CN110804607B - 一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法 - Google Patents

一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：破碎步骤：利用60‑100W超声波将收集得到的融合度达到80‑90％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10‑30min，得到破碎细胞液；离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2‑8℃、离心力为2000‑5000g的条件下离心10‑30min，离心后取上清液；纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5‑1/10的浓缩液；利用中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。本发明方法克服了现有技术提取干细胞生物活性因子的纯度低、产量少、活性低、效率低、产率低等问题；得到的干细胞裂解液具有良好的促进间充质干细胞增殖的能力和促进胶原蛋白合成的能力。

Description

一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是指一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法。
背景技术
干细胞作为新兴的种子细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，移植干细胞能自我更新并可分化成多种细胞，对组织进行修复；且干细胞可以产生或分泌大量的生物活性因子，这些生物活性因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如间充质干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。
从上可知，利用干细胞产生的生物活性因子激活机体干细胞，通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。目前，实际中提取干细胞生物活性因子的方法存在以下不足：(1)直接利用胎盘等组织提取，获得的活性蛋白中含有大量的组织蛋白难以去除，得到的干细胞生物活性因子纯度低；(2)利用干细胞扩增培养液提取活性因子，需要浓缩大量的培养液，费时费力，且培养液中含有的活性因子浓度相对较低，即提取的效率低、产率低；(3)干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等有重要作用，但在增殖分化过程这类物质并不分泌到细胞外。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：制备得到含有细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等生物活性因子的高浓度人源间充质干细胞裂解液。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：
破碎步骤：利用60-100W超声波将收集得到的融合度达到80-90％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10-30min，得到破碎细胞液。
离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2-8℃、离心力为2000-5000g的条件下离心10-30min，离心后取上清液。
纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5-1/10的浓缩液；利用中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。
进一步的，在所述破碎步骤中，所述超声破碎的超声交替地作用1-5s、停止2-6s。
进一步的，在所述纯化步骤中，所述中空纤维超滤柱的截留分子量为100KD。
进一步的，在所述破碎步骤中，所述人源脐带充质干细胞为经过0.9％氯化钠注射液重悬后浓度为5×106-1×107个/ml的P5代人源脐带间充质干细胞。
进一步的，在所述破碎步骤前，还包括传代细胞培养步骤A1至A5：
A1：将细胞浓度为3×104-5×104个/ml的Pi代人源脐带间充质干细胞悬液接种到培养瓶中，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80％-90％时，弃去上清的液体。
A2：往培养瓶中加入胰酶消化液进行消化；待贴壁的细胞完全掉下来后，加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，得到细胞悬浮液。
A3：所述细胞悬浮液在400g条件下离心5min，得到第一沉淀物。
A4：用0.9％氯化钠注射液清洗所述第一沉淀物，然后用无血清间充质干细胞完全培养液重悬所述第一沉淀物得到P(i+1)代人源脐带间充质干细胞悬液。
A5：重复步骤A1至A4直至得到P5代人源脐带间充质干细胞悬液；其中，i＝1,2,3,4。
进一步的，在所述传代细胞培养步骤前，还包括脐带组织原代培养步骤B1至B8：
B1：按照1ml无血清间充质干细胞完全培养液种植0.15-0.4g脐带组织小块的比例，将脐带组织小块种植于装载有无血清间充质干细胞完全培养液的培养瓶中，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，静置1-2h。
B2：向培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液培养7天。
B3：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液全部倒掉，并更换全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养5天。
