CN107254443B

CN107254443B - 一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

Info

Publication number: CN107254443B
Application number: CN201710630213.6A
Authority: CN
Inventors: 王一飞; 陈海佳; 葛啸虎; 万丽; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107254443A

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。该诱导培养基由如下组分组成：1～10μg/mL人参皂苷Rb1，1～10ng/mL EGF，神经元培养上清液。本发明将人参皂苷Rb1、EGF与神经元培养上清液组成新型培养基，试验结果显示该培养基可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率，表明该培养基可促进骨髓间充质干细胞向神经元分化。

Description

一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。

背景技术

中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)主要有两大类细胞：神经元和神经胶质细胞，神经胶质细胞又分为大神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞)和小神经胶质细胞。神经元和大神经胶质细胞来源于外胚层，而大约占神经胶质细胞的5％～20％的小神经胶质细胞被认为来源于骨髓。人们一直以来都认为哺乳动物的CNS是属于不能再生类的组织，但是，这一神经学的经典法则正受到挑战，近年的研究已经显示神经祖细胞具有在CNS进行细胞分裂的能力。虽然这些细胞的功能和寿命还有待研究，但是已有明确的证据显示，在哺乳动物的齿状回和嗅球有成熟的神经形成。近来，随着神经细胞群的分化研究，在脊髓区也同样发现有成熟的神经形成。

中枢神经系统退行性疾病、遗传性疾病等是临床上治疗的难点。由于药物治疗仅仅是对症治疗，故神经组织移植替代治疗就成为最有发展前景的方法。神经元是神经系统的结构和功能单位。神经元有接受、整合和传递信息的功能。一般就长轴突神经元而言，树突和胞体接受从其他神经元传来的信息，并进行整合，然后通过轴突将信息传递给另一些神经元或效应器。神经干细胞(neural stemcells,NSCs)定向分化为的神经元在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。因此，寻求一种可以使NSCs定向分化为神经元的方法是国内外学者的研究热点。但是NSCs的来源和数量有限是目前存在的主要问题。

相关研究已经证实骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是最具有多向分化潜能和高度自我复制能力的细胞。BMSCs不仅能分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和造血支持细胞。无论是在体外研究，还是在体内实验，BMSCs都可以分化为CNS细胞，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。BMSCs是一群存在于骨髓中的非造血干细胞。自体骨髓间充质干细胞，因具有没有免疫排斥反应，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养及体外增殖能力强，为中枢系统疾病临床治疗提供了丰富的细胞资源。

目前使用的诱导骨髓MSCs分化成神经元的方法为加入预诱导液(即DMEM培养基+20％胎牛血清+1mmol/Lβ-巯基乙醇)置于37℃、5％CO₂条件下培养24h，预诱导后将细胞转移至含10mmol/Lβ-巯基乙醇的无胎牛血清培养基中并置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。但该培养方法分化成神经元的比例少，大部分分化成胶质细胞。因此，需要提供一种能够提高BMSCs分化成神经元比例的诱导方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。该培养基可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，由如下组分组成：

人参皂苷Rb1：1～10μg/mL；

EGF：1～10ng/mL；

神经元培养上清液：补足。

本发明将人参皂苷Rb1、EGF与神经元培养上清液组成新型培养基，试验结果显示该培养基可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率，表明该培养基可促进骨髓间充质干细胞向神经元分化。

