CN112625114A - 一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法，一种含有蛋白的保护剂，该保护剂包含1‑5g/L的大豆肽、1‑5g/L的人参肽、0.5‑1.5g/L的白蛋白、0.5‑1.5g/L的谷胱甘肽、0.7‑1.2g/L的谷氨酰胺、80‑120IU/ML的表皮细胞生长因子与80‑120IU/ML的成纤维细胞生长因子。本发明所述的间充质干细胞因子的保存方法采用人脐带间充质干细胞作为活性细胞因子的来源，间充质干细胞的上清液中富含表皮生长因子、血管内皮生长因子和干细胞因子等活性因子成分，该活性因子能够促进体内干细胞的生长和增殖，促进肠道内的细胞组织等加快增殖速度。
Description
技术领域
本发明属于生物干细胞领域，尤其是涉及一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法。
背景技术
间充质干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究的热点。间充质干细胞可以分泌多种细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。
有研究表明在培养的过程中脐带间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如分泌表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，肝细胞生长因子(Hepatocyte GrowthFactor，HGF)，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)，血管内皮生长因子(Vascularendothelial Growth Factor，VEGF)，神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)等，这些细胞因子都能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用,但是间充质干细胞因子长期保存的话其活性普遍下降，使用效果减弱，因此如何制备一种可长效保存间充质干细胞因子成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种含有蛋白的保护剂及间充质干细胞因子的保存方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种含有蛋白的保护剂，该保护剂包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人参肽、0.5-1.5g/L的白蛋白、0.5-1.5g/L的谷胱甘肽、0.7-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮细胞生长因子与80-120IU/ML的成纤维细胞生长因子。
优选的，所述的保护剂包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人参肽、1-1.5g/L的白蛋白、1-1.5g/L的谷胱甘肽、1-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮细胞生长因子与80-120IU/ML的成纤维细胞生长因子。
一种含有蛋白的保护剂的制备方法：包括如下步骤：将大豆肽、人参肽、白蛋白、谷胱甘肽、谷氨酰胺、表皮细胞生长因子与成纤维细胞生长因子混合均匀后即得。
一种间充质干细胞因子的保存方法，包括如下步骤：
(1)脐带组织培养：将组织块接种于培养瓶底部，然后添加培养液，培养7-8天后，组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养1-2天，培养得到的细胞为P0，将贴壁细胞转移到其他培养瓶中培养，培养得到的细胞为P1；
(2)间充质干细胞传代培养：将P1细胞传代培养至P6，收集P2至P6细胞的培养上清液，在P2至P6细胞的培养基中加入权利要求1或2所述的保护剂，然后置于温度为35-40℃、CO2浓度为3-8％的条件下培养，培养至细胞融合度达到70-90％时，将细胞进行水浴热激，然后在低压氧仓中处理5-20分钟，再放入低氧环境中处理5-20分钟，然后取出继续培养；
(3)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将所述的步骤(2)中收集的培养上清液进行高速离心，收集离心后上清液进行浓缩、除菌；
(4)长效细胞因子的制备：在所述的步骤(3)中除菌后的浓缩液中加入权利要求1或2所述的保护剂，经充分混合后即成。
进一步，所述的步骤(1)中的培养液为含1％血清替代物的DMEM/F12。
进一步，所述的步骤(2)中的水浴热激步骤的温度为38-42℃，时间为5-15分钟。
进一步，所述的步骤(2)中的低压氧仓的压力为10-12KPa；所述的步骤(2)中的低氧环境的氧气浓度为15-18％。
进一步，所述的步骤(2)中的保护剂在P2至P6细胞的培养基的终浓度为1-5g/L；所述的步骤(4)中的保护剂在浓缩液中的终浓度为1-5g/L。
进一步，所述的步骤(3)中的离心步骤的转速为3000-5000r/min，时间为20-30分钟；所述的步骤(3)中的除菌后的上清液储存于-20--80℃的条件下。