B4：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液倒掉一半，并更换一半全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养3天。
B5：镜下观察细胞状态，当细胞融合度达到50-60％时，除去无血清间充质干细胞完全培养液。
B6：往培养瓶中加入胰酶消化液，然后置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中静置2-3min。
B7：往培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，然后在400g条件下离心5min，得到第二沉淀物。
B8：往所述第二沉淀物中加入无血清间充质干细胞完全培养液重悬，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
进一步的，在所述脐带组织原代培养步骤前，还包括脐带组织前处理步骤C1至C4：
C1：无菌条件下，取两端结扎的新鲜脐带，消毒后，置于含有抗生素的0.9％氯化钠注射液中。
C2：用手术剪剪去脐带结扎处的两端并弃去，将剩下中间段的脐带剪成约2～4cm/节，得到脐带组织段。
C3：加入0.9％氯化钠注射液洗涤所述脐带组织段的血凝块，重复洗涤3-5次，剖开所述脐带组织段，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，获得华通氏胶组织。
C4：采用0.9％氯化钠注射液对所述华通氏胶组织反复漂洗3次以上，然后对所述华通氏胶体组织进行剪切，得到体积为1～2mm3的所述脐带组织小块。
进一步的，所述抗生素由浓度为50-100U/ml的青霉素和浓度为50-100μg/ml的链霉素构成。
进一步的，所述胰酶消化液为0.25％Trypsin-EDTA。
进一步的，所述无血清间充质干细胞完全培养液为UltraCULTURE Serum-freeMedium。
本发明的有益效果在于：本发明方法采用的干细胞为脐带组织间充质干细胞，增殖分化能力强，易于控制，生物学性状稳定，从而保证能得到质量稳定性高的高纯度、高产量、高活性的干细胞生物活性因子。本发明方法克服了直接利用胎盘组织提取干细胞生物活性因子的纯度低、产量少、活性低等问题，也克服了利用干细胞扩增培养液提取活性因子效率低、产率低等问题。通过本发明方法提取得到的人源间充质干细胞裂解液中富含细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等干细胞生物活性因子，对修复受损细胞和减缓细胞衰老具有很好的作用，在保健美容领域将具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明最关键的构思在于：通过体外培养得到大量人源干细胞，并通过破碎该人源干细胞，分离、纯化得到大量的含有细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等生物活性因子的高浓度人源间充质干细胞裂解液。
为进一步论述本发明构思的可行性，根据本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，结合具体实施方式详予说明。
一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括依次执行的破碎步骤、离心步骤和纯化步骤，具体详见实施例1-3。在破碎步骤前，还包括依次执行的脐带组织前处理步骤、脐带组织原代培养步骤和传代细胞培养步骤，通过脐带组织前处理步骤、脐带组织原代培养步骤和传代细胞培养步骤制备破碎所需的人源间充质干细胞，具体详见实施例4。
实施例1
一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：
1、破碎步骤：利用60W超声波将收集得到的融合度达到80％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎，超声交替地作用1s、停止2s，破碎总时长为30min，得到破碎细胞液。
2、离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2℃、离心力为2000g的条件下离心30min，离心后取上清液。
3、纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5的浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。
实施例2
一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：
1、破碎步骤：利用100W超声波将收集得到的融合度达到90％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎，超声交替地作用5s、停止6s，破碎总时长为10min，得到破碎细胞液。
2、离心步骤：所述破碎细胞液在温度为8℃、离心力为5000g的条件下离心10min，离心后取上清液。
3、纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/8的浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。
实施例3
一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，包括以下步骤：
1、破碎步骤：利用80W超声波将收集得到的融合度达到85％的人源脐带充质干细胞进行超声破碎，超声交替地作用3s、停止4s，破碎总时长为20min，得到破碎细胞液。
2、离心步骤：所述破碎细胞液在温度为4℃、离心力为4000g的条件下离心10min，离心后取上清液。
