮肤成纤维细胞提取物的DMEM培养培养基(含1％(v/v)胎牛血清)100μL。设含1％胎牛血清的DMEM高糖培养基100μL为培养基对照组。放入37℃，5％CO2培养箱中分别培养24h、72h，每处理组分别设复孔6孔，置于含5％(V/V)CO2、37℃的恒温培养箱内分别培养72小时；到相应时间点后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养1-4h，终止培养，在免疫酶标仪上以490nm波长测定吸光度。按照下列公式计算细胞相对活率(RGR)：RGR(％)＝实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值×100。
表3细胞增殖毒性判定标准
试验结果如表3和图2所示，人皮肤成纤维细胞提取物对皮肤成纤维细胞作用72小时后，没有细胞毒性作用，反而具有促进皮肤成纤维细胞增殖的作用。与对照组(control)相比，在蛋白浓度为20-200μg/mL人皮肤成纤维细胞提取物浓度之间，随着人皮肤成纤维细胞提取物浓度的增高，在200μg/mL的浓度时，其促细胞生长的作用最明显，能够有效增加成皮肤纤维细胞增殖活性增加10％以上。
实施例5：细胞划痕试验检测人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对细胞迁移的影响
收集对数期细胞，用含10％FBS的DMEM高糖培养基配制细胞悬液，调整皮肤成纤维细胞密度为5×104cell/ml细胞悬液，将细胞接种至六孔培养板内，每孔2mL，置于含5％CO2、37℃的恒温培养箱内培养。细胞融合度大于80％后，用1ml枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。各组分别加入100μg/mL，200μg/mL人成纤维细胞提取物的DMEM培养培养基(含10％(v/v)胎牛血清)2mL，设含1％胎牛血清的DMEM高糖培养基2mL为培养基对照组。放入37℃，5％CO2培养箱中分别培养6h、24h，拍照记录，根据收集图片数据分析实验结果。
实验结果如图5所示，与对照组(control)相比，100μg/mL和200μg/mL的人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对皮肤成纤维细胞的迁移均具有明显的促进作用，可以促进皮肤成纤维细胞迁移速度增加2倍以上。
实施例6：人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉对氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽酶活性检测
收集生长状态良好的皮肤成纤维细胞，采用含有0.1％FBS的皮肤成纤维细胞培养基悬浮细胞，接种至六孔板中，每孔接种1×105细胞。细胞培养24h后去掉原培养液，各组分别加入蛋白浓度为20μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL人皮肤成纤维细胞提取物的DMEM培养培养基(含1％FBS)。设含1％胎牛血清的DMEM高糖培养基100μL为培养基对照组，设含有100μM/mL的维生素C作为阳性对照组。细胞继续培养12小时后，去掉培养基，加入200μM的tbOOH处理3小时。离心收集皮肤成纤维细胞，加入遇冷的细胞裂解液进行超声破碎，超声破碎完成后在4℃，10000×g离心10分钟，收集上清液。采用超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒根据试剂盒说明书测定其酶活性。
实验结果如图4所示，人皮肤成纤维细胞冻干粉处理组能够增加皮肤成纤维细胞的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽酶活性。与空白对组组(control)相比，人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉在200μg/mL浓度时，对皮肤成纤维细胞的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽酶活性最显著，分别诱导增加了1.7倍和2.3倍。
实施例7：人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉小鼠急性经口毒性试验
根据前期体外实验的结果，人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉基本无毒，因此采用一次限量法检测其对生物体的安全性，即一次最大灌胃剂量采用其10倍实效标示药量(600士5μg/支×10支)的受试物对10只广东省实验动物中心购买的C57小鼠进行灌胃，观察14天，记录其毒性反应，当未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性经口毒性试验。
试验结果显示未观察到试验动物有任何不良反应或动物死亡。
实施例8：人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的家兔皮肤光毒性试验
采用购买广东省动物实验中心的成年白色家兔10只，在试验前18～24小时，将家兔脊柱两侧皮肤去毛，准备4块面积约为2cm×2cm的去毛区，分别编号去毛区1、2、3、4，试验安排如表4所示。将动物固定，在动物的去毛区1和2分别涂敷1mL含600μg/mL受试物水溶液；30min后，左侧(去毛区1和3)用铝箔片覆盖，胶带固定，右侧用波长为320nm-400nm的UVA照射1.5小时，结束后分别于24、48和72h观察记录皮肤刺激反应。
表4家兔去毛区试验安排
| 去毛区编号 | 试验方法 |
| 1 | 涂抹人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉水溶液，不照射 |
| 2 | 涂抹人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉水溶液，照射 |
| 3 | 不涂抹人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉水溶液，不照射 |
