CN109453200A - 多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法：从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，并进行混合培养，混合培养过程中各个阶段收集培养上清液，并将混合培养所得的干细胞进行超声破碎，收集干细胞裂解因子，通过两次冻干浓缩处理制备干细胞裂解因子冻干粉，整个冻干过程保持在20℃以下，逐步缓慢升温，防止温度变化对干细胞因子活性的影响，在低温、低压环境下结晶水缓慢升华，有冻干保护剂的情况下干细胞因子其他组分不损失、活性不受影响，得到了容易量化且含有丰富间充质干细胞生物活性因子的组合物，解决了干细胞因子在浓缩时由于干细胞因子分子量不同而造成的细胞因子种类损失的问题。

Description

多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法
技术领域
本发明属于动物干细胞技术领域，具体地说，涉及一种多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，存在于脐带、骨髓、牙髓等生物体组织中。间充质干细胞通过分泌各种细胞因子对周围临近细胞产生作用，从而产生功效。间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如SCF促干细胞生长因子；HGF肝细胞生长因子；BFGF碱性成纤维生长因子；NGF神经生长因子；BDNF脑源性神经营养因子；IGF胰岛素样生长因子；VEGF血管内皮细胞生长因子；Ang血管生成素；MCP趋化因子；LIF9白血病抑制因子；EPO促红细胞生成素；SDF-1基质细胞衍生因子；PDGF血小板衍生生长因子等。
间充质干细胞分泌的活性因子有促进大量的成骨细胞生成、抑制破骨细胞，加强胃肠功能，促进消化酶的分解。刺激肝细胞再生和修复，促进受损肝脏再生，阻止肝纤维化，防止急性肝衰竭。加强骨髓造血功能，促进红细胞和白细胞生成。加强心室厚度，增强心肌弹性。有效清除血液中低密度蛋白，防止在血管壁沉积，可辅助治疗血栓。帮助消除肺部毒素，促进机体各种酶、荷尔蒙的分泌，增强肾功能，加快新陈代谢，加快体内排毒。刺激性激素分泌，强壮性器官肌肉组织，加强性器官神经耐力。刺激胸腺细胞再生，加快淋巴T细胞、B细胞、吞噬细胞的生成，提高免疫功能。加快恢复神经系统功能，促进脑神经细胞、树突生成，帮助深度睡眠，神经衰弱、记忆力减退、神经性头痛等。以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心、脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。但是，干细胞因子在浓缩时由于干细胞因子分子量不同而造成的细胞因子种类损失；在液体状态中冷链运输成本高、保存维持活性困难；使用时量化不准确等问题。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明提供一种多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法。
本发明公开的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，包括：
从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；
将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞；
将P1代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后离心，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液；
将P2代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞；
将P3代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为E液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
将P4代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×108个/mL收集冻存，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为F液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
将P5代混合细胞复苏，加完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度调整为2×107个/mL至5×107个/mL，将细胞悬液置于专用超声破碎容器中，放入0℃低温槽中进行超声破碎，并且超声破碎时超声功率在300w以下，破碎时每次超声时间不超过3s，每次超声时间间隔不低于8s，超声次数不超过60次；超声破碎细胞后通过0.22μm过滤，去掉细胞碎片和未破碎的细胞，得到干细胞裂解因子标记为G液，将E液、F液、G液按1：1：1混合，将混合液回温至常温，用碳酸氢钠调节PH值至7.5，再通过0.22μm过滤标记为H液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
对H液进行冻干前的预处理：对H液进行检测，确保H液无菌、无支原体、无衣原体感染，再加入5％的冻干保护剂，然后将H液的PH值调节至7.4-7.5之间；所述冻干保护剂是由20％的葡萄糖和10％的甘露醇混合而成的溶液；
对经过预处理的H液进行第一次冻干浓缩处理，把每5mL的H液浓缩至1mL，或者把每3mL的H液浓缩至0.5mL的浓缩液；
向经过第一次冻干浓缩处理得到的浓缩液中加入经过预处理的H液，使得浓缩液的体积恢复到未被浓缩时的体积，然后进行第二次冻干浓缩处理，得到冻干粉。
如上所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，若所述哺乳动物属于犬科，第一次冻干浓缩处理过程为：