进一步，所述的步骤(3)中间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌的具体步骤为：将收集的培养上清液于室温解冻，通过滤膜过滤掉参与细胞，然后超滤收集分子量在3-30KD的细胞因子的浓缩液，通过滤膜过滤除菌，将浓缩液收集。
进一步，所述的步骤(4)中混合步骤后将得到的间充质干细胞因子溶液存储于温度为2-8℃的环境中。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的含有蛋白的保护剂，该保护剂包含大豆肽、人参肽、白蛋白、谷胱甘肽、谷氨酰胺、表皮细胞生长因子与成纤维细胞生长因子，其中大豆肽、人参肽、谷胱甘肽、谷氨酰胺是作为细胞生长过程的营养物质，是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源，细胞需要谷氨酰胺及其他氨基酸来合成蛋白质，在缺少这些物质的时候，细胞会由于生长不良而死亡，而白蛋白可以作为细胞生长的保护剂，保持细胞良好的生长状态，表皮细胞生长因子与成纤维细胞生长因子作为细胞生长过程中所需的重要的细胞因子，能够促进细胞的正常生长，维持细胞表型的正常表达。其中谷氨酰胺和各种肽类之间科相互补充并能促进彼此的利用率，并且利于细胞的生长，而两种细胞因子可以提高细胞的生长速率从而也能增加各种肽的利用率，总之各种添加物之间是相互促进的作用。
本发明所述的间充质干细胞因子的保存方法采用人脐带间充质干细胞作为活性细胞因子的来源，间充质干细胞的上清液中富含表皮生长因子、血管内皮生长因子和干细胞因子等活性因子成分，该活性因子能够促进体内干细胞的生长和增殖，促进肠道内的细胞组织等加快增殖速度。经过本发明纯化的间充质干细胞培养过程中分泌的细胞因子而得到的原液纯度高，蛋白含量高，修复效果显著。
本发明所述的间充质干细胞因子的保存方法采用含血清替代物的培养基培养脐带干细胞，安全可靠，避免传统的血清培养法可能会引起的免疫排斥反应。
本发明所述的间充质干细胞因子的保存方法将干细胞因子进行充分的保护，可以在低温条件下保存很长时间；解决了干细胞因子不能长时间保存的问题。
本发明所述的间充质干细胞因子的保存方法能够生产出用于可长期保存且保持高活性的脐带间充质干细胞因子。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种含有蛋白的保护剂，该保护剂包含1g/L的大豆肽、1g/L的人参肽、0.5g/L的白蛋白、0.5g/L的谷胱甘肽、0.7g/L的谷氨酰胺、80IU/ML的表皮细胞生长因子与80IU/ML的成纤维细胞生长因子。
一种间充质干细胞因子的保存方法，包括如下步骤：
(1)筛选培养对象并分离：脐带的筛选是选取孕妇年龄在22-28周岁，孕期≤40周，健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的脐带采集液保存，于冰盒内尽快运输；
(2)脐带清洗及处理：置于无菌杯皿中用75％酒精快速清洗一遍，再用含双抗的无菌生理盐水反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的无菌生理盐水将组织块漂洗干净，并用眼科剪将脐带分小段剪碎置于无菌杯皿中，再进一步将脐带剪碎至2-4mm的细小组织块；
(3)脐带组织培养：将组织块按照合适的密度接种于培养瓶底部，培养瓶为是T75cm2无菌无热原TC表面透气型培养瓶，添加1％含血清代替物的DMEM/F12培养液，定期观察更换或添加培养液；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养2d，此时细胞为P0，用TrypLE消化将贴壁细胞转移到新的培养瓶中培养，培养瓶为T175cm2无菌无热原TC表面透气型培养瓶，此时细胞为P1；
(4)间充质干细胞传代培养：将步骤(3)中分离的细胞继续传代培养至P6，传代是当培养瓶中细胞生长达到90％融合时，TrypLE消化细胞，1：4传代培养，开始收集P2至P6的培养上清液；P2至P6培养所使用的培养基中添加保护剂，保护剂终浓度为1g/L，将培养瓶放置于37℃，5％的CO2的培养箱培养，待培养至细胞融合度达到80％的时候，把培养瓶放到42℃水浴锅中10分钟热激，然后在11.6KPa的低压氧仓中处理10分钟，再放到低于正常氧气80％的低氧环境中处理10分钟。拿出放到培养箱中继续培养；
(5)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将步骤(4)中收集的培养上清液进行高速离心，3000r/min离心30min，重新用无菌无热原容器收集离心后上清液，将多次收集的上清液储存于-20℃；将收集的培养上清液于室温解冻，通过0.45um滤膜过滤除掉参与细胞，在通过滤膜超滤收集分子量在3-30KD的细胞因子的浓缩液，通过0.22um滤膜过滤除菌，收集浓缩液，再通过过滤装置对浓缩液进行除菌并分装至无菌无热原瓶中；
(6)长效细胞因子的制备：浓缩液中添加保护剂，保护剂终浓度为5g/L，经充分混合之后制成长效间充质干细胞因子溶液，存储温度为2-8℃。
实施例2
一种含有蛋白的保护剂，该保护剂包含2g/L的大豆肽、2g/L的人参肽、1g/L的白蛋白、1g/L的谷胱甘肽、1g/L的谷氨酰胺、80IU/ML的表皮细胞生长因子与80IU/ML的成纤维细胞生长因子。