3、纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/10的浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。
实施例4
一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，还包括以下步骤：
1、脐带组织前处理步骤：
C1：无菌条件下，取两端结扎的新鲜脐带，消毒后，置于含有抗生素的0.9％氯化钠注射液中。
C2：用手术剪剪去脐带结扎处的两端并弃去，将剩下中间段的脐带剪成约2～4cm/节，得到脐带组织段。
C3：加入0.9％氯化钠注射液洗涤所述脐带组织段的血凝块，重复洗涤3-5次，剖开所述脐带组织段，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，获得华通氏胶组织。
C4：采用0.9％氯化钠注射液对所述华通氏胶组织反复漂洗3次以上，然后对所述华通氏胶体组织进行剪切，得到体积为1～2mm3的所述脐带组织小块。
所述抗生素由浓度为50-100U/ml的青霉素和浓度为50-100μg/ml的链霉素构成。
在清洗所述脐带组织段的血凝块时，应当将所述脐带组织段清洗至无血渍。
2、脐带组织原代培养步骤：
B1：按照1ml无血清间充质干细胞完全培养液种植0.15-0.4g脐带组织小块的比例，将0.3-0.8g脐带组织小块种植于装载有2ml无血清间充质干细胞完全培养液的T75培养瓶中，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，静置1-2h。
B2：向培养瓶中加入5-10ml无血清间充质干细胞完全培养液培养7天。
B3：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液全部倒掉，并更换全新的5-10ml无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养5天。
B4：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液倒掉一半，并更换一半全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养3天。
B5：镜下观察细胞状态，当细胞融合度达到50-60％时，除去无血清间充质干细胞完全培养液。
B6：往培养瓶中加入3-5ml胰酶消化液，然后置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中静置2-3min。
B7：往培养瓶中加入10-15ml无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，然后在400g条件下离心5min，得到第二沉淀物。
B8：往所述第二沉淀物中加入无血清间充质干细胞完全培养液重悬，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
3、传代细胞培养步骤：
A1：将细胞浓度为3×104-5×104个/ml的Pi代人源脐带间充质干细胞悬液接种到培养瓶中，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80％-90％时，弃去上清的液体。
A2：往培养瓶中加入胰酶消化液进行消化；待贴壁的细胞完全掉下来后，加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，得到细胞悬浮液。
A3：所述细胞悬浮液在400g条件下离心5min，得到第一沉淀物。
A4：用20-50ml0.9％氯化钠注射液清洗所述第一沉淀物，然后用无血清间充质干细胞完全培养液重悬所述第一沉淀物得到P(i+1)代人源脐带间充质干细胞悬液，其中，i＝1,2,3,4，5，6，7，8，9。
A5：重复步骤A1至A4，则可依次得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液、P2代人源脐带间充质干细胞悬液、P3代人源脐带间充质干细胞悬液、P4代人源脐带间充质干细胞悬液、P5代人源脐带间充质干细胞悬液、P6代人源脐带间充质干细胞悬液、P7代人源脐带间充质干细胞悬液、P8代人源脐带间充质干细胞悬液、P9代人源脐带间充质干细胞悬液、P10代人源脐带间充质干细胞悬液。
由于材料不易获得，如果人源脐带间充质干细胞传代代数少，则得到的用于破碎获得裂解液的人源脐带间充质干细胞总量少，使得最终的人源脐带间充质干细胞裂解液总量少；但如果传代代数过多，细胞存在分化风险，最终也会影响到人源脐带间充质干细胞裂解液的有效成分的组成以及有效成分的浓度，即影响终产品的质量。优选地，重复步骤A1至A4，直至获得P5代人源脐带间充质干细胞悬液，将经过0.9％氯化钠注射液重悬后得到的细胞浓度为5×106-1×107个/ml的P5代人源脐带间充质干细胞悬液进行超声裂解制备人源脐带间充质干细胞裂解液。
上述的脐带组织前处理步骤、脐带组织原代培养步骤和传代细胞培养步骤中，所述胰酶消化液为0.25％Trypsin-EDTA；所述无血清间充质干细胞完全培养液为UltraCULTURE Serum-free Medium。在步骤A2和步骤B6、B7中，胰酶消化液的添加量没过培养瓶瓶底即可，添加量过多也不影响结果；而添加的用于终止消化的无血清间充质干细胞完全培养液的添加量应当比胰酶消化液的量多。例如，在T75的培养瓶中，可以添加3-5ml的胰酶消化液进行消化，消化完成后添加10-15ml的无血清间充质干细胞完全培养液终止消化。
在脐带组织原代培养步骤中：步骤B1中，种植脐带组织小块时，先让无血清间充质干细胞完全培养液均匀流散，且仅润湿培养瓶底部，然后再将脐带组织小块均匀铺在培养瓶底部；步骤B3为全量换液培养，步骤B4为半量换液培养，换液量均按照1：1的比例进行更换；在步骤B5中，观察到细胞融合度达到50-60％为开始收集原代细胞的信号；在步骤B6中静置与培养箱时，观察到细胞变圆即执行步骤B7。
在步骤A4中，用0.9％氯化钠注射液清洗所述第一沉淀物时，需要在400g条件下离心5min除去洗涤液。
