CN114515334B - 一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，包括脂肪间充质干细胞因子和保护剂，保护剂包括：甘露醇、茶氨酸、绿豆蛋白粉、丹参素钠。本发明提供的冻干粉通过添加保护剂，有效提高冻干粉中细胞因子的活性和稳定性，延长冻干粉的保存时间，为脂肪间充质干细胞因子的储存和运输提供充分的保障。本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，在制备过程中添加保护剂，操作简便，成本低，并且提高了脂肪间充质干细胞因子的储存稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞因子冻干粉，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。
脂肪间充质干细胞是指存在于脂肪组织中的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化成骨细胞、软骨细胞脂肪细胞等。脂肪间充质干细胞具有很多优点：来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视。脂肪间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞相比具有更好的增殖能力。脂肪间充质干细胞在来源、获取及本身分化增殖潜力等方面的优势，预示着其作为骨组织工程种子细胞，有着很好的应用前景。
脂肪间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞因子如VEGF、FGF、IGF、TGF-β1、EGF、PDGF等。可通过对细胞培养液的分离处理得到脂肪间充质干细胞因子。虽然脂肪间充质干细胞在培养过程中会分泌丰富的细胞因子，但是由于细胞因子的性质不稳定，导致其储存和运输比较困难，限制了脂肪间充质干细胞因子的应用。采用冻干的方法将细胞因子制成冻干粉能大大提高细胞因子储存和运输的便利性，但是对细胞因子的活性会产生不利影响，并且在存储时间上还有待提高。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，有效提高脂肪间充质干细胞因子的稳定性，便于储存和运输。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，包括脂肪间充质干细胞因子和保护剂，所述保护剂包括：甘露醇、茶氨酸、绿豆蛋白粉、丹参素钠。
优选地，所述保护剂中各成分的重量份为：甘露醇4.5-7.5份、茶氨酸3.2-5.0份、绿豆蛋白粉2.8-4.4份、丹参素钠0.4-0.8份。
优选地，所述保护剂中各成分的重量份为：甘露醇6.5份、茶氨酸4.3份、绿豆蛋白粉3.6份、丹参素钠0.6份。
优选地，所述绿豆蛋白粉的平均粒径为200-300目。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
(2)向步骤(1)的浓缩液液中加入保护剂，冷冻干燥得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
优先地，所述脂肪间充质干细胞因子浓缩液的制备过程如下：
A：取在传代培养得到的P2-P5代脂肪间充质干细胞37℃水浴复苏，离心后加入培养基重悬，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
B：然后对步骤A的脂肪间充质干细胞进行低氧处理一段时间；
C：将培养环境中的氧气浓度恢复正常，继续培养，当细胞融合度达到60-70％后收集上清液，超滤透析，收集截留液即得脂肪间充质干细胞因子浓缩液。
优先地，低氧处理过程中氧气含量为5-8％，低氧处理的时间为8-10h。
优先地，步骤C中超滤透析过程为：取上清液先经50KD的超滤膜，取透析液再通过90D的超滤膜，收集截留液即为脂肪间充质干细胞因子浓缩液。
优先地，所述脂肪间充质干细胞因子浓缩液和保护剂的用量质量比为10-15:1。
优先地，步骤A的培养基由DMEM/F12培养基，和添加在培养基的以下成分组成：胎牛血清5-10％、L-谷氨酰胺5-10μg/mL、青霉素90-100U/mL、链霉素90-100μg/mL、维生素C3-10μg/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，添加由甘露醇、茶氨酸、绿豆蛋白粉、丹参素钠组成的保护剂，有效提高冻干粉中细胞因子的活性和稳定性，延长冻干粉的保存时间，为脂肪间充质干细胞因子的储存和运输提供充分的保障。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，在制备过程中添加保护剂，操作简便，成本低，并且提高了脂肪间充质干细胞因子的储存稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1，对比例1至5的冻干粉在保存0个月以及保存6个月后FGF的含量。
图2为本发明实施例1，对比例1至5的冻干粉在保存0个月以及保存6个月后VEGF的含量。
图3为涂敷实施例1，对比例1至5冻干粉的大鼠创面愈合时间。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，由脂肪间充质干细胞因子和保护剂组成，保护剂由以下成分组成：甘露醇、茶氨酸、平均粒径为200-300目绿豆蛋白粉、丹参素钠。保护剂中各成分的重量份为：甘露醇6.5份、茶氨酸4.3份、平均粒径为200-300目绿豆蛋白粉3.6份、丹参素钠0.6份。
上述脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
A：取在液氮中冻存15d的传代培养得到的P2代脂肪间充质干细胞37℃水浴复苏，离心后加入培养基(DMEM/F12，胎牛血清8％、L-谷氨酰胺7μg/mL、青霉素95U/mL、链霉素95μg/mL、维生素C7μg/mL)重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，接种在T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
B：然后对步骤A的脂肪间充质干细胞在氧气含量为7％的环境中低氧处理8h；
C：将培养环境中的氧气浓度恢复正常，继续培养，当细胞融合度达到60％后收集上清液，先经50KD的超滤膜，取透析液再通过90D的超滤膜，收集截留液即为脂肪间充质干细胞因子浓缩液。
(2)向步骤(1)的浓缩液液中加入保护剂，脂肪间充质干细胞因子浓缩液和保护剂的用量质量比为10:1，冷冻干燥得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，由脂肪间充质干细胞因子和保护剂组成，保护剂由以下成分组成：甘露醇、茶氨酸、平均粒径为200-300目绿豆蛋白粉、丹参素钠。保护剂中各成分的重量份为：甘露醇4.5份、茶氨酸3.2份、绿豆蛋白粉2.8份、丹参素钠0.4份。
