CN108309822A - 一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，包括脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞上清液获取、间充质干细胞因子的分离纯化、间充质干细胞因子冻干粉制备。本发明采用了无血清培养体系培养人脐带间充质干细胞，避免了FBS中动物源成分对皮肤的刺激。此外，本发明采用单一样本来源，ELISA法测定蛋白浓度准确，保证批次产品均一性。使用细胞工厂作为培养载体，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量。再者，采用低温冻干技术，使产品可在常温下保存，方便运输，且有限延长干细胞旁分泌因子活性保存期限。

Description

一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调控、促进造血干细胞归巢、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。
随着对间充质干细胞研究的不断深入，其作用机理也越来越清晰明确，主要有3方面：1、间充质干细胞旁分泌作用。2、间充质干细胞替代或修复死亡或受损的组织细胞。3、细胞直接接触，调控细胞。越来越多的研究表明，间充质干细胞旁分泌作用在其发挥治疗效果中起主要作用。脐带间充质干细胞在培养过程中可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子(EGF) ，血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子(HGF)，基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、肿瘤坏死因子(TNF)，神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、白介素6（IL-6）等。间充质干细胞所分泌的因子具有改善细胞生长微环境、调节机体免疫、促进血管再生、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等功能，对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用，能促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。
将细胞旁分泌因子提纯浓缩后添加到美容化妆品中，是化妆品行业发展的新趋势。含细胞旁分泌因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在韩国和日本，细胞旁分泌因子化妆品尤为甚行。但市面上的细胞旁分泌因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入化妆品基质的方式生产，细胞旁分泌因子含量低，均一性差，稳定性差，美容护肤抗衰效果一般。
目前技术缺陷：现有技术是用普通培养瓶培养间充质干细胞，并收集合并多代细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到细胞旁分泌因子。该方法得到的间充质干细胞旁分泌因子含量低，且该方法需要收集多代细胞培养基，效率低，且多代收集的方法制备细胞旁分泌因子，产品均一性较难保证。此外，该方法制备所得细胞旁分泌因子为液态，常温下易降解，需低温保存，加大保存和运输难度。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种细胞旁分泌因子产量高、均一性好、稳定性好，易保存和运输的人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种细胞旁分泌因子产量高、均一性好、稳定性高的人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
1、脐带间充质干细胞分离制备和鉴定
（1）取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端20cm，置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；
（2）将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块；将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次；将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次，后将其剪碎成1mm3～3mm3大小组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的T175培养瓶中培养后进行传代。其中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml；无血清完全培养基为：体积浓度为2%血清替代物和体积浓度为1% GlutaMAX™-I，其余为LONZA无血清培养基。
2、脐带间充质干细胞上清液获取
将检测合格的细胞（一般采用P3-P5代），按3~5×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5% CO2、培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度70%-80%时，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5% CO2、15% O2，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5% CO2、5%O2继续培养，72h后收集细胞上清液。采用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
3、间充质干细胞因子的分离纯化
将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣；将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液；将去沉渣后的滤液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管中，4℃，4000g离心1.5h；收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，进一步浓缩1小时；弃掉超滤管下面的液体；加盐水重复超滤离心洗涤一次。收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
4、间充质干细胞因子冻干粉制备。
将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释至适当浓度，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10 wt.％甘露醇、2 wt.%海藻糖、3 wt.%右旋糖酐、2 wt.%人血白蛋白、0.2 wt.%甘氨酸、2 wt.%氨基乙酸和0.4 wt.%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。
本发明的优点在于：
1、采用了无血清培养体系培养人脐带间充质干细胞，避免了胎牛血清中动物源成分对皮肤的刺激，特别是过敏性皮肤，安全性更加有保证，适合各种人群使用。