作为优选，该诱导培养基由如下组分组成：

人参皂苷Rb1：1μg/mL；

EGF：10ng/mL；

神经元培养上清液：补足。

在本发明提供的一具体实施例中，该诱导培养基由如下组分组成：

人参皂苷Rb1：5μg/mL；

EGF：5ng/mL；

神经元培养上清液：补足。

在本发明提供的另一具体实施例中，该诱导培养基由如下组分组成：

人参皂苷Rb1：10μg/mL；

EGF：1ng/mL；

神经元培养上清液：补足。

作为优选，神经元培养上清液的制备方法为：神经元细胞在神经元培养基中培养3～5h，换液，继续培养3～5天，得到神经元培养上清液。

在本发明提供的实施例中，神经元培养上清液的制备方法为：神经元细胞在神经元培养基中培养4h，换液，继续培养3天，得到神经元培养上清液。

作为优选，神经元培养基为含有1％～2％B27、1％～2％双抗、0.1～0.5mMGLUTAMAX的神经元基础培养基。

优选地，神经元培养基为含有2％B27、1％双抗、0.5mM GLUTAMAX的神经元基础培养基。

作为优选，神经元细胞的接种密度为(1～10)×10⁵个/mL。

在本发明提供的实施例中，神经元细胞的接种密度为3×10⁵个/mL。

作为优选，神经元细胞的培养条件为37℃、5％CO₂。

本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，将骨髓间充质干细胞与本发明诱导培养基混合，培养。

作为优选，骨髓间充质干细胞为第三代骨髓间充质干细胞。

作为优选，培养的条件为37℃、5％CO₂，培养的时间为5～10天。

优选地，培养的条件为37℃、5％CO₂，培养的时间为5天。

作为优选，骨髓间充质干细胞的接种密度为(1～10)×10⁴个/mL。

在本发明提供的实施例中，骨髓间充质干细胞的接种密度为1×10⁵个/mL。

本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法。该诱导培养基由如下组分组成：1～10μg/mL人参皂苷Rb1，1～10ng/mL EGF，神经元培养上清液。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明将人参皂苷Rb1、EGF与神经元培养上清液组成新型培养基，试验结果显示该培养基可显著提高骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导率，表明该培养基可促进骨髓间充质干细胞向神经元分化。

2、本发明培养基组成简单，容易制备，成本低。

附图说明

图1示光镜下的BMSCs(100X)。

具体实施方式

本发明公开了一种促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)：间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。

人参皂苷Rb1：五加科植物人参的干燥根提取得到的一种活性物质，属于四环三萜皂苷，具有中枢神经抑制和安定作用。

GLUTAMAX：GlutaMAX^TM-I是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。GlutaMAX^TM-I是一种二肽——L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在水溶液中更稳定，不会自发降解。GlutaMAX^TM培养基及添加GlutaMAX^TM-I添加剂的培养基适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，几乎无需适应。

双抗：为青霉素-链霉素混合溶液。

B27：是在神经元细胞培养中所用的添加物，能够维持神经元细胞长期体外培养，因为神经元培养过程中不能使用血清所以用其代替，是专用于培养神经细胞的血清替代物。

本发明提供的促进骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基和诱导方法中所用试剂均可由市场购得。B27购自GIBCO，双抗购自BI，GLUTAMAX购自GIBCO，神经元基础培养基购自GIBCO。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1骨髓间充质干细胞的制备

(1)骨髓间充质干细胞分离培养

按标准骨髓穿刺程序，从自愿捐献者髂后上棘处抽取骨髓5～10mL，肝素抗凝，用等量的PBS稀释，按2∶1比例加在Ficoll淋巴细胞分离液上，400g离心30min，取中间白膜层，用PBS洗涤2遍，计数，以1×10⁶个细胞接种于含基础培养基的培养皿中培养。基础培养基配方：含体积分数10％FBS低糖DMEM，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素。培养条件：37℃、体积分数5％CO₂95％的湿度，培养72h后首次换液，以后每3d换液1次。

传代培养时，PBS洗2遍，加入0.25％胰蛋白酶消化2min，等量含体积分数10％FBS的低糖DMEM培养基终止消化，150g离心5min，弃上清，按1×10⁶/皿接种于培养皿中。

由图1可见，BMSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。

(2)细胞表面抗原检测

取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD 105、CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。结果见表1：

表1 BMSCs表面标志物表达阳性率

细胞表型	CD29	CD31	CD34	CD40
					BMSCs	94.94±1.06	3.27±0.39	2.13±0.35	1.24±0.06
细胞表型	CD44	CD45	CD105	HLA-DR
					BMSCs	91.8±1.27	1.22±0.05	99.84±0.17	2.93±0.21

经流式细胞术检测，如表1所示，第3代BMSCs高表达CD105、CD44和CD29，低表达或不表达HLA-DR、CD31、CD45、CD40和CD34等标记物。结果表明BMSCs与其他来源的MSCs基本相同。

实施例2神经元细胞培养上清的收集

神经元细胞从新生1d以内的SD大鼠皮质取得。将此大鼠放置在冰上2min左右，用75％的乙醇消毒1min，放于预冷过的PBS中断头，再用冷的PBS洗涤鼠脑。洗净后，于冰PBS中解剖，取出整个完整鼠脑组织。再将脑组织放在预冷的种植液中，借用体式镜解剖脑组织，小心剔除脑膜和血管。将所得的大脑组织放在装有种植液的离心管中，小心吹打。离心弃掉上清液，加入0.25％的胰蛋白酶，吹打均匀，37℃消化15min。以与胰蛋白酶体积比为2：1的比例加入种植液终止消化，再次吹打，将成团的组织打散，100目的筛子过滤，离心弃掉上清，加入神经元培养基(神经元培养基：向神经元基础培养基中加入2％的B27，1％双抗，0.5mM GLUTAMAX，0.22μm滤器过滤。4℃保存。)。接种密度为3×10⁵个/mL，细胞培养箱中培养4h后，换液，细胞培养箱中继续培养。培养至第3d，收集神经元培养上清。

实施例3骨髓MSCs向神经元的诱导培养基的制备

该实施例诱导培养基的配方如下：

神经元培养上清+1μg/mL人参皂苷Rb1+10ng/mL EGF。

神经元培养上清取自实施例2。

实施例4骨髓MSCs向神经元的诱导培养基的制备

该实施例诱导培养基的配方如下：

神经元培养上清+5μg/mL人参皂苷Rb1+5ng/mL EGF。

神经元培养上清取自实施例2。

实施例5骨髓MSCs向神经元的诱导培养基的制备

该实施例诱导培养基的配方如下：

神经元培养上清+10μg/mL人参皂苷Rb1+1ng/mL EGF。

神经元培养上清取自实施例2。

试验例1骨髓MSCs向神经元的诱导分化

培养皿的处理：向100mm和35mm细胞培养皿中加入100μg/ml的L-多聚赖氨酸工作液，37℃包被过夜，使用时，弃掉皿中多聚赖氨酸，用PBS洗涤两遍，置于超净台中备用。另外，用于皮质神经元免疫荧光实验的培养皿，在加入L-多聚赖氨酸之前，放入与35mm培养皿或者6孔板匹配的盖玻片。试验分组如下：

实验组1：P3代骨髓MSCs加入诱导液(实施例3培养基)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

实验组2：P3代骨髓MSCs加入诱导液(实施例4培养基)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

实验组3：P3代骨髓MSCs加入诱导液(实施例5培养基)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

对照组1：实施例1获得的P3代骨髓MSCs加入预诱导液(即DMEM培养基+20％胎牛血清+1mmol/Lβ-巯基乙醇)置于37℃、5％CO₂条件下培养24h，预诱导后将细胞转移至含10mmol/Lβ-巯基乙醇的无胎牛血清培养基中并置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

对照组2：P3代骨髓MSCs加入诱导液(神经元培养上清)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

对照组3：P3代骨髓MSCs加入诱导液(神经元培养上清+1μg/mL人参皂苷Rb1)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

对照组4：P3代骨髓MSCs加入诱导液(神经元培养上清+10ng/mL EGF)置于37℃、5％CO₂，条件下培养5d。

将上述各组培养的神经元进行免疫荧光细胞化学鉴定，试验方法如下：

当骨髓MSCs加诱导液诱导至第5天时，弃去细胞培养液，用PBS洗3遍。加4％多聚甲醛固定30min，加PBS冲洗5min×3；0.2％Tritox-100室温破膜10min，PBS洗涤5min×3；5％的山羊血清室温封闭30min，PBS洗涤5min×3；一抗Map-2(1：100),40C孵育过夜、二抗DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1:100)室温避光孵育lh，PBS冲洗2遍，封片，荧光倒置显微镜下观察，鉴定骨髓间充质干细胞分化成神经元的量。试验结果见表2：

表2骨髓间充质干细胞分化成神经元的量

分组	骨髓MSCs接种量	神经元细胞数量	诱导率
				实验组1	1×10<sup>5</sup>个	5×10<sup>4</sup>个	50％
实验组2	1×10<sup>5</sup>个	4×10<sup>4</sup>个	40％
				实验组3	1×10<sup>5</sup>个	4.4×10<sup>4</sup>个	44％
对照组1	1×10<sup>5</sup>个	0.18×10<sup>4</sup>个	18％
				对照组2	1×10<sup>5</sup>个	0.2×10<sup>4</sup>个	20％
对照组3	1×10<sup>5</sup>个	0.12×10<sub>4</sub>个	12％
				对照组4	1×10<sup>5</sup>个	0.25×10<sub>4</sub>个	25％

由表2的试验结果可知，本发明诱导培养基(神经元培养上清+1～10μg/mL人参皂苷Rb1+1～10ng/mL EGF)可显著提高骨髓间充质干细胞分化成神经元的诱导率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种促进人骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导培养基，其特征在于，由如下组分组成：

人参皂苷Rb1： 1μg/mL；

EGF： 10ng/mL；

神经元培养上清液：补足。

2.根据权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述神经元培养上清液的制备方法为：神经元细胞在神经元培养基中培养3～5h，换液，继续培养3～5天，得到神经元培养上清液。

3.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于，所述神经元培养基为含有1％～2％B27、1％～2％双抗、0.1～0.5mM GLUTAMAX的神经元基础培养基。

4.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于，所述神经元细胞的接种密度为(1～10)×10⁵个/mL。

5.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于，所述神经元细胞的培养条件为37℃、5％CO₂。

6.一种人骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导方法，其特征在于，将人骨髓间充质干细胞与权利要求1至5中任一项所述诱导培养基混合，培养。

7.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，所述人骨髓间充质干细胞为第三代人骨髓间充质干细胞。

8.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃、5％CO₂，培养的时间为5～10天。

9.根据权利要求6所述的诱导方法，其特征在于，所述人骨髓间充质干细胞的接种密度为(1～10)×10⁴个/mL。