一种间充质干细胞因子的保存方法同实施例1。
实施例3
一种含有蛋白的保护剂，该保护剂包含5g/L的大豆肽、5g/L的人参肽、1.5g/L的白蛋白、1.5g/L的谷胱甘肽、1.2g/L的谷氨酰胺、100IU/ML的表皮细胞生长因子与80IU/ML的成纤维细胞生长因子。
一种间充质干细胞因子的保存方法同实施例1。
对比例1
一种间充质干细胞因子的保存方法，包括如下步骤：
(1)筛选培养对象并分离：脐带的筛选是选取孕妇年龄在22-28周岁，孕期≤40周，健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的脐带采集液保存，于冰盒内尽快运输；
(2)脐带清洗及处理：置于无菌杯皿中用75％酒精快速清洗一遍，再用含双抗的无菌生理盐水反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的无菌生理盐水将组织块漂洗干净，并用眼科剪将脐带分小段剪碎置于无菌杯皿中，再进一步将脐带剪碎至2-4mm的细小组织块；
(3)脐带组织培养：将组织块按照合适的密度接种于培养瓶底部，培养瓶为是T75cm2无菌无热原TC表面透气型培养瓶，添加1％含血清代替物的DMEM/F12培养液，定期观察更换或添加培养液；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养2d，此时细胞为P0，用TrypLE消化将贴壁细胞转移到新的培养瓶中培养，培养瓶为T175cm2无菌无热原TC表面透气型培养瓶，此时细胞为P1；
(4)间充质干细胞传代培养：将步骤(3)中分离的细胞继续传代培养至P6，传代是当培养瓶中细胞生长达到90％融合时，TrypLE消化细胞，1：4传代培养，开始收集P2至P6的培养上清液；P2至P6细胞，将培养瓶放置于37℃，5％的CO2的培养箱培养，待培养至细胞融合度达到80％的时候，把培养瓶放到42℃水浴锅中10分钟热激，然后在11.6KPa的低压氧仓中处理10分钟，再放到低于正常氧气80％的低氧环境中处理10分钟，拿出放到培养箱中继续培养；
(5)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将步骤(4)中收集的培养上清液进行高速离心，3000r/min离心30min，重新用无菌无热原容器收集离心后上清液，将多次收集的上清液储存于-20℃；将收集的培养上清液于室温解冻，通过0.45um滤膜过滤除掉参与细胞，在通过滤膜超滤收集分子量在3-30KD的细胞因子的浓缩液，通过0.22um滤膜过滤除菌，收集浓缩液，再通过过滤装置对浓缩液进行除菌并分装至无菌无热原瓶中；
(6)长效细胞因子的制备：经充分混合之后制成长效间充质干细胞因子溶液，存储温度为2-8℃。
对比例2
一种含有蛋白的保护剂，该保护剂中包含0.5g/L的谷胱甘肽、80IU/ML的表皮细胞生长因子和80IU/ML的成纤维细胞生长因子进行培养。
一种间充质干细胞因子的保存方法同实施例1。
对实施例与对比例中制备得到的可长效保存间充质干细胞因子进行检测检测：
脐带间充质干细胞的鉴定：收集P2细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原，结果表明细胞能够表达干细胞特征性表面抗原CD73、CD90、CD105等，未能表达表面抗原CD19、CD34、CD45等，证明培养的细胞为人间充质干细胞。
人脐带间充质干细胞因子溶液外观及稳定性检测：所生产的因子溶液为无色透明澄清液体。精密PH试纸检测所溶解的冻干粉，PH值在6.5-7.5之间。细胞因子在室温下保存，1d/7d/14d外观无变化；溶解后4℃保存，1d/7d/14d外观无变化。
人脐带间充质干细胞分泌因子的测定：应用abcam的Human EGF ELISA Kit和Human FGF ELISA Kit检测试剂盒对两种细胞因子表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的含量进行测定，取过滤浓缩的细胞因子原液进行测定，测定结果如表1-2所示。
表1细胞表型鉴定结果
| 分组/表型 | CD19 | CD34 | CD45 | CD73 | CD90 | CD105 |
| 实施例1 | 1.23％ | 0.89％ | 1.58％ | 95.3％ | 96.3％ | 95.8％ |
| 实施例2 | 2.13％ | 1.35％ | 0.76％ | 97.1％ | 95.9％ | 96.5％ |
| 实施例3 | 0.98％ | 1.27％ | 1.02％ | 96.8％ | 97.4％ | 98.1％ |
| 对比例1 | 1.25％ | 2.13％ | 1.87％ | 95.7％ | 95.5％ | 96.3％ |
| 对比例2 | 2.34％ | 1.78％ | 1.68％ | 95.6％ | 96.1％ | 97.2％ |
从表1的数据可以看到实施例中从实施例1到实施例3细胞表型纯度是逐渐增加的，实施例3的纯度最高，而对比例1和对比例2的细胞纯度均低于实施例1-3，表明添加物的含量对于细胞的生长和细胞纯度有一定的影响。
表2细胞因子蛋白总含量检测平均值(mg/ml)
| 存放时间 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 |
| 0天 | 1.12 | 1.12 | 1.12 | 1.12 | 1.12 |