将H液摇匀分装到西林瓶中，依次置于-80℃的温度环境中预冻12小时，-50℃的温度环境中保持4小时，-30℃的温度环境中保持2小时，-50℃的温度环境中保持2小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持1小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持1小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持1小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持1小时，15℃的温度环境中保持1小时，18℃的温度环境中恒温4小时；
恢复常压，实现将每5mL的H液浓缩至1mL的浓缩液；
第二次冻干浓缩处理过程为：
将被恢复到未被浓缩时的体积的H液依次置于-80℃的温度环境中预冻4小时，-50℃的温度环境中保持5小时，-30℃的温度环境中保持1小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持2小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持2小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持2小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持一小时，15℃的温度环境中保持一小时，18℃恒温5小时；
恢复常压，得到冻干粉。
如上所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，若所述哺乳动物属于猫科，第一次冻干浓缩处理过程为：
将H液摇匀分装到西林瓶中，依次置于-80℃的温度环境中预冻8小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时，-50℃的温度环境中保持2小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持1小时，-20℃的温度环境中保持1.5小时，-15℃的温度环境中保持1.5小时，-10℃的温度环境中保持1小时，-5℃的温度环境中保持1.5小时，0℃的温度环境中保持1小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持1小时，15℃的温度环境中保持1小时，18℃的温度环境中恒温4小时；
恢复常压，实现将每3mL的H液浓缩至0.5mL的浓缩液；
第二次冻干浓缩处理过程为：
将被恢复到未被浓缩时的体积的H液依次置于-80℃的温度环境中预冻4小时，-50℃的温度环境中保持5小时，-30℃的温度环境中保持1小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持2小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持2小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持2小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持一小时，15℃的温度环境中保持一小时，18℃恒温5小时；
恢复常压，得到冻干粉。
如上所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其中，从哺乳动物的脂肪组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
将哺乳动物麻醉后，取腹股沟皮下脂肪，用酒精浸泡3min，去毛细血管，用PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm3的粒块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪粒块，于37℃的温度环境消化60min，消化后取出放入离心管，100g离心10min(100牛离心力离心，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基摇匀，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去上清，加入完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后观察细胞情况，待有长梭型细胞贴壁铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第一间充质干细胞。
如上所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其中，从哺乳动物的骨髓组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
将哺乳动物麻醉后取骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第二间充质干细胞。
如上所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其中，从哺乳动物的脐带组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
取哺乳动物的脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血，把脐带用酒精浸泡3min，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍；将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长的脐带段，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带段放在培养皿中加入完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm3的块，均匀平铺于培养瓶中，加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，待有细胞爬出铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第三间充质干细胞。