对比例1
将脐带组织原代培养B3至B5步骤中弃去的无血清间充质干细胞完全培养液以及传代细胞培养A1步骤中弃去上清的液体进行收集，即将用于培养P1代至P5代的人源脐带充质干细胞的无血清间充质干细胞完全培养液全部收集起来，得到收集的混合液。
利用3K超滤膜对所述混合液进行过滤浓缩，得到体积为所述混合液体积的1/10的混合液浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述混合液浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞培养上清液活性因子。
采用NanoDrop one对实施例3中得到的高浓度人源间充质干细胞裂解液和对比例1中的高浓度人源间充质干细胞培养上清液活性因子进行总蛋白浓度测试，测试结果详见表1。
表1人源间充质干细胞裂解液和培养上清液的总蛋白浓度
实施例3 对比例1
总蛋白浓度(mg/ml) 5.68±1.27 1.90±0.52
从表1可以看出，与对比例1相比，采用超声破碎干细胞获得活性因子量明显高于采用培养上清液浓缩获得的活性因子量。
为了进一步验证根据本发明方法制备高浓度人源间充质干细胞裂解液的活性以及促进胶原蛋白合成能力，根据以下试验例1-6以及对比例2-3进行论述。
将根据上述实施例3制备得到的高浓度人源间充质干细胞裂解液添加到无血清基础培养液中，得到4个浓度梯度的含有人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液，供试验例1-3以及对比例2使用。按总蛋白浓度计算，无血清基础培养液中人源间充质干细胞裂解液的终浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。
根据上述实施例4传代细胞培养步骤，得到P8代人源间充质干细胞供试验例1-3以及对比例2使用。
试验例1
将1×105个P8代人源间充质干细胞接种到含有100μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液中，在显微镜下观察细胞的生长状态，并于第三天收集细胞进行细胞计数，计数结果详见表2。
试验例2
将1×105个P8代人源间充质干细胞接种到含有200μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液中，在显微镜下观察细胞的生长状态，并于第三天收集细胞进行细胞计数，计数结果详见表2。
试验例3
将1×105个P8代人源间充质干细胞接种到含有400μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液中，在显微镜下观察细胞的生长状态，并于第三天收集细胞进行细胞计数，计数结果详见表2。
对比例2
将1×105个P8代人源间充质干细胞接种到含有0μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液中，在显微镜下观察细胞的生长状态，并于第三天收集细胞进行细胞计数，计数结果详见表2。
表2人源间充质干细胞细胞计数
试验例1 试验例2 试验例3 对比例2
细胞总数 1.5×10<sup>5</sup> 1.8×10<sup>5</sup> 2.4×10<sup>5</sup> 1.1×10<sup>5</sup>
从表2可以看出，与对比例2相比，添加人源间充质干细胞裂解液的实验例1-3，人源间充质干细胞增殖能力均有所增强，且在0-400μg/ml浓度范围内，添加人源间充质干细胞裂解液的浓度越高，人源间充质干细胞增殖能力越强。
将人真皮成纤维细胞以20000个/cm2的密度接种于六孔板中，共制作4组所述六孔板供试验例4-6以及对比例3使用。
试验例4
往一组六孔板中加入含有100μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液，每隔一天换液一次，共培养六天。培养完成后提取总蛋白，然后测定人真皮成纤维细胞的胶原蛋白表达量，测定结果详见表3。
试验例5
往一组六孔板中加入含有200μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液，每隔一天换液一次，共培养六天。培养完成后提取总蛋白，然后测定人真皮成纤维细胞的胶原蛋白表达量，测定结果详见表3。
试验例6
往一组六孔板中加入含有400μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液，每隔一天换液一次，共培养六天。培养完成后提取总蛋白，然后测定人真皮成纤维细胞的胶原蛋白表达量，测定结果详见表3。
对比例3
往一组六孔板中加入含有0μg/ml人源间充质干细胞裂解液的无血清基础培养液，每隔一天换液一次，共培养六天。培养完成后提取总蛋白，然后测定人真皮成纤维细胞的胶原蛋白表达量，测定结果详见表3。
上述实验例4-6和对比例3根据以下方法进行人真皮成纤维细胞中蛋白的提取以及人真皮成纤维细胞的胶原蛋白表达量测定：
提取：取出培养的人真皮成纤维细胞，弃去上清，并用PBS洗涤2次。每孔加入100μL的RIPA裂解液和1μL的PMSF混合液，在温度为4℃条件下超声裂解30min。将六孔板中的液体移入EP管中，在温度为4℃、离心力为10000g的条件下离心20min。吸取上清液并转至-20℃条件下储存备用。
测定：采用westernbloting实验操作技术检测胶原蛋白表达量，以GAPDH作为内参，蛋白条带图用Image J软件进行灰度值分析。实验例4-6和对比例3的测定结果详见表3。
表3人源间充质干细胞裂解液促进胶原蛋白合成能力比较
试验例4 试验例5 试验例6 对比例3
胶原蛋白表达量 0.88 1.24 1.89 0.51
从表3可以看出，利用本发明提供的人源间充质干细胞裂解液刺激培养人真皮成纤维细胞，可促进人真皮成纤维细胞胶原蛋白表达量的增加，且在0-400μg/ml浓度范围内，添加人源间充质干细胞裂解液的浓度越高，人真皮成纤维细胞胶原蛋白表达量越高，即根据本发明制备方法得到的人源间充质干细胞裂解液具有皮肤修复的功能。
