CN113736729A - 组合物及含有其的干细胞无血清培养基及干细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物及含有其的干细胞无血清培养基及干细胞培养方法，该干细胞无血清培养基的组分包含非必需氨基酸、谷氨酰胺、重组人胰岛素、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源性生长因子、重组人转化生长因子β1、重组人激活素A、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、重组人玻连蛋白、L‑谷胱甘肽、L‑抗坏血酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、亚硒酸钠以及基础培养基。该培养基能够用于UC‑MSCs原代分离培养，并且在原代培养过程中培养效果好，细胞原代爬出时间有效缩短，具有更高的CFU‑F形成能力；传代培养过程中扩增效率高，且仍维持间充质干细胞生物学特性和免疫表型稳定性。

Description

组合物及含有其的干细胞无血清培养基及干细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种组合物及含有其的干细胞无血清培养基及干细胞培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐带血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。
脐带组织属于常规医疗废弃物，来源丰富、易于采集运输，且完全没有伦理学争议，是目前最佳的MSCs来源。与骨髓等其它组织来源的MSCs相比较，脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)具有分离方法简单、成功率高、分离后细胞纯度高等优点，目前被应用于多种疾病的临床研究。
传统的间充质干细胞培养所使用的培养基大都含有动物血清，如最为常见的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。FBS成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或者被支原体感染等。另外，FBS批间差异较大，来源不稳定，对体外大规模扩增MSCs工艺影响较大。目前有研究表明，MSCs在培养过程中会吞噬培养基中的蛋白质，如果培养基中含有牛血清白蛋白，可以使受者体内产生抗牛白蛋白抗体引起免疫反应，从而导致或者尤其是在重复输注MSCs治疗后失效。因此，越来越多研究人员以及企业开始研发FBS的替代物。目前市面上血清替代物种类较多，但大都仍然含有一些动物源成分，如Ultroser G(PallBioSepra)。部分血清替代物为人血清活血请衍生物，包括人源血清、血小板衍生物、脐血清等。这些产品虽来源于人，但成分仍然不明确，而且资源少，难于实现量产，无法保证MSCs体外大规模培养。因此，无血清培养基配方成为研究的热点。目前市面上无血清培养基产品越来越多，口碑较好及使用较多的基本为国外公司所生产，如GIBCO公司的
Figure BDA0003229846730000021
hMSC SFM，Stemcell公司的MesenCult-XF Medium等。这些培养基不仅价格昂贵，不能满足量产的要求，且在培养MSCs时需对培养容器进行明胶包被，有很高的动物源蛋白引入风险。另外，这些产品大多为通用型产品，应用于各种来源MSCs，并未针对不同来源的MSCs进行更精确的研制与开发，并且更适合各种MSCs原代分离培养的专用型产品，均未有成熟的、得到市场认可的品牌出现。如公开号为CN106754670B、CN110938590B、CN106635978B、CN106190964B、CN110923196A等专利公开的MSCs无血清培养基及培养方法均仅支持UCMSCs传代培养，并不支持UC-MSCs的原代分离培养。
而传统的能够支持UCMSCs的原代分离培养的培养基配方，无法在简化配方以及培养效果上实现兼顾，难以用于量化生产。如公开号为CN103555665B的专利公开了一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基。以该无血清培养基的体积计，其包括以下成分组成：α-MEM 10.2g/L、碳酸氢钠2.4g/L、L-谷氨酰胺1mM-5mM、泊洛沙姆188 50mg/L-300mg/L、重组人白蛋白2g/L-8g/L、重组人转铁蛋白10g/L-20mg/L、重组人胰岛素2mg/L-10mg/L、Hepes1mM-5mM、β-巯基乙醇50nM、脂质0.1mg/L-1mg/L、微量元素1mg/L-5mg/L、谷胱甘肽0.1mg/L-5mg/L、对氨基苯甲酸0.5mg/L-5mg/L、氢化可的松1ng/mL-50ng/mL、维生素PP 20mg/L-50mg/L、维生素C 5mg/L-50mg/L、式I的化合物2μM-10μM、式II的化合物5μM-20μM、黄体酮10ng/mL-20ng/mL、腐胺1mg/L-10mg/L、肝素1IU/mL-10IU/mL、EGF 1ng/mL-10ng/mL、b-FGF1ng/mL-10ng/mL、HGF1ng/mL-10ng/mL、VEGF 1ng/mL-10ng/mL。该培养基能够支持UC-MSCs的原代分离培养，然而其配方组分过于复杂。如公开号为CN106906182B的专利公开了一种包含基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分，所述添加成分包括L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、TGF-β1和PDGF-BB，该培养基克服了现有技术中无血清培养基存在的细胞贴壁性差，组分相对复杂，不支持原代细胞培养等问题。但其UCMSC原代爬出时间最少为12天，原代周期较长。
在脐带间充质干细胞原代分离培养的过程中，如何在采用简化的培养基配方的情况下兼顾培养效果是亟待解决的技术问题。
发明内容
基于此，针对上述背景技术中存在的问题，本发明的主要目的是提供一种无血清细胞培养基以及干细胞的培养方法。本发明提供的培养基配方相对简单，用于干细胞原代分离培养的过程培养效果好。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案实现的：
一种组合物，包含纤连蛋白、层黏蛋白和玻连蛋白。
在其中一个实施例中，所述纤连蛋白为重组人纤连蛋白，所述层黏蛋白为重组人层黏蛋白，所述玻连蛋白为重组人玻连蛋白。
在其中一个实施例中，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(1-10)：(1-4)：(1-10)。
在其中一个实施例中，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(4.5-6.5)：(1.5-3)：(4-7.5)。
一种干细胞无血清培养基，所述干细胞无血清培养基包含如下组分：如上所述的组合物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、重组人胰岛素、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源性生长因子、重组人转化生长因子β1、重组人激活素A、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、亚硒酸钠以及基础培养基。
在其中一个实施例中，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白1mg-10mg、重组人层黏蛋白1mg-4mg和重组人玻连蛋白1mg-10mg。
在其中一个实施例中，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白4.5mg-6.5mg、重组人层黏蛋白1.5mg-3mg和重组人玻连蛋白4mg-7.5mg。
在其中一个实施例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A1μg-10μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10m-100mg，胆固醇1.1mg-4.4mg，亚油酸0.01mg-0.05mg，亚麻酸0.01mg-0.05mg，亚硒酸钠0.0001mg-0.001mg，以及基础培养基。
在其中一个实施例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10mg-100mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
在其中一个实施例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1.5mmol-2.5mmol，重组人胰岛素5mg-20mg，重组人血白蛋白1.5g-3g，重组人转铁蛋白4mg-7mg，重组人表皮生长因子15μg-30μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子15μg-35μg，重组人血小板源性生长因子15μg-25μg，重组人转化生长因子β1 3μg-7μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽2mg-6mg，L-抗坏血酸40mg-60mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基。
一种干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养间充质干细胞的步骤；所述干细胞培养基添加有如上所述的组合物，或者所述干细胞培养基选用如上所述的干细胞无血清培养基。
在其中一个实施例中，培养的阶段为原代分离培养阶段。
在其中一个实施例中，所述干细胞为间充质干细胞。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
所述的组合物和所述的干细胞无血清培养基在干细胞原代分离培养中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种简化的培养基配方，该培养基配方能够用于UC-MSCs原代分离培养，并且在原代培养过程中培养效果好，主要体现在UC-MSCs原代爬出时间有效缩短，具有更高的CFU-F形成能力；同时，原代培养UC-MSCs在后续传代培养过程中扩增效率高，且仍维持间充质干细胞生物学特性和免疫表型稳定性。本发明提供的培养基配方，无动物源成分(包括无血清)，化学成分明确，无需对培养器皿进行外基质包被。
附图说明
图1为各培养基组UC-MSCs爬出效果图(40×)；
图2为各培养基组UC-MSCs生长曲线；
图3为各培养基组UC-MSCs倍增时间比较(**表示p<0.01)；
图4为UC-MSCs成脂分化效果图(100×)；
图5为UC-MSCs成骨分化效果图(100×)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
第一方面，一种组合物，包含纤连蛋白、层黏蛋白和玻连蛋白。
在其中一个示例中，所述纤连蛋白为重组人纤连蛋白，所述层黏蛋白为重组人层黏蛋白，所述玻连蛋白为重组人玻连蛋白。
在其中一个示例中，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(1-10)：(1-4)：(1-10)。
在其中一个示例中，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(4.5-6.5)：(1.5-3)：(4-7.5)。
第二方面，本发明提供一种干细胞无血清培养基，所述干细胞无血清培养基包含如下组分：如上所述的组合物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、重组人胰岛素、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源性生长因子、重组人转化生长因子β1、重组人激活素A、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、亚硒酸钠以及基础培养基。
优选地，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白1mg-10mg、重组人层黏蛋白1mg-4mg和重组人玻连蛋白1mg-10mg。更优选地，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白4.5mg-6.5mg、重组人层黏蛋白1.5mg-3mg和重组人玻连蛋白4mg-7.5mg。
在其中一个示例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A1μg-10μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10m-100mg，胆固醇1.1mg-4.4mg，亚油酸0.01mg-0.05mg，亚麻酸0.01mg-0.05mg，亚硒酸钠0.0001mg-0.001mg，以及基础培养基。
在其中一个示例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10mg-100mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
在其中一个示例中，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1.5mmol-2.5mmol，重组人胰岛素5mg-20mg，重组人血白蛋白1.5g-3g，重组人转铁蛋白4mg-7mg，重组人表皮生长因子15μg-30μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子15μg-35μg，重组人血小板源性生长因子15μg-25μg，重组人转化生长因子β13μg-7μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽2mg-6mg，L-抗坏血酸40mg-60mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
在其中一个示例中，所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基。
可以理解的是，为适应干细胞特别是脐带间充质干细胞的培养需要，本发明的培养基可以被调至合适的渗透压，例如280OSM/kg-320mOSM/kg。例如280OSM/kg、290OSM/kg、310OSM/kg、320OSM/kg.
第三方面，本发明提供一种干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养间充质干细胞的步骤；所述干细胞培养基添加有如上所述的组合物，或者所述干细胞培养基选用如上所述的干细胞无血清培养基。
在其中一个示例中，培养的阶段为原代分离培养阶段。
在其中一个示例中，原代分离培养的时长为10天-14天。例如10天、11天、12天、13天、14天。
在其中一个示例中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
在其中一个示例中，培养采用的温度可以为37℃。
在其中一个示例中，培养的环境气氛中CO2的体积比百分比可以为5％。
本发明以下实施例所涉培养基成分信息如下表所示：
表1
Figure BDA0003229846730000091
Figure BDA0003229846730000101
实施例1、无血清培养基配方
本实施例提供一种MSC无血清培养基(配方见表2)，以DMEM/F12基础培养基为基础液，向基础液中添加以下浓度的各组分：非必需氨基酸1％(v/v)，谷氨酰胺1mM，重组人胰岛素1mg/L，重组人血白蛋白1g/L，重组人转铁蛋白1.1mg/L，重组人EGF 10μg/L，重组人bFGF10μg/L，重组人PDGF-BB 10μg/L，重组人TGF-β1蛋白1μg/L，重组人Activin A 1μg/L，重组人纤连蛋白1mg/L，重组人层黏蛋白1mg/L，重组人玻连蛋白1mg/L，L-谷胱甘肽1mg/L，L-抗坏血酸10mg/L，胆固醇1.1mg/L，亚油酸0.01mg/L，亚麻酸0.01mg/L，亚硒酸钠0.0001mg/L，DMEM/F12基础培养基补足1L。
实施例2、无血清培养基配方
本实施例提供一种MSC无血清培养基(配方见表2)，以DMEM/F12基础培养基为基础液，向基础液中添加以下浓度的各组分：非必需氨基酸1％(v/v)，谷氨酰胺2mM，重组人胰岛素10mg/L，重组人血白蛋白2g/L，重组人转铁蛋白5.5mg/L，重组人EGF 20μg/L，重组人bFGF20μg/L，重组人PDGF-BB 20μg/L，重组人TGF-β1蛋白5μg/L，重组人Activin A 5μg/L，重组人纤连蛋白5mg/L，重组人层黏蛋白2mg/L，重组人玻连蛋白5mg/L，L-谷胱甘肽4mg/L，L-抗坏血酸50mg/L，胆固醇2.2mg/L，亚油酸0.025mg/L，亚麻酸0.025mg/L，亚硒酸钠0.00067mg/L，DMEM/F12基础培养基补足1L。
实施例3、无血清培养基配方
本实施例提供一种MSC无血清培养基(配方见表2)，以DMEM/F12基础培养基为基础液，向基础液中添加以下浓度的各组分：非必需氨基酸体积比1％，谷氨酰胺4mM，重组人胰岛素50mg/L，重组人血白蛋白5g/L，重组人转铁蛋白11mg/L，重组人EGF 100μg/L，重组人bFGF 100μg/L，重组人PDGF-BB 100μg/L，重组人TGF-β1蛋白10μg/L，重组人Activin A 10μg/L，重组人纤连蛋白10mg/L，重组人层黏蛋白10mg/L，重组人玻连蛋白10mg/L，L-谷胱甘肽8mg/L，L-抗坏血酸100mg/L，胆固醇4.4mg/L，亚油酸0.05mg/L，亚麻酸0.05mg/L，亚硒酸钠0.001mg/L，DMEM/F12基础培养基补足1L。
表2、实施例1至实施例3培养基配方
Figure BDA0003229846730000111
Figure BDA0003229846730000121
对比例1、有血清完全培养基配制
向DMEM/F12基础培养基中添加以下成分：胎牛血清10％(v/v)，谷氨酰胺2mM，非必需氨基酸1％(v/v)。
对比例2、无血清培养基配制
公开号为CN106906182B专利公开的MSC无血清培养基，成分如下：1mM L-谷氨酰胺，1mM非必须氨基酸，58mg/L L-抗坏血酸，14μg/L亚硒酸钠，25mg/L纤连蛋白，3mg/L乙醇胺，10mg/L氢化可的松，1mg/L胰蛋白酶抑制剂，10mg/L人转铁蛋白，10mg/L人胰岛素，20μg/L bFGF，5μg/L TGF-β1，10μg/L PDGF-BB，余量为DMEM/F12基础培养基。
对比例3、无血清培养基配制
公开号为CN108823160B专利公开的MSC无血清培养基，成分包括：氨甲环酸10000mg/L，G-CSF 20ng/L，EGF 20ng/mL，DMEM/F12基础培养基补足1L。
验证实验：
一、UC-MSCs原代分离培养效果比较
UC-MSCs的原代分离培养包括如下步骤：
(1)DPBS(杜氏磷酸缓冲液)漂洗脐带，去除胎粪等；75％酒精润洗1min-2min，再用DPBS漂洗干净。
(2)脐带剔除动静脉及表皮，然后剪成1mm3组织块。
(3)组织块接种于10cm培养皿中(约2cm长脐带每皿)，用塑料巴氏吸管使组织块均匀分布。
(4)室温放置15min-30min，使组织块粘贴在培养皿底上。
(5)根据实验组设置，缓慢加入上述各组培养基5mL(注意加液力度，勿冲掉组织块)。
(6)放置37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
(7)培养48h后补充5mL新鲜的上述各组培养基。
(8)各实验组需观察到有细胞爬出，再进行半量换液(上述各组培养基)。
(9)放置37℃，5％CO2细胞培养箱继续培养7天-14天，观察到细胞克隆数大于10个即可去除组织块，更换新鲜培养基10mL。
(10)继续培养2天-3天，细胞汇合度达80％以上即可进行细胞传代培养。
镜下观察各组培养基培养细胞情况(见图1)：采用各实施例、对比例1和对比例3培养基培养的组织块在第7天有细胞爬出，而采用对比例2培养基培养的组织块未见细胞爬出，培养至第12天才观察到组织块周边有零星细胞爬出。这表明：采用本申请的培养基进行原代细胞分离培养的周期大大缩短了。
同时，还对各组培养基应用过程中的细胞CFU-F(成纤维细胞集落形成单位)进行统计，结果见下表：
表3、各组细胞CFU-F统计结果
实验组别 7d 10d 12d
实施例1 4 9 15
实施例2 5 11 19
实施例3 4 8 16
对比例1 3 5 8
对比例2 0 0 3
对比例3 4 8 12
根据上表可知：各实施例组培养的细胞CFU-F形成数量在第7天即优于对比例1和对比例2，其中对比例2在第7和10天未观察到细胞爬出，第12天才观察到有CFU-F。这表明：本发明的无血清培养基更适合UC-MSC的CFU-F形成，原代培养效果更好。
二、UC-MSCs扩增效率比较
实施例2和三个对比例培养基原代培养得到的UC-MSCs分别连续传代培养至P5代，按1×104/孔接种于24孔板中，置于5％CO2培养箱37℃培养。
每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个孔，连续7天，绘制细胞生长曲线，结果如表4和图2。表4及图2的结果说明：与三个对比例相比，采用实施例2培养基培养得的UC-MSCs增殖活性更高。
表4、各组UC-MSCs7天细胞计数结果
Figure BDA0003229846730000151
根据倍增时间计算公式：DT＝t×[lg2/(lgNt-lgNo)]，其中：t为培养时间；No为首次记下的细胞数；Nt为t时间后的细胞数。算得实施例2组和三个对比例组细胞倍增时间，结果见下表5和图3。
表5、各组细胞倍增时间比较
实验组别 倍增时间(小时)
实施例2 28.26±0.38**
对比例1 36.29±0.56
对比例2 41.15±2.13
对比例3 38.38±1.97
根据表5和图3可知：实施例2倍增时间为28.26±0.38，对比例1为36.29±
0.56，对比例2为41.15±2.13，对比例3为38.38±1.97。结果表明：采用实施例2培养细胞的过程中，细胞倍增时间显著低于各对比例(p<0.01)，这说明实施例2提供的无血清培养基能有效提高UC-MSCs的扩增效率。
三、UC-MSCs免疫表型比较
各实施例、对比例1、对比例2和对比例3培养基经原代培养所得UC-MSCs分别连续传代培养至P5代，按1×104/孔密度接种于T25培养瓶中，置于5％CO2培养箱37℃培养。
3天后，0.25％胰蛋白酶溶液消化收集各组UC-MSCs，流式细胞仪检测其表面marker如CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、HLA-DR等的表达情况。结果如表6。
表6、各组UC-MSCs表面marker检测结果
Figure BDA0003229846730000161
检测结果表明，各实施例与三个对比例的UC-MSCs表面markerCD105、CD73、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，各组之间无显著性差异。表明采用各实施例提供的无血清培养基培养UC-MSCs不影响其表面标记物的表达。
四、UC-MSCs多向分化潜能比较
选择实施例2和对比例1开展实验，两个组的UC-MSCs分别常规培养传代至P5代，按1×105/mL密度接种于6孔板中，放入5％CO2培养箱37℃培养。
待各组UC-MSCs融合度达80％以上，分别设置对照孔和诱导孔，诱导UC-MSCs成骨和成脂分化。
14天后对成脂分化实验组细胞进行油红O染色，21天后对成骨分化实验组细胞进行茜素红染色。染色结果见图4和图5。
图4和图5所示实验结果表明：采用本发明实施例2提供的无血清培养基培养UC-MSCs不会影响其成脂成骨分化潜能，维持其干性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包含纤连蛋白、层黏蛋白和玻连蛋白；
优选地，所述纤连蛋白为重组人纤连蛋白，所述层黏蛋白为重组人层黏蛋白，所述玻连蛋白为重组人玻连蛋白。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(1-10)：(1-4)：(1-10)；
优选地，所述的重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白和重组人玻连蛋白的质量比为(4.5-6.5)：(1.5-3)：(4-7.5)。
3.一种干细胞无血清培养基，其特征在于，所述干细胞无血清培养基包含如下组分：权利要求1或者2所述的组合物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、重组人胰岛素、重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板源性生长因子、重组人转化生长因子β1、重组人激活素A、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、亚硒酸钠以及基础培养基；
优选地，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白1mg-10mg、重组人层黏蛋白1mg-4mg和重组人玻连蛋白1mg-10mg；
更优选地，每1L所述干细胞无血清培养基中含所述的重组人纤连蛋白4.5mg-6.5mg、重组人层黏蛋白1.5mg-3mg和重组人玻连蛋白4mg-7.5mg。
4.根据权利要求3所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A1μg-10μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10m-100mg，胆固醇1.1mg-4.4mg，亚油酸0.01mg-0.05mg，亚麻酸0.01mg-0.05mg，亚硒酸钠0.0001mg-0.001mg，以及基础培养基。
5.据权利要求4所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1mmol-4mmol，重组人胰岛素1mg-50mg，重组人血白蛋白1g-5g，重组人转铁蛋白1.1mg-11mg，重组人表皮生长因子10μg-100μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子10μg-100μg，重组人血小板源性生长因子10μg-100μg，重组人转化生长因子β1 1μg-10μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽1mg-8mg，L-抗坏血酸10mg-100mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
6.根据权利要求4所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，每1L所述干细胞无血清培养基中的所述组分的用量如下：非必需氨基酸8mL-12mL，谷氨酰胺1.5mmol-2.5mmol，重组人胰岛素5mg-20mg，重组人血白蛋白1.5g-3g，重组人转铁蛋白4mg-7mg，重组人表皮生长因子15μg-30μg，重组人碱性成纤维细胞生长因子15μg-35μg，重组人血小板源性生长因子15μg-25μg，重组人转化生长因子β1 3μg-7μg，重组人激活素A 3μg-7μg，L-谷胱甘肽2mg-6mg，L-抗坏血酸40mg-60mg，胆固醇1.8mg-3mg，亚油酸0.02mg-0.035mg，亚麻酸0.02mg-0.04mg，亚硒酸钠0.0005mg-0.00075mg，以及基础培养基。
7.根据权利要求3至6任一项所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基。
8.一种干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养干细胞的步骤；所述干细胞培养基添加有权利要求1或者2所述的组合物，或者所述干细胞培养基选用权利要求3至7任一项所述的干细胞无血清培养基。
9.根据权利要求8所述的干细胞的培养方法，其特征在于，培养的阶段为原代分离培养阶段；或/和，所述干细胞为间充质干细胞，优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
10.权利要求1或者2所述的组合物和权利要求3至7任一项所述的干细胞无血清培养基在干细胞原代分离培养中的应用。
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