本发明提供的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法具有以下优点：
1、整个冻干过程保持在20℃以下，逐步缓慢升温，防止温度变化对干细胞因子活性的影响，在低温、低压环境下结晶水缓慢升华，有冻干保护剂的情况下干细胞因子其他组分不会损失、活性不会受到影响。
2、通过两次冻干既保持了干细胞生物活性因子各组分的生物学活性，又避免了浓缩过程间充质干细胞生物活性因子的损失，还得到了容易量化且含有丰富间充质干细胞生物活性因子的组合物。解决了干细胞因子在浓缩时由于干细胞因子分子量不同而造成的细胞因子种类损失的问题。
3、解决了在液体状态中冷链运输成本高、保存维持活性困难；使用时量化不准确等问题。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明提供的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法的流程图。
具体实施方式
以下将配合实施例及附图来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
图1为本发明提供的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法的流程图。如图1所示，本发明的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法可以包括以下步骤(S1～S10)：
S1、从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞。
S2、将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞。
S3、将P1代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基和D液，摇匀后放入培养箱培养，得到P2代混合细胞。
具体的，将P1代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后8000转/min离心6min，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液。
S4、将P2代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基和D液，摇匀后放入培养箱培养，得到P3代混合细胞。
具体的，将P2代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞。
S5、将P3代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱培养，得到P4代混合细胞，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为E液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
具体的，将P3代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为E液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
S6、将P4代混合细胞接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱培养，得到P5代混合细胞，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为F液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
具体的，将P4代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×108个/mL收集冻存，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为F液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
S7、将P5代混合细胞复苏，加完全培养基，超声破碎细胞后通过0.22μm过滤标记为G液，将E液、F液、G液按1：1：1混合，将混合液回温至常温，用碳酸氢钠调节PH值至7.5，再通过0.22μm过滤标记为H液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
具体的，将P5代混合细胞复苏，加完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度调整为2-5×107个/mL，将细胞悬液置于专用超声破碎容器中，放入0℃低温槽中进行超声破碎(为确保破碎过程中蛋白质的稳定，整个破碎过程细胞悬液在0℃低温槽中进行)，并且超声破碎时超声功率在300w以下，破碎时每次超声时间不超过3s，每次超声时间间隔不低于8s，超声次数不超过60次；超声破碎细胞后通过0.22μm过滤，去掉细胞碎片和未破碎的细胞，得到干细胞裂解因子标记为G液，为了增加裂解因子活性成分，将E液、F液、G液按1：1：1混合，将混合液回温至常温，用碳酸氢钠调节PH值至7.5，再通过0.22μm过滤标记为H液，并置于4℃的温度环境中保存备用。
S8、对H液进行冻干前的预处理：对H液进行检测，确保H液无菌、无支原体、无衣原体感染，再加入5％的冻干保护剂，然后将H液的PH值调节至7.4-7.5之间；所述冻干保护剂是由20％的葡萄糖和10％的甘露醇混合而成的溶液。
S9、对经过预处理的H液进行第一次冻干浓缩处理，把每5mL的H液浓缩至1mL，或者把每3mL的H液浓缩至0.5mL的浓缩液。
S10、向经过第一次冻干浓缩处理得到的浓缩液中加入经过预处理的H液，使得浓缩液的体积恢复到未被浓缩时的体积，然后进行第二次冻干浓缩处理，得到冻干粉。
本发明实施例的技术方案，不同组织来源的间充质干细胞分泌的多种细胞因子可以相互促进增殖，同时添加的自体脐带血血清使得增殖更快，细胞一致性更好，整个冻干过程保持在20℃以下，逐步缓慢升温，防止温度变化对干细胞因子活性的影响，在低温、低压环境下结晶水缓慢升华，有冻干保护剂的情况下干细胞因子其他组分不会损失、活性不会受到影响。通过二次冻干既保持了干细胞生物活性因子各组分的生物学活性，又避免了浓缩过程间充质干细胞生物活性因子的损失，还得到了容易量化且含有丰富间充质干细胞生物活性因子的组合物。