| 7天 | 1.10 | 1.11 | 1.11 | 1.0 | 0.97 |
| 14天 | 0.97 | 1.00 | 1.07 | 0.95 | 0.87 |
| 1个月 | 0.91 | 0.93 | 0.92 | 0.85 | 0.76 |
| 3个月 | 0.83 | 0.86 | 0.84 | 0.71 | 0.65 |
| 6个月 | 0.65 | 0.71 | 0.78 | 0.6 | 0.38 |
| 12个月 | 0.52 | 0.63 | 0.72 | 0.27 | 0.19 |
| 24个月 | 0.35 | 0.43 | 0.69 | 0.13 | 0.10 |
从表2的数据可以看到实施例中从实施例1到实施例3细胞因子蛋白总含量是逐渐增加的，实施例3的细胞因子蛋白总含量最高，而对比例1和对比例2的因子蛋白总含量比实施例1-3均有一定差距，说明添加物对于细胞因子的保存已经延缓细胞因子的降解有显著的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含有蛋白的保护剂，其特征在于：该保护剂包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人参肽、0.5-1.5g/L的白蛋白、0.5-1.5g/L的谷胱甘肽、0.7-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮细胞生长因子与80-120IU/ML的成纤维细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的含有蛋白的保护剂，其特征在于：所述的保护剂包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人参肽、1-1.5g/L的白蛋白、1-1.5g/L的谷胱甘肽、1-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮细胞生长因子与80-120IU/ML的成纤维细胞生长因子。
3.一种间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)脐带组织培养：将组织块接种于培养瓶底部，然后添加培养液，培养7-8天后，组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养1-2天，培养得到的细胞为P0，将贴壁细胞转移到其他培养瓶中培养，培养得到的细胞为P1；
(2)间充质干细胞传代培养：将P1细胞传代培养至P6，收集P2至P6细胞的培养上清液，在P2至P6细胞的培养基中加入权利要求1或2所述的保护剂，然后置于温度为35-40℃、CO2浓度为3-8％的条件下培养，培养至细胞融合度达到70-90％时，将细胞进行水浴热激，然后在低压氧仓中处理5-20分钟，再放入低氧环境中处理5-20分钟，然后取出继续培养；
(3)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将所述的步骤(2)中收集的培养上清液进行高速离心，收集离心后上清液进行浓缩、除菌；
(4)长效细胞因子的制备：在所述的步骤(3)中除菌后的浓缩液中加入权利要求1或2所述的保护剂，经充分混合后即成。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的培养液为含1％血清替代物的DMEM/F12。
5.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的水浴热激步骤的温度为38-42℃，时间为5-15分钟。
6.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的低压氧仓的压力为10-12KPa；所述的步骤(2)中的低氧环境的氧气浓度为15-18％。
7.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的保护剂在P2至P6细胞的培养基的终浓度为1-5g/L；所述的步骤(4)中的保护剂在浓缩液中的终浓度为1-5g/L。
8.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的离心步骤的转速为3000-5000r/min，时间为20-30分钟；所述的步骤(3)中的除菌后的上清液储存于-20--80℃的条件下。
9.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(3)中间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌的具体步骤为：将收集的培养上清液于室温解冻，通过滤膜过滤掉参与细胞，然后超滤收集分子量在3-30KD的细胞因子的浓缩液，通过滤膜过滤除菌，将浓缩液收集。
10.根据权利要求3所述的间充质干细胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步骤(4)中混合步骤后将得到的间充质干细胞因子溶液存储于温度为2-8℃的环境中。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210409 |
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