CN109627315A - 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 - Google Patents

脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109627315A
CN109627315A CN201910049287.XA CN201910049287A CN109627315A CN 109627315 A CN109627315 A CN 109627315A CN 201910049287 A CN201910049287 A CN 201910049287A CN 109627315 A CN109627315 A CN 109627315A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
mesenchymal stem
freeze
fat mesenchymal
cell factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910049287.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109627315B (zh
Inventor
黄燕飞
车七石
刘少辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd filed Critical Guangzhou Rainhome Pharm and Tech Co Ltd
Priority to CN201910049287.XA priority Critical patent/CN109627315B/zh
Publication of CN109627315A publication Critical patent/CN109627315A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109627315B publication Critical patent/CN109627315B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，其采用机械刺激和低氧刺激的条件培养脂肪间充质干细胞，促进干细胞因子分泌，同时采用聚乙二醇、魔芋糖、脯氨酸、谷胱甘肽、苯甲酸钠、十二烷基磺酸钠、四氢嘧啶各组分的合理配合作为冻干粉保护剂，制备得到的期待间充质干细胞因子冻干粉具有良好的稳定性、干细胞因子含量及活性。

Description

脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法。
背景技术
干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括EGF(表皮生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(肝脏生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。
普通方法培养干细胞分泌干细胞因子的效率较低，而且分泌制备得到的液体状态下的干细胞生物活性肽溶液在室温保存时间短，不利于运输，浓度也低。并且异体来源的干细胞生物活性肽，干细胞种子虽然经过筛选，但仍然存在微生物感染风险。还有一些产品是通过直接裂解干细胞或其它活性细胞直接获得，蛋白成分复杂，虽然浓度高，但无效蛋白多，对人体也将是代谢压力。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，提高干细胞因子的产量、生物活性和稳定性，快速制备得浓度高、无微生物感染风险、可长期保持活性的脂肪间充质干细胞因子。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种脂肪间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织，酶解消化、培养得脂肪间充质干细胞；
(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养1～3h，并对细胞进行机械牵拉；
(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；
(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脂肪间充质干细胞因子。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于氧气浓度为(5±0.5)％的条件下培养。
在其中一些实施例中，所述对细胞进行机械牵拉的方法为：
传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长10％～20％。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的酶解消化为：采用含有EDTA-Tripsin与蛋白酶的复合酶溶液，于37℃消化2～4h。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110D超滤膜，收集截流液。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，具体技术方案如下：
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如上所述制备得到的脂肪间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
在其中一些实施例中，所述加入冻干保护剂为：每100mL所述脂肪间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：2～7g聚乙二醇、1～5g魔芋糖、0.1～1g脯氨酸、0.5～1.5g谷胱甘肽、0.01～0.05g苯甲酸钠、0.1～0.5g十二烷基磺酸钠、0.2～0.8g四氢嘧啶。
在其中一些实施例中，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，具体技术方案如下：
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，由如上所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的应用，具体技术方案如下：
脂肪间充质干细胞因子冻干粉在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在培养干细胞中发现，低氧刺激和机械刺激在脂肪间充质干细胞的培养中，可提升细胞因子的分泌能力，本发明通过将脂肪间充质干细胞在低氧和机械刺激的环境下培养，制备得到脂肪间充质干细胞因子。其中，选用自体脂肪组织，来源广泛，避免了免疫排斥，而且能够避开社会伦理争议，该干细胞因子的制备方法制备得到的细胞因子的含量高、促进伤口愈合的活性好。