| 4 | 不涂抹人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉水溶液，照射 |
试验结果显示10只受试白色家兔在处理后皮肤24、48和72h均未观察到皮肤刺激反应，表明本发明的人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉无光毒性反应。
实施例9：人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉稳定性检测试验
随机选择18瓶人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉，分成6个试验组，每组3瓶。将人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉分别置于-80℃、-20℃、4℃、常温(20-22℃)、35℃、60℃条件下14天进行长期稳定性考察，检测项目为人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的外观、溶解度和澄清度。
表5人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉稳定性试验
试验结果如表5和图6(a)-图6(b)所示，从左至右的条件依次是-80℃、-20℃、4℃、常温(20-22℃)、37℃、60℃。在过高的温度(35℃和60℃)条件下保存人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉，会导致人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的外观发生变化，溶解度变差，溶解后液体变浑浊。而在其他条件下，人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的外观，溶解性均未发生明显变化，澄清度较好。
实施例10：含人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的皮肤美容保养精华液
本实施例制备的皮肤美容保养精华液是一种包含实施例2制备的皮肤纤维细胞提取物冻干粉和溶媒的组合物。其中溶媒的制备工艺包括如下步骤：按照表6所示，在水中加入各组分，搅拌均匀，采用0.22μm滤膜过滤除菌，按照3mL/瓶分装至5mL无菌西林瓶中，压盖，置于低温干燥处保存。
如图7所示，在使用时，取制备的含人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉一瓶，加入配制的3ml专用溶媒进溶解，装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，制备成皮肤美容保养精华液。
表6溶媒配方表
去皱试验：招募40名年龄在30-45岁的受试者(签署知情同意书)，随机分为两组，男女各半。实验组涂抹含有人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉和专用溶媒组成的美容保养精华；对照组涂抹只含有冻干赋形剂制备的冻干粉和溶媒。每天早晚使用相应样品2次，连续使用4周，然后评价皮肤在去皱、嫩肤等方面的改善效果。
祛斑试验：招募40名年龄在20-35岁面部有色斑的受试者(签署知情同意书)，随机分为两组，男女各半。实验组涂抹含有人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉和专用溶媒组成的美容保养精华；对照组涂抹只含有冻干赋形剂制备的冻干粉和溶媒。每天早晚使用相应样品2次，连续使用4周，然后评价皮肤在祛斑等方面的改善效果。
表7人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉去皱、嫩肤实验结果
表8人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉祛斑实验结果
由表7和表8可以看出，涂抹人皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的受试区域对皮肤的弹性、祛斑、去皱等改善效果显著，具有良好的嫩肤去皱美容保养的效果；而涂抹不含皮肤成纤维细胞提取物冻干粉的空白对照区域，对皮肤的弹性、去皱等方面没有效果。
因此，本发明制备的人皮肤美容保养精华液皮具有多种生物活性成分，可使肌肤状态明显改善，纹路变细，皮肤变得光滑、弹性，是一种使用方便，安全，操作简单的生物护肤品，值得推广应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (22)
1.一种增殖促进剂，其特征在于，所述增殖促进剂由丝瓜皂苷和苦瓜皂苷组成；所述丝瓜皂苷的质量浓度为5-20μg/mL，所述苦瓜皂苷的质量浓度为10-100μg/mL。
2.根据权利要求1所述的增殖促进剂，其特征在于，所述丝瓜皂苷的质量浓度为10μg/mL；所述苦瓜皂苷的质量浓度为50μg/mL。
3.一种成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备成纤维细胞；
（2）将步骤（1）制备得到的成纤维细胞转接入添加有如权利要求1或2所述的增殖促进剂的培养基中培养，离心收集上清；
（3）将步骤（2）培养的成纤维细胞加入消化酶消化后，离心，收集成纤维细胞超声破碎，得到成纤维细胞裂解液；