上述脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
A：取在液氮中冻存24d的传代培养得到的P5代脂肪间充质干细胞37℃水浴复苏，离心后加入培养基(DMEM/F12，胎牛血清5％、L-谷氨酰胺5μg/mL、青霉素90U/mL、链霉素90μg/mL、维生素C3μg/mL)重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，接种在T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
B：然后对步骤A的脂肪间充质干细胞在氧气含量为5％的环境中低氧处理10h；
C：将培养环境中的氧气浓度恢复正常，继续培养，当细胞融合度达到65％后收集上清液，先经50KD的超滤膜，取透析液再通过90D的超滤膜，收集截留液即为脂肪间充质干细胞因子浓缩液。
(2)向步骤(1)的浓缩液液中加入保护剂，脂肪间充质干细胞因子浓缩液和保护剂的用量质量比为12:1，冷冻干燥得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，由脂肪间充质干细胞因子和保护剂组成，保护剂由以下成分组成：甘露醇、茶氨酸、平均粒径为200-300目绿豆蛋白粉、丹参素钠。保护剂中各成分的重量份为：甘露醇7.5份、茶氨酸5.0份、绿豆蛋白粉4.4份、丹参素钠0.8份。
上述脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
A：取在液氮中冻存30d的传代培养得到的P3代脂肪间充质干细胞37℃水浴复苏，离心后加入培养基(DMEM/F12，胎牛血清10％、L-谷氨酰胺10μg/mL、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、维生素C3-10μg/mL)重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，接种在T75培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
B：然后对步骤A的脂肪间充质干细胞在氧气含量为8％的环境中低氧处理9h；
C：将培养环境中的氧气浓度恢复正常，继续培养，当细胞融合度达70％后收集上清液，先经50KD的超滤膜，取透析液再通过90D的超滤膜，收集截留液即为脂肪间充质干细胞因子浓缩液。
(2)向步骤(1)的浓缩液液中加入保护剂，脂肪间充质干细胞因子浓缩液和保护剂的用量质量比为15:1，冷冻干燥得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
对比例1
对比例1提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，和实施例1的区别为：省去茶氨酸，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，和实施例1的区别为：省去茶氨酸，将绿豆蛋白粉的用量调整为7.9份，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，和实施例1的区别为：省去绿豆蛋白粉，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，和实施例1的区别为：省去绿豆蛋白粉，将茶氨酸的用量调整为7.9份，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，和实施例1的区别为：省去丹参素钠，其余均和实施例1相同。
将实施例1，对比例1至5的冻干粉在6℃保存，在保存前(0个月)以及保存6个月后用ELISA试剂盒检测成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的含量，结果如图1和图2所示。
由图1和图2可以看出，随着保存时间的延长，实施例1，对比例1至5中的细胞因子含量均有不同程度的下降，但是实施例1中下降幅度较小，对比例1至5冻干粉中的细胞因子含量在保存6个月后下降趋势明显，说明调整保护剂的组成后会影响冻干粉中细胞因子的稳定性，细胞因子的保存时间缩短，在保存稳定性上不及实施例1。
将实施例1，对比例1至5的冻干粉溶于灭菌的蒸馏水中备用。将实验用SD大鼠随机分为6组，每组10只，在实验开始前用10％硫化钠脱去大鼠背部的毛，用乙醚麻醉后在脱毛区域制造创面，创面面积约为1cm2，用灭菌纱布轻轻吸干净创面表面的血液，均匀涂抹冻干粉水溶液，厚度约2mm，用无菌纱布包扎，每天换药一次，观察创面完全愈合时间，结果如图3所示。
由图3可以看出不同组的大鼠创面愈合时间不同，其中实施例1组的大鼠创面愈合时间最短，对比例1至5中的大鼠创面愈合时间均长于实施例1，说明实施例1中的冻干粉活性最好，缩短创面的愈合时间。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，由脂肪间充质干细胞因子和保护剂组成，所述保护剂由以下成分组成：甘露醇、茶氨酸、绿豆蛋白粉、丹参素钠；所述保护剂中各成分的重量份为：甘露醇6.5份、茶氨酸4.3份、绿豆蛋白粉3.6份、丹参素钠0.6份；
所述脂肪间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
A：取传代培养得到的P2-P5代脂肪间充质干细胞37℃水浴复苏，离心后加入培养基重悬，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h；
B：然后对步骤A的脂肪间充质干细胞低氧处理一段时间；
C：将培养环境中的氧气浓度恢复正常，继续培养，当细胞融合度达到60-70％后收集上清液，超滤透析，超滤透析过程为：取上清液先经50KD的超滤膜，取透析液再通过90D的超滤膜，收集截留液即为脂肪间充质干细胞因子浓缩液，收集截留液即得脂肪间充质干细胞因子浓缩液；
(2)向步骤(1)的浓缩液中加入保护剂，所述脂肪间充质干细胞因子浓缩液和保护剂的用量质量比为10:1，冷冻干燥得到脂肪间充质干细胞因子冻干粉。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，所述绿豆蛋白粉的平均粒径为200-300目。
3.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，低氧处理过程中氧气含量为5-8％，低氧处理的时间为8-10h。
4.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，步骤A的培养基由DMEM/F12培养基，和添加在培养基的以下成分组成：胎牛血清5-10％、L-谷氨酰胺5-10μg/mL、青霉素90-100U/mL、链霉素90-100μg/mL、维生素C3-10μg/mL。
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