进一步地，本发明采用上述方法培养脂肪间充质干细胞制备得到的干细胞因子与合适的冻干粉保护剂制备得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其有利于干细胞因子的长期稳定保存，其制备得到的脂肪间充质干细胞因子冻干粉在促进伤口愈合和组织修复方面具有潜在的应用价值。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：(1)取脂肪组织，酶解消化、培养得脂肪间充质干细胞；(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养1～3h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脂肪间充质干细胞因子。
其中，所述脂肪组织为由医院美容科经患者同意后，获取得到的人脂肪组织。
具体地，脂肪间充质干细胞的分离纯化中，包括了1)无菌抽取自身脂肪组织，浸泡与含双抗的无菌盐水中，送入实验室；2)取出脂肪组织，无菌生理盐水，洗涤3遍，将脂肪组织转移至细胞培养皿，加入适量0.2％～0.3％EDTA-Tripsin与0.4％～0.6％蛋白酶复合酶，放入36～38℃细胞培养箱消化2～4h；3)含血清的培养基终止消化，用滤网过滤除去大块脂肪组织，转至离心管内1000～1200rpm离心9～11min后除去上清液，PBS缓冲液洗涤3遍，以去除残留血清，LONZA无血清脂肪培养基重悬细胞接种至培养瓶，放置于细胞培养箱内，36～38℃下(5±0.5)％CO2进行培养。优选地，LONZA无血清脂肪培养基为LONZA 12-725F。
优选地，步骤(1)所述的酶解消化为：采用含有0.25％EDTA与0.5％蛋白酶的复合酶溶液，于37℃消化2～4h。
优选地，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110D超滤膜，收集截流液。
优选地，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于(5±0.5)％CO2和(5±0.5)％O2的条件下培养。进一步优选地，对细胞进行机械牵拉的方法为：传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长10％～20％。更有选地，拉长15％。具体地，1)待细胞长至85％左右时进行传代培养，并进行细胞表型的鉴定；2)将P3～P5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，对细胞进行37℃，5％CO2，5％O2作用6h，之后根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％，继续置于二氧化碳培养箱培养；3)待细胞浓度达到85％～90％收集细胞上清液，9000～10000rpm，4～6℃，离心8～12min，以除去细胞碎片。
本发明还提供了一种充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：将如上所述制备得到的脂肪间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
优选地，所述冻干保护剂为：每100mL所述脂肪间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：5～15g脱脂乳粉、1～10g海藻糖、2～8g羧甲基纤维素、1～5g羟乙基淀粉、0.01～0.1g谷氨酰胺、1～5g泊洛沙姆。
进一步优选地，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，由上述方法制备得到。
本发明所述的脂肪间充质干细胞因子冻干粉，还可以在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中应用，其具有很好的促进伤口愈合和组织修复功能。
本发明所选用的细胞培养基及冻干粉保护剂中均无血清的添加，避免了病原微生物的感染问题，在后续的应用中，尤其是在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用中，具有较高安全性，且具有优异的效果。
下面结合具体实施例对本发明进行更全面的说明：
实施例1
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，具体步骤如下：
(一)冻干保护剂的配制
每100mL细胞因子浓缩液有以下组分：5g聚乙二醇、3g魔芋糖、0.5g脯氨酸、1g谷胱甘肽、0.025g苯甲酸钠、0.25g十二烷基磺酸钠、0.5g四氢嘧啶。
(二)脂肪间充质干细胞的分离纯化
1)无菌抽取自身脂肪组织，浸泡与含双抗的无菌盐水中，送入实验室；
2)取出脂肪组织，无菌生理盐水，洗涤3遍，将脂肪组织转移至细胞培养皿，加入适量0.25％EDTA-Tripsin+0.5％蛋白酶复合酶，放入37℃细胞培养箱消化3h；
3)含血清的培养基终止消化，用滤网过滤除去大块脂肪组织，转至离心管内1000rpm离心10min后除去上清液，PBS缓冲液洗涤3遍，以去除残留血清，LONZA无血清脂肪培养基重悬细胞接种至培养瓶，放置于细胞培养箱内，37℃下5％CO2进行培养。
(三)脂肪间充质干细胞因子的制备
1)待细胞长至85％左右时进行传代培养，并进行细胞表型的鉴定；
2)将P3～P5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，细胞进行37℃，5％CO2，5％O2作用2h，之后根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长15％，继续置于二氧化碳培养箱培养；
3)待细胞浓度达到85％～90％收集细胞上清液，10000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片。
(四)脂肪间充质干细胞冻干粉的制备
1)上述离心后的上清液，经0.22μm滤膜过滤上清除菌；
2)然后通过40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100D超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液,即可
3)冻干前，先加入冻干保护剂；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶；
4)西林瓶的溶液以10℃/min的速度降至-50℃，维持冷冻2小时；
后置于真空冷冻干燥机中于压强35Pa，温度-30℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