（4）将步骤（2）的上清液和步骤（3）的裂解液过滤、浓缩、除菌得到成纤维细胞提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞来自皮肤、骨髓、肌肉或肾脏中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述成纤维细胞来自皮肤。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的制备成纤维细胞包括如下具体步骤：采集组织样本，对组织样本进行预处理，采用酶消化的方法获得成纤维细胞进行培养，每2-4天更换一次细胞培养液；待细胞融合度达到80-90%时，按1:(1-5)的比例进行传代培养，获得皮肤成纤维细胞系。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的制备成纤维细胞包括如下具体步骤：采集组织样本，对组织样本进行预处理，采用酶消化的方法获得成纤维细胞进行培养，每3天更换一次细胞培养液；待细胞融合度达到80-90%时，按1:3的比例进行传代培养，获得皮肤成纤维细胞系。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括如下步骤：采用含有1000 U/mL青霉素和1000 μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次，再采用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的平衡盐溶液洗涤一次。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酶消化包括如下具体步骤：采用质量体积比为0.1-0.5%的中性蛋白酶37℃消化1-4小时，分离真皮、表皮；收集真皮，采用质量体积比为0.05-0.3%的Ⅳ型胶原酶37℃消化1-4小时。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酶消化包括如下具体步骤：采用质量体积比为0.25%的中性蛋白酶37℃消化2小时，分离真皮、表皮；收集真皮，采用质量体积比为0.1%的Ⅳ型胶原酶37℃消化2小时。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）包含：
步骤（2）所述的成纤维细胞为传代次数3-6代的成纤维细胞；
步骤（2）所述的成纤维细胞为生长至70-80%融合时进行转接培养；
步骤（2）所述的培养基为无酚红DMEM高糖液体培养基；
步骤（2）所述的培养基中还包括血清替代物；
所述血清替代物占所述培养基的体积百分比为5-20%；
所述离心的转速为800-1500rpm；
所述离心的时间为3-8分钟。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）进一步包含：
所述血清替代物占所述培养基的体积百分比为10%；
所述离心的转速为1300rpm；
所述离心的时间为5分钟。
13.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）包含：步骤（3）所述的消化为加入质量体积比为0.1-0.5%的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化1-4小时；
所述离心的转速为800-1500rpm；
所述离心的时间为3-8分钟；
所述超声破碎的条件为1-5℃，100-200W，超声1-4s，间隔3-6s，80-100个循环。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）进一步包含：
步骤（3）所述的消化为加入质量体积比为0.25%的胰蛋白酶-EDTA 37℃消化2小时；
所述离心的转速为1300rpm；
所述离心的时间为5分钟；
所述超声破碎的条件为4℃，150W，超声2s，间隔4s，99个循环。
15.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）包含：
步骤（4）所述过滤的滤膜孔径为0.2-0.6µm；
所述浓缩采用超滤离心管进行离心浓缩；
所述超滤离心管的截留分子量为1-5KD；
所述浓缩为浓缩到原体积的1/10-1/5；
所述除菌采用过滤除菌；
所述过滤除菌的滤膜孔径为0.22µm。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）进一步包含：
步骤（4）所述过滤的滤膜孔径为0.45µm；
所述超滤离心管的截留分子量为3KD。
17.一种成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1）如权利要求3-16中任一项所述的制备方法制备得到成纤维细胞提取物；
2）将步骤1）所述的成纤维细胞提取物制备为冻干粉剂。
18.根据权利要求17所述的成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
向成纤维细胞提取物中加入冻干赋形剂，过滤除菌，分装进行真空冷冻干燥，得到成纤维细胞提取物冻干粉；
所述冻干赋形剂为甘露糖醇、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、人血白蛋白中的任意一种或至少两种的混合物；
所述冻干赋形剂的质量体积浓度为1-20%。
19.根据权利要求18所述的成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干赋形剂为甘露糖醇和人血白蛋白的混合物；
所述冻干赋形剂的质量体积浓度为1-15%。
20.根据权利要求19所述的成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干赋形剂为质量体积浓度5-15%的甘露糖醇和质量体积浓度1-5%的人血白蛋白的混合物。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
向所述成纤维细胞提取物中加入冻干赋形剂后成纤维细胞提取物的蛋白浓度为50-600µg/mL；
所述过滤除菌的滤膜孔径为0.22µm；
所述真空冷冻干燥的条件为-45~-60℃，真空度5-15Pa，干燥20-50小时。
22.根据权利要求21所述的成纤维细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
向所述成纤维细胞提取物中加入冻干赋形剂后成纤维细胞提取物的蛋白浓度为600µg/mL；
所述真空冷冻干燥的条件为-50℃，真空度10Pa，干燥24-48小时。
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