综上所述，本发明提供的一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，根据方法得到的纯化后的人源间充质干细胞裂解液具有良好的促进间充质干细胞增殖的能力和促进胶原蛋白合成的能力，对修复受损细胞和减缓细胞衰老具有很好的作用，从而在保健美容领域具有广阔的应用前景。采用的干细胞为脐带组织间充质干细胞，增殖分化能力强，易于控制，生物学性状稳定，从而保证能得到质量稳定性高的高纯度、高产量、高活性的干细胞生物活性因子。本发明方法克服了直接利用胎盘组织提取干细胞生物活性因子的纯度低、产量少、活性低等问题，也克服了利用干细胞扩增培养液提取活性因子效率低、产率低等问题。
此处第一、第二……只代表其名称的区分，不代表它们的重要程度和位置有什么不同。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，包括：
破碎步骤：利用60-100W超声波将收集得到的融合度达到85%的人源脐带充质干细胞进行超声破碎10-30min，得到破碎细胞液；所述超声破碎的超声交替地作用1-5s、停止2-6s；所述人源脐带充质干细胞为经过0.9%氯化钠注射液重悬后浓度为5×106-1×107个/ml的P5代人源脐带间充质干细胞；
离心步骤：所述破碎细胞液在温度为2-8℃、离心力为2000-5000g的条件下离心10-30min，离心后取上清液；
纯化步骤：利用3K超滤膜对所述上清液进行过滤浓缩，得到体积为所述上清液体积的1/5-1/10的浓缩液；利用截留分子量为100KD的中空纤维超滤柱对所述浓缩液进行进一步的浓缩，得到高浓度人源间充质干细胞裂解液。
2.如权利要求1所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述破碎步骤前，还包括传代细胞培养步骤：
A1：将细胞浓度为3×104-5×104个/ml的Pi代人源脐带间充质干细胞悬液接种到培养瓶中，置于温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%-90%时，弃去上清的液体；
A2：往培养瓶中加入胰酶消化液进行消化；待贴壁的细胞完全掉下来后，加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，得到细胞悬浮液；
A3：所述细胞悬浮液在400g条件下离心5min，得到第一沉淀物；
A4：用0.9%氯化钠注射液清洗所述第一沉淀物，然后用无血清间充质干细胞完全培养液重悬所述第一沉淀物得到P（i+1）代人源脐带间充质干细胞悬液；
A5：重复步骤A1至A4直至得到P5代人源脐带间充质干细胞悬液;
其中，i=1,2,3,4。
3.如权利要求2所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述传代细胞培养步骤前，还包括脐带组织原代培养步骤：
B1：按照1ml无血清间充质干细胞完全培养液种植0.15-0.4g脐带组织小块的比例，将脐带组织小块种植于装载有无血清间充质干细胞完全培养液的培养瓶中，放入温度为37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，静置1-2h；
B2：向培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液培养7天；
B3：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液全部倒掉，并更换全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养5天；
B4：将培养瓶中的无血清间充质干细胞完全培养液倒掉一半，并更换一半全新的无血清间充质干细胞完全培养液，静置培养3天；
B5：镜下观察细胞状态，当细胞融合度达到50-60%时，除去无血清间充质干细胞完全培养液；
B6：往培养瓶中加入胰酶消化液，然后置于温度为37℃、 CO2浓度为5%的培养箱中静置2-3min；
B7：往培养瓶中加入无血清间充质干细胞完全培养液终止消化，然后在400g条件下离心5min，得到第二沉淀物；
B8：往所述第二沉淀物中加入无血清间充质干细胞完全培养液重悬，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
4.如权利要求3所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，在所述脐带组织原代培养步骤前，还包括脐带组织前处理步骤：
C1：无菌条件下，取两端结扎的新鲜脐带，消毒后，置于含有抗生素的0.9%氯化钠注射液中；
C2：用手术剪剪去脐带结扎处的两端并弃去，将剩下中间段的脐带剪成2～4cm/节，得到脐带组织段；
C3：加入0.9%氯化钠注射液洗涤所述脐带组织段的血凝块，重复洗涤3-5次，剖开所述脐带组织段，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，获得华通氏胶组织；
C4：采用0.9%氯化钠注射液对所述华通氏胶组织反复漂洗3次以上，然后对所述华通氏胶体组织进行剪切，得到体积为1～2mm3的所述脐带组织小块。
5.如权利要求4所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，所述抗生素由浓度为50-100U/ml的青霉素和浓度为50-100μg/ml的链霉素构成。
6.如权利要求2或3任一所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，所述胰酶消化液为0.25% Trypsin-EDTA。
7.如权利要求2或3任一所述高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞完全培养液为UltraCULTURE Serum-free Medium。
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