实施例2
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，(三)脂肪间充质干细胞因子的制备：2)将P3～P5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，对细胞进行37℃，5％CO2，5％O2作用2h，继续置于二氧化碳培养箱培养；即不进行根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长15％的操作。
其余步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，(三)脂肪间充质干细胞因子的制备：2)将P3～P5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长15％，继续置于二氧化碳培养箱培养；即不进行对细胞进行37℃，5％CO2，5％O2作用2h的操作。
其余步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂为每100mL细胞因子浓缩液有以下组分：2g聚乙二醇、1g魔芋糖、0.1g脯氨酸、0.51g谷胱甘肽、0.01g苯甲酸钠、0.1g十二烷基磺酸钠、0.2g四氢嘧啶。
其余步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂为每100mL细胞因子浓缩液有以下组分：7g聚乙二醇、5g魔芋糖、1g脯氨酸、1.5g谷胱甘肽、0.05g苯甲酸钠、0.5g十二烷基磺酸钠、0.8g四氢嘧啶。
其余步骤与实施例1相同。
对比例1
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，步骤(三)脂肪间充质干细胞因子的制备：2)将P3～P5细胞传至细胞培养皿中置于二氧化碳培养箱培养；不进行机械牵拉和气体环境的改变等操作。
其余步骤与实施例1相同。
对比例2
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂的配制：每100mL细胞因子浓缩液有以下组分10g葡萄糖、7g海藻糖、3g人血白蛋白。
其余步骤与实施例1相同。
对比例3
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂中缺少十二烷基磺酸钠。
其余步骤与实施例1相同。
对比例4
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂中缺少四氢嘧啶。
其余步骤与实施例1相同。
实验例1细胞因子分泌量检测
检测实施例1～3及对比例1间充质干细胞不同的培养方法，对细胞因子含量的影响，用ELISA试剂盒对表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的细胞因子进行检测。结果如表1所示。
表1 不同的培养方法的间充质干细胞的细胞因子分泌量
组别 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
EGF(ng/mL) 55.353 46.762 45.346 35.554
FGF(ng/mL) 105.158 83.341 80.353 50.333
VEGF(ng/mL) 51.578 45.136 43.368 30.723
由表1可见，实施例1～3所制备的EGF、FGF、VEGF三种细胞因子含量均高于对比例1，结果说明：机械牵拉、5％O2的低氧环境中培养，有利于脂肪间充质干细胞分泌细胞因子，脂肪间充质干细胞在低氧和机械刺激的环境下，分泌细胞因子的能力增强。实施例1中各细胞因子的分泌量最多，可见机械牵拉和低氧环境按一定的顺序、共同作用所起到的效果更佳。
实验例2不同冻干保护剂的效果检测
检测实施例1、4、5，及对比例2～4不同冻干粉剂制备得到的脂肪间充质干细胞冻干粉末中各细胞因子含量，分别放置0、6、12个月后，用ELISA试剂盒对表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为代表的细胞因子进行检测。
其中，将实施例1、4、5，及对比例2～4中的冻干粉与溶媒以1：3的比例混匀，其中溶媒为：3g透明质酸、2gVC溶于50mL无菌纯化水中制备得到。
检测结果如表2所示。
表2 不同冻干粉中的间充质干细胞的细胞因子的含量
由表2可见，实施例1、4、5所制备的生长因子含量均高于对比例3、4，且放置12个月后，其干细胞因子的含量下降程度很小，说明本发明提供的冻干保护剂，在聚乙二醇、魔芋糖、脯氨酸、谷胱甘肽、苯甲酸钠、十二烷基磺酸钠、四氢嘧啶各组分的合理配合下，一方面在间充质干细胞因子在冻干时起到保护作用，保持冻干后的初始细胞因子的含量，另一方面有利于间充质干细胞因子后续储存的稳定性，在储存一定时间后也无明显含量降低，有效维持了干细胞因子的含量。其中，对比例3中缺少了十二烷基磺酸钠，对比例4中缺少了四氢嘧啶，其打破了本发明冻干保护剂中各组分的合理配合效果，尤其是缺少了四氢嘧啶和十二烷基磺酸钠的协同作用，从而导致了对比例3和对比例4所述的制备方法制备得到的间充质干细胞冻干粉末中的干细胞因子含量降低，并且在放置6个月和12个月后其含量也有明显下降。而对比例2中，其在制备得到后放置0个月的干细胞因子含量与实施例5虽然没有显著差异，但是，其在放置6个月及放置12个月后，干细胞因子的含量降低，而且，对比例2中采用了人血白蛋白，其具有免疫原性，因此不建议采用。
实验例3细胞活性检测
本实验检测实施例1、4、5，及对比例2～4不同冻干粉保护剂，放置12个月的各细胞因子活性对创面愈合的影响。
1)选取18只健康新西兰兔，耳缘静脉消毒缓慢注射3％戊巴比妥钠溶液，待其完全麻醉后进行实验；
2)选取腹部，剃毛用碘伏对其进行消毒，然后用手术刀作1×1cm的创面；
3)先用普通灭菌纱布吸收血液，将实施例1、4、5，及对比例2～4制备的冻干粉，制成水溶液涂抹于伤口处，每日一次，然后用纱布包扎；每组各3只兔；
4)每天观察腹部伤口的变化，观察各伤口的愈合情况、统计新西兰兔的伤口愈合的天数，结果如表3所示。
表3 干细胞冻干粉用于促进伤口愈合的效果
由表3可见，实施例1、4、5所制备的干细胞因子冻干粉用于促进兔创面愈合时，兔的愈合平均天数明显小于对比例2～4，说明实施例1、4、5的生长因子活性均高于对比例3、4。本发明所述的干细胞因子冻干粉在聚乙二醇、魔芋糖、脯氨酸、谷胱甘肽、苯甲酸钠、十二烷基磺酸钠、四氢嘧啶各组分的合理配合，有利于保护间充质干细胞因子在冻干及后续储存的稳定性，有效维持了干细胞因子的生物活性，有效保证了冻干后的干细胞因子促进创面愈合的活性。其中，对比例3中缺少了十二烷基磺酸钠，对比例4中缺少了四氢嘧啶，其打破了本发明冻干保护剂中各组分的合理配合效果，从而导致了对比例3和对比例4所述的制备方法制备得到的间充质干细胞冻干粉末中的干细胞因子的活性远不如实施例1，其促进创面愈合的平均时间也较长。对比例2中没有采用如本发明所述的冻干保护剂，而是采用了传统常用的葡萄糖、海藻糖与人血白蛋白组成的冻干粉保护剂，其制备得到的干细胞因子冻干粉中的干细胞因子虽然也具有一定的促进创面愈合效果，但效果也比本发明实施例1中的稍差。而且对比例2中的冻干保护剂中采用了人血白蛋白，具有免疫原性，因此不建议采用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取脂肪组织，酶解消化、培养得脂肪间充质干细胞；