下面将给出的是本发明提供的技术方案的应用实施例。
第一部分：分离提纯犬、猫脂肪来源间充质干细胞、分离提纯犬骨髓来源间充质干细胞、分离提纯犬脐带来源间充质干细胞。
1、分离提纯犬、猫脂肪来源间充质干细胞。
麻醉后取犬、猫腹股沟皮下脂肪，酒精浸泡3min，去毛细血管，PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm3小块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪块混合均匀，37℃消化60min，消化后取出放入离心管，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基①轻轻摇匀，100g离心10min(100牛离心力离心10分钟，低速离心机800-1000转/min可使离心力达到100牛)，去上清，加入适量完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱5％CO2，湿度90％，温度37℃培养，24小时后观察细胞情况，有大量长梭型细胞贴壁后清洗换液②，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为A细胞，检测支原体衣原体等，通过流式鉴定后液氮保存备用。
注①完全培养基：为成分明确的适合间充质干细胞培养的无血清完全培养基，无特殊说明均为此培养基，下同。
注②清洗换液：去掉培养瓶中旧液，用PBS清洗2-3次，只剩下瓶内贴壁细胞，再加入适量新鲜完全培养基，无特殊说明下同。
2、分离提纯犬、猫骨髓来源建充质干细胞
麻醉后取犬、猫骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱5％CO2，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为B细胞，检测支原体衣原体等，通过流式鉴定后液氮保存备用。
3、分离提纯犬、猫脐带来源间充质干细胞。
取犬、猫脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血备用。把脐带取回试验室，酒精浸泡3min，含1％双抗的PBS清洗3-5遍，将脐带血放入离心管于4-8℃冰箱静置3小时后离心，取淡黄色上清液4℃保存备用，标记此液为D液。
将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长小段，用含1％双抗PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带小段放在培养皿中加入几滴完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm3的小块，均匀平铺于培养瓶中加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱5％CO2，湿度90，温度37℃培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，有大量细胞爬出后清洗换液，细胞爬出较少时不清洗，换液时保留脐带组织块直至有大量细胞爬出后清洗换液，此后每3天清洗换液，待细胞铺满75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为C细胞。检测支原体衣原体等，通过鉴定后液氮保存备用。
第二部分：混合培养，进一步提纯间充质干细胞。
(1)将A、B、C细胞按2:3:1比例混合，以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入适量完全培养基后，按总体积加入0.1％D液摇匀后放入培养箱5％CO2，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞。
(2)用P2混合代细胞继续以8000-10000个/cm2接种传代，按总体积加入0.1％D液摇匀后放入培养箱5％CO2，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞。
(3)将P3代混合细胞以8000-10000个/cm2接种传代，加入适量完全培养基，不再添加D液，放入培养箱5％CO2，湿度90％，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞细胞，收集细胞同时收集培养上清液，通过0.22μm过滤标记为E液4℃保存备用。
(4)将P4代混合细胞以8000-10000个/cm2接种传代，加入适量完全培养基，不再添加D液，放入培养箱5％CO2，湿度90，温度37℃培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液，待细胞铺满80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，P5代混合细胞以1×108个/mL收集冻存，以方便使用。收集细胞同时收集培养上清液，通过0.22μm过滤标记为F液4℃保存备用。
(5)将P5代混合细胞复苏，加一定量完全培养基，超声破碎细胞后通过0.22μm过滤标记为G液，将E、F、G液按1：1：1混合，将混合液回温至常温，用碳酸氢钠调节PH值至7.5，再通过0.22μm过滤标记为H液4℃保存。
第三部分：二次冻干浓缩制备犬、猫间充质干细胞裂解因子冻干粉
(1)冻干前准备
冻干前对H液进行支原体、衣原体、PH值、无菌测试等检测，H液无菌、无支原体、衣原体感染、PH值在7.4-7.5之间方可冻干。使用专门针对细胞培养支原体、衣原体污染的试剂对H液进行检查。再通过无菌检查法对H也进行无菌测试，通过检测后加入5％冻干保护剂③然后调节PH值在7.4-7.5之间即可开始冻干。
③冻干保护剂：为20％葡萄糖和10％甘露醇混合溶液。
(2)犬干细胞因子第一次冻干浓缩
将H液摇匀分装到西林瓶中，每瓶5mL,放入-80℃冰箱预冻12小时，设置冻干程序，冻干程序设置为：-50℃保持4小时→-30℃保持2小时→-50℃保持2小时→-30℃保持2小时→开始抽空，以下步骤真空度保持小于1→-25℃保持1小时→-20℃保持2小时→-15℃保持2小时→-10℃保持1小时→-5℃保持2小时→0℃保持1小时→5℃保持1小时→10℃保持1小时→15℃保持1小时→18℃恒温4小时后，恢复常压。把H液按以上程序冻干，可把5mLH液浓缩至1mL。
(3)犬干细胞因子第二次冻干
将浓缩至1mL的H液，再加入(1)中已调试H液使体积恢复至5mL,放入-80℃冰箱预冻4小时，调节冻干程序，冻干程序设置为：-50℃保持5小时→-30℃保持1小时→-50℃保持3小时→-30℃保持2小时→开始抽空，以下步骤真空度保持小于1→-25℃保持2小时→-20℃保持2小时-15℃保持2小时→-10℃保持2小时→-5℃保持2小时→0℃保持2小时→5℃保持1小时→10℃保持一小时→15℃保持一小时→18℃恒温5小时后，恢复常压。经过冻干后，可得到冻干粉。
(4)猫干细胞因子第一次冻干浓缩
冻干前准备同(1)。将H液摇匀分装到西林瓶中，每瓶3mL,放入-80℃冰箱预冻8小时，设置冻干程序，冻干程序设置为：-50℃保持3小时→-30℃保持2小时→-50℃保持2小时→-30℃保持2小时→开始抽空，以下步骤真空度保持小于1→-25℃保持1小时→-20℃保持1.5小时→-15℃保持1.5小时→-10℃保持1小时→-5℃保持1.5小时→0℃保持1小时→5℃保持1小时→10℃保持1小时→15℃保持1小时→18℃恒温4小时后，恢复常压。把H液按以上程序冻干，可把3mLH液浓缩至0.5mL。
(5)猫干细胞因子第二次冻干
将浓缩至0.5mL的H液，再加入(1)中已调试H液使体积恢复至3mL,放入-80℃冰箱预冻4小时，调节冻干程序，冻干程序设置为：-50℃保持4小时→-30℃保持1小时→-50℃保持3小时→-30℃保持2小时→开始抽空，以下步骤真空度保持小于1→-25℃保持2小时→-20℃保持1.5小时→-15℃保持2小时→-10℃保持1.5小时→-5℃保持2小时→0℃保持1.5小时→5℃保持1小时→10℃保持1小时→15℃保持1小时→18℃恒温5小时后，恢复常压。经过冻干后，可得到冻干粉。
整个冻干过程保持在20℃以下，逐步缓慢升温，防止温度变化对干细胞因子活性的影响，从-25开始在低温、低压环境下结晶水缓慢升华，有冻干保护剂的情况下干细胞因子其他组分不会损失、活性不会受到影响。通过二次冻干既保持了干细胞生物活性因子各组分的生物学活性，又避免了浓缩过程间充质干细胞生物活性因子的损失，还得到了容易量化且含有丰富间充质干细胞生物活性因子的组合物。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括：
从哺乳动物的脂肪组织、骨髓组织、脐带组织中分离提纯出间充质干细胞，将从脂肪组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第一间充质干细胞，将从骨髓组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第二间充质干细胞，将从脐带组织中分离提纯出的间充质干细胞标记为第三间充质干细胞；
将第一间充质干细胞、第二间充质干细胞、第三间充质干细胞按2:3:1比例混合，组成P1代混合细胞；
将P1代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P2代混合细胞；所述完全培养基为用于间充质干细胞培养的无血清培养基；所述D液的制备方法为：将脐带血放入离心管于4-8℃的环境中静置3小时后离心，取淡黄色上清液于4℃的温度环境保存备用，标记该液为D液；
将P2代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基，按总体积加入0.1％的D液，摇匀后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P3代混合细胞；
将P3代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P4代混合细胞，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为E液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
将P4代混合细胞以8000-10000个/cm2接种到培养瓶中，加入完全培养基后放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集细胞，得到P5代混合细胞，并将P5代混合细胞以1×108个/mL收集冻存，收集细胞的同时收集培养上清液，将上清液通过0.22μm过滤后标记为F液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
将P5代混合细胞复苏，加完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度调整为2×107个/mL至5×107个/mL，将细胞悬液置于专用超声破碎容器中，放入0℃低温槽中进行超声破碎，并且超声破碎时超声功率在300w以下，破碎时每次超声时间不超过3s，每次超声时间间隔不低于8s，超声次数不超过60次；超声破碎细胞后通过0.22μm过滤，去掉细胞碎片和未破碎的细胞，得到干细胞裂解因子标记为G液，将E液、F液、G液按1：1：1混合，将混合液回温至常温，用碳酸氢钠调节PH值至7.5，再通过0.22μm过滤标记为H液，并置于4℃的温度环境中保存备用；
对H液进行冻干前的预处理：对H液进行检测，确保H液无菌、无支原体、无衣原体感染，再加入5％的冻干保护剂，然后将H液的PH值调节至7.4-7.5之间；所述冻干保护剂是由20％的葡萄糖和10％的甘露醇混合而成的溶液；
对经过预处理的H液进行第一次冻干浓缩处理，把每5mL的H液浓缩至1mL，或者把每3mL的H液浓缩至0.5mL的浓缩液；
向经过第一次冻干浓缩处理得到的浓缩液中加入经过预处理的H液，使得浓缩液的体积恢复到未被浓缩时的体积，然后进行第二次冻干浓缩处理，得到冻干粉。
2.如权利要求1所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，若所述哺乳动物属于犬科，
第一次冻干浓缩处理过程为：
将H液摇匀分装到西林瓶中，依次置于-80℃的温度环境中预冻12小时，-50℃的温度环境中保持4小时，-30℃的温度环境中保持2小时，-50℃的温度环境中保持2小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持1小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持1小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持1小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持1小时，15℃的温度环境中保持1小时，18℃的温度环境中恒温4小时；
恢复常压，实现将每5mL的H液浓缩至1mL的浓缩液；
第二次冻干浓缩处理过程为：
将被恢复到未被浓缩时的体积的H液依次置于-80℃的温度环境中预冻4小时，-50℃的温度环境中保持5小时，-30℃的温度环境中保持1小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持2小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持2小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持2小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持一小时，15℃的温度环境中保持一小时，18℃恒温5小时；
恢复常压，得到冻干粉。
3.如权利要求1所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，若所述哺乳动物属于猫科，
第一次冻干浓缩处理过程为：
将H液摇匀分装到西林瓶中，依次置于-80℃的温度环境中预冻8小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时，-50℃的温度环境中保持2小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持1小时，-20℃的温度环境中保持1.5小时，-15℃的温度环境中保持1.5小时，-10℃的温度环境中保持1小时，-5℃的温度环境中保持1.5小时，0℃的温度环境中保持1小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持1小时，15℃的温度环境中保持1小时，18℃的温度环境中恒温4小时；
恢复常压，实现将每3mL的H液浓缩至0.5mL的浓缩液；
第二次冻干浓缩处理过程为：
将被恢复到未被浓缩时的体积的H液依次置于-80℃的温度环境中预冻4小时，-50℃的温度环境中保持5小时，-30℃的温度环境中保持1小时，-50℃的温度环境中保持3小时，-30℃的温度环境中保持2小时；
开始抽空，以下步骤真空度保持小于1，依次置于-25℃的温度环境中保持2小时，-20℃的温度环境中保持2小时，-15℃的温度环境中保持2小时，-10℃的温度环境中保持2小时，-5℃的温度环境中保持2小时，0℃的温度环境中保持2小时，5℃的温度环境中保持1小时，10℃的温度环境中保持一小时，15℃的温度环境中保持一小时，18℃恒温5小时；
恢复常压，得到冻干粉。
4.如权利要求1所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，从哺乳动物的脂肪组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
将哺乳动物麻醉后，取腹股沟皮下脂肪，用酒精浸泡3min，去毛细血管，用PBS清洗3-5遍，把脂肪块剪成0.5-1mm3的粒块，放入培养皿中加适量Ⅰ型胶原酶，全面浸泡脂肪粒块，于37℃的温度环境消化60min，消化后取出放入离心管，每100g离心10min，去掉上层脂肪和中层液体，留下底部沉淀物加10mL完全培养基摇匀，再每100g离心10min，去上清，加入完全培养基摇匀，制成细胞悬液，移入培养瓶，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后观察细胞情况，待有长梭型细胞贴壁铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每天观察细胞生长情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第一间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，从哺乳动物的骨髓组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
将哺乳动物麻醉后取骨髓，放入培养皿中，加培养所需完全培养量的1/3完全培养基，混合均匀移入培养瓶，放入培养箱预培养30min，再加入另外2/3完全培养基，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，每天观察细胞情况，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满培养瓶的80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第二间充质干细胞。
6.如权利要求1-5任一项所述的多组织来源的间充质干细胞裂解因子冻干粉的制备方法，其特征在于，从哺乳动物的脐带组织中分离提纯出间充质干细胞的方法为：
取哺乳动物的脐带，取脐带时用缝针线系紧两端，用注射器抽取脐带血，把脐带用酒精浸泡3min，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍；将抽出脐带血的脐带去两端，剪成1cm长的脐带段，用含1％双抗的PBS清洗3-5遍，直至完全洗净血细胞，取出脐带段放在培养皿中加入完全培养基使脐带保持湿润，沿脐静脉剪开，去除脐静脉壁和两条脐动脉，取下脐带外壁内侧的华通氏胶，将华通氏胶切成1-2mm3的块，均匀平铺于培养瓶中，加入培养所需完全培养量的1/3完全培养基，放入培养箱，在CO2浓度为5％、湿度为90％、温度为37℃的环境中培养，24小时后加入另外2/3完全培养基，7天后观察细胞情况，待有细胞爬出铺满培养瓶的20％-30％后清洗换液，每3天清洗换液一次，待细胞铺满培养瓶的75％时收集传代，按6000-8000个/cm2传代培养，待细胞铺满80％-90％时收集得到P1代细胞，标记为第三间充质干细胞。
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