2、采用细胞工厂培养MSCs，提高空间利用度，收集细胞旁分泌因子效率高。
3、细胞转至细胞工厂后放低氧环境中培养，模拟间充质干细胞在生物体内环境，刺激细胞大量分泌因子。
4、样本来源单一，且采用ELISA方法测定蛋白浓度，保证批次产品均一性。有利于产品后续在美容、医疗等方面的应用。
5、采用低温冻干技术，使固态产品可在常温下保存和运输，与液态产品相比，有效延长干细胞旁分泌因子的活性保存期限。
本发明采用了无血清培养体系培养人脐带间充质干细胞，避免了FBS中动物源成分对皮肤的刺激。此外，本发明采用单一样本来源，ELISA法测定蛋白浓度准确，保证批次产品均一性。使用细胞工厂作为培养载体，模拟体内低氧环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高产量。再者，采用低温冻干技术，使产品可在常温下保存，方便运输，且有限延长干细胞旁分泌因子活性保存期限。
附图说明
图1. 人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉制备流程图。
图2. 人脐带间充质干细胞培养过程观察，A为P0代细胞，即从华通胶组织中爬出的原代细胞；B为P3代细胞。
图3A人脐带间充质干细胞表面标志物CD44检测结果。
图3B人脐带间充质干细胞表面标志物CD34检测结果。
图3C人脐带间充质干细胞表面标志物CD45检测结果。
图3D人脐带间充质干细胞表面标志物CD105检测结果。
具体实施方式
实施例1
1、脐带间充质干细胞分离制备、鉴定
脐带间充质干细胞的分离是取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备。其中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml。将脐带置于150cm2培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去约1cm长度，丢弃。再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块。将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次；将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通胶。用生理盐水充分洗涤华通胶3次，用眼科剪剪碎成2mm3大小组织块；将组织块按照合适的密度接种于T175培养瓶中，放置于37℃，5%的CO2的培养箱中贴壁2h，添加适量的无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；其中无血清完全培养基成分：体积浓度为2% PALL血清替代物和体积浓度为1% GlutaMAX™-I添加，其余为LONZA无血清培养基；8d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出。12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的T175培养瓶中培养后进行传代。
对提取的间充质干细胞进行无菌检测、支原体检测、流式检测等指标检测。
2、脐带间充质干细胞上清液获取
将检测合格的P3代细胞，按4×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5%CO2、培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度80-90%时，收集细胞上清液。采用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
3、间充质干细胞因子的分离纯化
将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣。将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液。将去沉渣后的提取液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管（Sartorius）中，每管20ml，4℃，4000g离心1.5h。收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存。更换新的超滤管重复浓缩，直至所有的提取液都浓缩收集完毕。将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩1.5h。弃掉超滤管下面的液体。每管加盐水至20ml，重复超滤离心洗涤一次。收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
4、间充质干细胞因子冻干粉制备
将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释至适当浓度，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10％甘露醇、2%海藻糖、3%右旋糖酐、2%人血白蛋白、0.2%甘氨酸、2%氨基乙酸和0.4%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。
实施例2
1、脐带间充质干细胞分离制备、鉴定
方法同实施例1。
2、脐带间充质干细胞上清液获取
将检测合格的P3代细胞，按4×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5%CO2、培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度70%-80%时，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5% CO2、15% O2，48h后调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，72h后收集细胞上清液。采用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
3、间充质干细胞因子的分离纯化
将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣。将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液。将去沉渣后的提取液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管（Sartorius）中，每管20ml，4℃，4000g离心2h。收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存。更换新的超滤管重复浓缩，直至所有的提取液都浓缩收集完毕。将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩1.5h。弃掉超滤管下面的液体。每管加盐水至20ml，重复超滤离心洗涤一次。收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
4、间充质干细胞因子冻干粉制备
将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释至适当浓度，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10％甘露醇、2%海藻糖、3%右旋糖酐、2%人血白蛋白、0.2%甘氨酸、2%氨基乙酸和0.4%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。
实施例3
1、脐带间充质干细胞分离制备、鉴定
方法同实施例1。
2、脐带间充质干细胞上清液获取
将检测合格的P3代细胞，按4×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5%CO2、培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度70%-80%时，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5% CO2、15% O2，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，72h后收集细胞上清液。采用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
3、间充质干细胞因子的分离纯化
将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣。将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液。将去沉渣后的提取液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管（Sartorius）中，每管20ml，4℃，4000g离心2h。收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存。更换新的超滤管重复浓缩，直至所有的提取液都浓缩收集完毕。将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，每管20ml，进一步浓缩2h。弃掉超滤管下面的液体。每管加盐水至20ml，重复超滤离心洗涤一次。收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。将浓缩原液收集至合适离心管内，取样用ELISA法测定代表因子VEGF、FGF、EGF浓度。
4、间充质干细胞因子冻干粉制备
将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释至适当浓度，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10％甘露醇、2%海藻糖、3%右旋糖酐、2%人血白蛋白、0.2%甘氨酸、2%氨基乙酸和0.4%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。
实施例2、3和实施例1的主要差别在于细胞培养条件，实施例2、3有采取低氧处理，极大程度提高了各因子的浓度，对脐带间充质干细胞分泌细胞因子具有很好的刺激作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括脐带间充质干细胞分离制备和鉴定、脐带间充质干细胞上清液获取、间充质干细胞因子的分离纯化、间充质干细胞因子冻干粉制备。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述的脐带间充质干细胞分离制备和鉴定方法为：
（1）取健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端20cm，置于含储运液的储运瓶中，待分离制备；
（2）将脐带置于培养皿中，用生理盐水充分洗涤脐带，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再反复洗涤脐带组织，直至无明显血块；将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次；将脐带纵向剖开，剔除血管，撕取华通胶；用生理盐水充分洗涤华通胶3次，后将其剪碎成1mm3～3mm3大小组织块；将组织块接种于培养瓶中，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁2h，添加15ml无血清完全培养基，置于培养箱中培养，培养最初7d，保持培养瓶绝对静止；8d在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出；12d细胞数量较多，去除组织块，用胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移至新的T175培养瓶中培养后进行传代。
3.根据权利要求2所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：其中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml；无血清完全培养基为：体积浓度为2%血清替代物和体积浓度为1% GlutaMAX™-I，其余为LONZA无血清培养基。
4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述脐带间充质干细胞上清液获取：将检测合格的细胞按3~5×104/ml的终浓度转至细胞工厂，做好标记，置37℃、5% CO2的培养箱中进行扩增培养；当扩增培养的细胞长至细胞融合度70%-80%时，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，24h后调整参数为37℃、5% CO2、15% O2，48h后收集半量上清液，并向细胞工厂内补充等量新鲜无血清培养基，调整参数为37℃、5% CO2、5% O2继续培养，72h后收集细胞上清液。
5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞因子的分离纯化：将收集的间充质干细胞培养上清液放入离心管中，4℃，4000g离心8min，取上清，去除细胞沉渣；将上清液通过中空纤维滤膜过滤，收集滤液；将去沉渣后的滤液用移液管转移至5KD超滤浓缩离心管中，4℃，4000g离心1.5-2h；收集浓缩后的液体至新的离心管中，4度冰箱储存；将初步浓缩后的所有提取液转移至超滤管中，进一步浓缩1.5-2h ；弃掉超滤管下面的液体；加盐水重复超滤离心洗涤一次，收集浓缩液得脐带间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液。
6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，其特征在于：间充质干细胞因子冻干粉制备为：将间充质干细胞旁分泌因子浓缩原液用生理盐水稀释，用注射器抽取浓缩原液，0.22um滤器过滤除菌，加入终浓度10wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3 wt.%右旋糖酐、2 wt.%人血白蛋白、0.2 wt.%甘氨酸、2 wt.%氨基乙酸和0.4wt.%抗坏血酸的冻存保护剂，调节蛋白浓度至1mg/ml，混匀；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶，于压强70Pa，温度40℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到人源间充质干细胞旁分泌因子冻干粉。
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