(2)传代3～5次，即至P3～P5代后，置于低氧环境中培养1～3h，并对细胞进行机械牵拉；
(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；
(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脂肪间充质干细胞因子。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于氧气浓度为(5±0.5)％的条件下培养。
3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，所述对细胞进行机械牵拉的方法为：
传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长10％～20％。
4.根据权利要求1～3任一项所述的脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的酶解消化为：采用含有EDTA-Tripsin与蛋白酶的复合酶溶液，于37℃消化2～4h。
5.根据权利要求1～3任一项所述的脂肪间充质干细胞因子的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110D超滤膜，收集截流液。
6.一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如权利要求1～5任一项所述制备得到的脂肪间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
7.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述加入冻干保护剂为：每100mL所述脂肪间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：2～7g聚乙二醇、1～5g魔芋糖、0.1～1g脯氨酸、0.5～1.5g谷胱甘肽、0.01～0.05g苯甲酸钠、0.1～0.5g十二烷基磺酸钠、0.2～0.8g四氢嘧啶。
8.根据权利要求6或7所述的脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50Pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
9.一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，如权利要求6～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的脂肪间充质干细胞因子冻干粉在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用。
CN201910049287.XA 2019-01-18 2019-01-18 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 Active CN109627315B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910049287.XA CN109627315B (zh) 2019-01-18 2019-01-18 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910049287.XA CN109627315B (zh) 2019-01-18 2019-01-18 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109627315A true CN109627315A (zh) 2019-04-16
CN109627315B CN109627315B (zh) 2020-07-14

Family

ID=66062219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910049287.XA Active CN109627315B (zh) 2019-01-18 2019-01-18 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109627315B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112625114A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 瑞诺威德(杭州)医学科技有限公司 一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法
CN113957041A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法
CN113957040A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用
CN114042030A (zh) * 2021-11-29 2022-02-15 北京戴域生物技术有限公司 一种含有脂肪间充质干细胞冻干粉的化妆品及抗炎药物
CN115462370A (zh) * 2022-11-03 2022-12-13 能科达(上海)干细胞研究中心有限公司 一种用于保存脐带近全能干细胞的凝胶溶液及其应用
CN115786258A (zh) * 2023-02-01 2023-03-14 昆明时光肌生物技术有限公司 一种细胞培养基添加物制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103251649A (zh) * 2013-04-17 2013-08-21 广州爱菲科生物科技有限公司 人间充质干细胞培养上清液冻干粉及其制备方法
CN106701672A (zh) * 2017-01-10 2017-05-24 广东康仹生命科技有限公司 一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
CN107260570A (zh) * 2017-06-14 2017-10-20 南京仯素生物科技有限公司 一种间充质干细胞因子组合物及其制备方法和用途
CN108186548A (zh) * 2018-03-19 2018-06-22 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103251649A (zh) * 2013-04-17 2013-08-21 广州爱菲科生物科技有限公司 人间充质干细胞培养上清液冻干粉及其制备方法
CN106701672A (zh) * 2017-01-10 2017-05-24 广东康仹生命科技有限公司 一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
CN107260570A (zh) * 2017-06-14 2017-10-20 南京仯素生物科技有限公司 一种间充质干细胞因子组合物及其制备方法和用途
CN108186548A (zh) * 2018-03-19 2018-06-22 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种具有抗衰老效果的干细胞因子精华液的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SANG CHUL LEE等: "Hypoxic Conditioned Medium From Human Adipose-Derived Stem Cells Promotes Mouse Liver Regeneration Through JAK/STAT3 Signaling", 《STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113957041A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 人脂肪干细胞生长因子冻干粉及其制备方法
CN113957040A (zh) * 2020-07-20 2022-01-21 维他利肤(北京)生物科技有限公司 一种脂肪干细胞生长因子提取物及其制备方法和应用
CN112625114A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 瑞诺威德(杭州)医学科技有限公司 一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法
CN114042030A (zh) * 2021-11-29 2022-02-15 北京戴域生物技术有限公司 一种含有脂肪间充质干细胞冻干粉的化妆品及抗炎药物
CN114042030B (zh) * 2021-11-29 2022-06-24 上海天安智谷干细胞科技集团有限公司 一种含有脂肪间充质干细胞冻干粉的化妆品及抗炎药物
CN115462370A (zh) * 2022-11-03 2022-12-13 能科达(上海)干细胞研究中心有限公司 一种用于保存脐带近全能干细胞的凝胶溶液及其应用
CN115786258A (zh) * 2023-02-01 2023-03-14 昆明时光肌生物技术有限公司 一种细胞培养基添加物制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109627315B (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109627315A (zh) 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
CN106701672B (zh) 一种人源脂肪间充质干细胞因子及其制备方法和用途
CN109593124A (zh) 脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
CN106344493A (zh) 含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法
CN108823156A (zh) 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法
KR101495281B1 (ko) 피부 재생 또는 상처 치유를 위한 중간엽 줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽 줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물
CN101974484B (zh) 一种人脐带间充质干细胞的制备方法
CN103079577B (zh) 伤口修复剂组合物的制备工艺、管子及装置
CN108653327B (zh) 一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法
CN108486047B (zh) 一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法
CN104946585A (zh) 一种人间充质干细胞培养液上清的生产方法及冻干方法及应用
CN106754639A (zh) 一种间充质干细胞因子大规模制备方法
US9173903B2 (en) Fluid associated with adult stem cells for medical, cosmetic, and veterinary use
CN107034183A (zh) 制备自体脂肪干细胞生物活性肽冻干粉的方法
CN107523533A (zh) 自体皮肤成纤维细胞、prp及胶原蛋白液的获取方法
CN103272258A (zh) 一种新的冻干富血小板纤维蛋白及其制备和应用
CN103898049A (zh) 一种活细胞精华液产品及其制备方法和应用
WO2018065092A1 (en) Compositions comprising adjustable concentrations of growth factors derived from blood serum and clot hypoxia-conditioned medium and methods of their production
CN108057116A (zh) 干细胞组合物在皮肤损伤治疗药物中的应用
CN104586778B (zh) 一种外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子冻干制剂
CN105477626A (zh) 混合干细胞制剂及其制备方法
CN107126556A (zh) 一种干细胞提取物及其制备方法与在制备皮肤创面修复制剂中的应用
CN104622709B (zh) 人干细胞因子皮肤修复液及其制备方法
CN108066750A (zh) 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途
CN113842398A (zh) 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant