KR20120003470A

KR20120003470A - 사람 제대혈 유래의 중간엽 줄기 세포의 분리

Info

Publication number: KR20120003470A
Application number: KR1020117025478A
Authority: KR
Inventors: 샤오-둥 천; 중딩 루
Original assignee: 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2012-01-10
Also published as: SG174991A1; CN102449141B; WO2010114572A1; AU2009343787B2; EP2414511B1; IL215448A0; CA2756938C; AU2009343787A1; CA2756938A1; EP2414511A4; JP2012521780A; MX2011010367A; CN102449141A; US20120142102A1; EP2414511A1; JP2015164430A; HK1169446A1; BRPI0924921A2

Abstract

사람 제대혈(UCB)은 성인 골수 유래의 중간엽 줄기 세포(MSC)보다 높은 다능성을 갖는 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함한다. 그러나, UCB에서 MSC의 빈도가 매우 드물기(1 X 10⁸개의 단핵 세포에서 0.4 내지 30개) 때문에 MSC를 수득하는 것은 어려웠다. 현재까지, MSC의 분리는 플라스틱 부착 능력에 좌우되었다. 일부 "진성" MSC는 플라스틱에 대한 부착 능력이 불량할 수 있기 때문에 소실될 수 있다. 이전 연구에 의해, 골수 세포에 의해 생성된 세포외기질(ECM)은 MSC의 부착과 증식을 증가시키고 줄기 세포 특성을 유지하는 것으로 나타났다. 본 발명은 ECM에 대한 부착에 의해 제대혈로부터 MSC를 분리하는 방법 및 이러한 분리된 줄기 세포를 위한 용도를 제공한다.

Description

사람 제대혈 유래의 중간엽 줄기 세포의 분리{Isolation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells}

본원은 2009년 3월 31일자로 출원된 미국 임시출원 제61/165,193호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.

본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 5R21AG25466-2 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 당해 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.

1. 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 제대혈(UCB)로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하고 증식시키기 위한 방법에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

줄기 세포는 오늘날 생체의학에서 가장 흥미로운 분야 중의 하나이다. 중간엽 줄기 세포(MSC)는 자가재생성 및 다계통 분화의 능력으로 인해 치료제로서의 가능성이 크다.

최근, 제대혈(UCB)은 관절염, 심장 질환, 신경 및 조직 재생성의 영역에서 줄기 세포 요법에 대한 중간엽 줄기 세포(MSC)의 대체원으로서 제안되었다. 골수 유래의 MSC(BM-MSC)에 비해 UCB-MSC를 사용하는 이점은 다음과 같다: 1) UCB는 풍부하게 이용가능하고, 제공자에게 아무런 피해 없이 수거될 수 있으며; 2) UCB-MSC는 보다 높은 확장 잠재성 및 보다 큰 분화 능력을 갖는다. 그러나, 연구와 임상 분야 모두에 대한 UCB-MSC의 사용에서 주요 한계는 UCB에서 MSC의 빈도가 매우 낮으며(1 X 10⁸개의 단핵 세포(MNC)에서 약 0.4 내지 30개), UCB-MSC 분리의 성공률도 또한 낮다(약 30%)는 것이다. 줄기 세포로서, 줄기 세포 특성의 손실 없이 장기간 배양으로 이들을 확장시키는 것은 곤란하다. 현재까지, MSC는 이러한 세포를 규정할 수 있는 특정 마커의 부족으로 인해 통상적인 플라스틱 부착 방법에 의해 골수 또는 임의의 다른 조직으로부터 분리된다[참조: Wolfe et al., 2008; Soleimani and Nadri, 2009; Kern et al., 2006; Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 24:1294-1301].

동일한 방법을 사용하면, UCB에서 초미숙 MSC의 대부분은 플라스틱에 대한 부착 능력이 불량하기 때문에 소실될 것으로 예상된다. 최근, 골수 세포에 의해 생성된 세포외기질(ECM)은 MSC의 부착과 증식을 증가시키고 줄기 세포 특성을 유지하는 것으로 보고되었다[참조: Chen et al ., 2007, JBMR, 22:1943].

본원에서, 본 발명은 ECM에 대한 부착에 의해 MSC를 분리하고 이의 증식을 촉진시키기 위한 방법을 제공한다. 이러한 시스템을 사용하면, 통상적인 피브로넥틴 또는 FBS로 사전코팅된(pre-coated) 플라스틱 부착 방법으로 UCB-MSC를 분리하여 이미 보고된 것보다 빈도가 1000배 이상인 다수의 hUCB-MSC를 분리할 수 있다. 보다 중요하게, ECM으로 수득된 MSC는 독특한 특징의 배아 줄기 세포인 시험관내 배양체를 형성하고, 생체내에서 3개의 배아 배엽층 기원의 조직을 생성하였다.

본 발명은 세포외기질(ECM)에 대한 부착에 의해 제대혈로부터 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하기 위한 방법 및 분리된 MSC를 위한 용도를 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은 (a) 샘플을 수집하는 단계; (b) 상기 샘플을 세포외기질(ECM)로 사전코팅된 배양 접시 상에 씨딩(seeding)하는 단계; 및 (c) 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하는 단계를 포함하는, MSC의 분리 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 씨딩 전에 단핵 세포를 수집하기 위해 상기 샘플을 원심분리함을 추가로 포함한다.

추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 분리된 MSC를 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 상기 방법은 상기 분리된 MSC를 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 MSC를 ECM에 씨딩하여 상기 분리된 MSC 샘플의 증식을 촉진하는 단계를 포함하는, MSC 증식의 촉진 방법을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 MSC를 면역기능저하 마우스에 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계를 포함하는, 분화 조직의 생성 방법을 제공한다.

상기 샘플은 MSC를 포함하는 임의의 조직 또는 샘플로부터 유래할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 샘플은 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직으로부터 유래한다. 특정 양태에서, 상기 샘플은 제대혈(UCB)이다. 상기 샘플은 임의의 포유동물로부터 유래할 수 있으며, 특정 양태에서는 사람으로부터 유래한다. 상기 샘플은 언제라도 수집될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 샘플은 출생 후에 수집된다. 기타 양태에서, 상기 샘플은 출생 전에 수집될 수 있다.

세포외기질은 적절한 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 양태에서, 세포외기질은 사람 골수 세포로부터 유래한다. 특정 양태에서, ECM은 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및/또는 라미닌을 포함할 수 있다.

분화 조직은 다수의 층을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 분화 조직은 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 포함한다. 일부 양태에서, 분화 조직은 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함한다.

실시예 단락에서의 양태는 본 발명의 모든 양태에 적용가능한 본 발명의 양태인 것으로 이해된다.

특허청구범위에서의 용어 "또는"이란, 비록 개시내용이 대안 및 "및/또는"만을 의미하는 정의를 지지하더라도, 대안적인 것만을 의미하거나 대안이 상호 배타적인 것을 의미하는 것으로 명백하게 나타내지 않는다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.

본원 전체에 걸쳐, 용어 "약"이란, 수치가 이를 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준편차를 포함하는 것을 나타내는데 사용된다.

다년간에 걸친 특허법에 따르면, "하나"란 단어는, 특허청구범위 또는 명세서에서 "포함하는"이란 단어와 함께 사용되는 경우, 명백하게 나타내지 않는다면, 하나 이상을 의미한다.

본원에 사용되는 용어 "치료학적으로 유효한"이란, 치료되는 질환에서 하나 이상의 증상이 적어도 개선되는 효과와 같은 치료 효과를 달성하기 위해 본 발명의 방법에 사용되는 세포 및/또는 치료 조성물(예를 들면, 치료적 폴리뉴클레오타이드 및/또는 치료적 폴리펩타이드)의 양을 의미한다.

본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 특정 양태를 나타내지만, 설명을 위해서만 제공되는 것으로 이해되어야 하는데, 이는 본 발명의 취지 및 범위 내의 각종 변화 및 변형이 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하기 때문이다.

다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 다음 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1d. 사람 간질 세포 배양물과 이의 ECM의 주사 현미경사진을 도시한 도면이다. 배양된 간질 세포의 SEM 현미경사진은 세포 제거 전(도 1a 및 1b)과 세포 제거 후(도 1c 및 1d)를 도시한다. 패널 B에서의 화살표는 세포를 나타낸다. 본 발명자들의 이전 연구에 기초한 표준 절차를 사용하였다. 계대 1회 또는 2회로부터의 간질 세포를 조직 배양 플라스틱 상에 1 X 10⁴ 세포/cm²로 씨딩하고 15일 동안 배양하였다. 배지(15% FBS를 함유하는 α-MEM)를 3 내지 4일 마다 교체하고, 아스코르브산(50μM)을 배양 최종 8일 동안 첨가하였다. PBS로 광범위하게 세척한 후, 실온에서 5분 동안 PBS 중의 20mM NH₄OH를 함유하는 0.5% 트리톤(Triton) X-100으로 항온처리함으로써 세포를 제거하였다. PBS로 4회 세척한 후, 50μg/ml 겐타마이신 및 0.25μg/ml 펀지존을 함유하는 PBS를 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 4개월까지 저장하였다.
도 2. 사람 골수 간질 세포로 생성된 ECM에서 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및 라미닌의 편재화를 나타내는 공초점 이미지를 도시한 도면이다. 지정된 성분에 대한 항체 및 녹색 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 단백질을 검출하였다. 비특이적 이소형 IgG를 음성 대조군으로 사용하였다. DAPI에 의한 핵 염색은 청색으로 나타낸다.
도 3a 내지 3d. 1차 씨딩한지 4시간 및 72시간 후, 2D 및 ECM 플레이트로부터 제거된 비부착 세포를 ECM 플레이트 상에 재씨딩하였다. 재씨딩한지 24시간 후, 1차 2D 플레이트로부터의 비부착 세포는 1차 ECM 플레이트로부터의 비부착 세포(도 3b 및 3d)보다 5배 더 많은 부착된 세포를 나타낸다(도 3a 및 3c, 크리스탈 바이올렛 염색).
도 4. ECM은 UCB 유래의 MSC 부착 및 확장을 촉진한다. 사람 UCB를 텍사스 코드 블러드 뱅크(Texas Cord Blood Bank; 미국 텍사스주 샌 안토니오 소재)로부터 구입하였다. UCB로부터 분리된 단핵 세포(MNC)를 ECM 또는 비코팅된 플라스틱 상에 1 X 10⁶ MNC/cm²로 씨딩하고 37℃에서 지정된 여러 시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 비부착 세포를 PBS 세척에 의해 제거하였다. 최초 배율, X 100.
도 5. 콜로니 형성을 도시한 도면이다. ECM 부착으로 분리된 UCB-MSC는 많은 콜로니를 형성하였고(좌측 패널, 최초 배율, X 50, 및 중간 패널, 최초 배율, X 200), 이들의 일부는 배아체를 생성하였다(우측 패널, 최초 배율, X 200).
도 6a 내지 6c. 콜로니 형성을 도시한 도면이다. UCB-MSC를 ECM(도 6a) 또는 비코팅된 플라스틱(도 6b) 상에 1 X 10⁶ MNC/cm²로 씨딩하고, 37℃에서 72시간 동안 항온처리하였다(최초 배율, X 100). ECM 피복된 플레이트 상에 형성된 배아 유사체(도 6c)(최초 배율, X 200).
도 7a 내지 7c. 세포 분화를 도시한 도면이다. 미분화된 UCB-MSC(도 7a). UCB-MSC 지방형성(도 7b), 오일 적색 염색은 지질 소적을 나타낸다. UCB-MSC 근육형성(도 7c), 헤마톡실린 염색은 복수의 핵을 갖는 근관을 나타낸다(화살표).
도 8. ECM 부착으로 분리된 세포(ECM)와 전형적인 플라스틱 부착 방법으로 분리된 세포(플라스틱)의 유동 세포계수 분석을 도시한 도면이다. 도 4에서 이미 기재된 동일 실험에서, 트립신으로 처리한 후 72시간 동안 ECM 또는 플라스틱 상에서 세포를 항온처리하여 단세포 현탁액을 수득하고, 각종 1차 항체 및 FITC 접합 2차 항체로 염색하였다. 1차 비특이적 항체(이소형, IgG)로 염색된 세포는 음성 대조군(회색 피크)으로서 제공된다. 각각의 샘플에 대해 수집된, 10,000개의 이벤트를 갖는 Becton Dickinson FACStarplus 유동 계수기를 사용하여 염색된 세포를 분석하였다.
도 9a 및 9b. 생체내에서 3개의 배아 배엽층으로부터 유래한 ECM 생성 조직으로 분리된 UCB-MSC를 도시한 도면이다. ECM으로 분리되어 ECM 상에서 계속 확장되는 UCB-MSC 또는 플라스틱으로 분리되어 플라스틱 상에서 계속 확장되는 UCB-MSC를, 골격 형성을 유리하게 유도하는 젤폼(Gelfoam) 또는 하이드록시아파타이트/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP)에 주입하고, 10주령의 면역결핍 베이지 마우스의 등면에 피하 이식하였다. 각각의 비히클에 0.5 X 10⁶개의 세포를 주입하였다. 3개의 이식을 각각의 조건에 대해 수행하였다. 이식 8주 후에 이식물을 수거하고, 조직 분석을 위해 처리하였다. 절편을 H&E로 염색하였다. 추가로, 비엘쇼브스키(Bielschowsky) 은 염색을 사용하여 신경을 특정하게 확인하였다(신경 섬유의 중간 패널 참조). 생성된 조직의 기원을 측정하기 위해, H&E 염색 단편에 인접한 단편을 밀리포어(Millipore; 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)로부터 구입한 사람 핵의 리보핵산단백질에 특이적으로 대항하는 항체로 염색하였다. 마우스 및 사람 조직은 음성 대조군 및 양성 대조군으로 각각 제공되었다. 소골에서 생성된 골격 조직은 제공자 기원(30)으로부터 유래하는 것으로 규명되었다. A: 동맥; B: 골; C: 모세혈관; E: 내피 세포; F: 지방; G: 샘; M: 근육; 및 N: 신경.
도 10. ECM 부착 방법으로 분리된 UCB 세포의 유전자 발현 프로파일을 도시한 도면이다. 미리 분리하여 4개의 각각의 제공자로부터 별도로 ECM(UMSC/E) 또는 플라스틱(UMSC/P) 상에서 유지시킨 UCB 세포(계대 1회)로부터 RNA를 제조하였다. TaqMan PCR Master Mix and Assay Demand[어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)]를 사용하여 목적하는 전사체를 실시간 PCR로 측정하였다. 사람 ES 세포[(hES) 세포주 H7]로부터 분리된 RNA는 UTSA의 크리스토퍼 나바라(Christopher Navara) 박사에 의해 친절하게 제공되었다. ALLCELLS(미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)로부터 구입한 사람 골수 세포로부터 사람 MSC(BMSC)를 위한 RNA를 방법에서 기재된 바와 같이 제조하였다. *P < 0.01 (n = 4), hES 대 UMSC/E 또는 UMSC/P 또는 BMSC. ^†P < 0.01 (n = 4) UMSC/E 대 UMSC/P 또는 BMSC.

본 발명은 ECM에 대한 부착에 의해 MSC를 분리하기 위한 방법 및 분리된 MSC에 대한 용도를 제공한다.

I. 중간엽 줄기 세포(MSC)

MSC는 자가재생성 및 다계통 분화의 능력으로 인해 치료제로서의 가능성이 크다. MSC는 각종 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포이다. MSC가 시험관내에서 또는 생체내에서 분화하는 것으로 입증된 세포 유형에는 골모세포, 연골세포, 근육세포 및 지방세포가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "줄기 세포"란 1개 이상의 계통의 세포를 야기하는 세포를 의미한다.

MSC는 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직을 포함한 각종 세포로부터 분리될 수 있는 것으로 보고되었다. 그 중에서도, 제대혈은 접근성, 제공자에 대한 무통 시술, 자가 세포 요법을 위한 유망한 공급원 및 바이러스 감염의 위험 감소로 인해 이상적인 공급원일 수 있다. 제대혈 줄기 세포는 출생 직후에 탯줄로부터 수득할 수 있다. 이러한 줄기 세포는 성인 또는 아동의 골수에서 발견되는 줄기 세포보다 덜 성숙하다. 더구나, 사람 제대혈(hUCB)은 성인의 골수 유래의 MSC(BM-MSC)보다 확장 가능성이 높고 분화 능력이 큰 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함한다. 그러나, 이러한 세포는 전통적인 방법으로 수득하는 것이 곤란한데, 이는 UCB-MSC 분리의 성공률이 낮기 때문이다. 전통적인 방법의 경우, 임의의 소정의 10개의 UCB 샘플 중에서, UCB-MSC를 단지 3개의 샘플(30% 성공률)만으로부터 분리할 수 있으며, UCB-MSC를 발견할 수 있는 이러한 샘플에서, UCB에서 MSC의 절대 수치는 극히 낮다[1 X 10⁸개의 단핵 세포(MNC)에서 약 5 내지 30개].

II. 세포외기질(ECM)에 의한 중간엽 줄기 세포(MSC)의 분리

현재까지, MSC의 분리는 플라스틱 부착 능력에 좌우되었다. 따라서, UCB에서 일부 진정 MSC는 플라스틱에 대한 부착 능력이 불량할 수 있기 때문에 소실될 수 있다. 더구나, 줄기 세포는 기능을 유지하기 위해 특별한 미세환경을 필요로 한다. 현재의 조직 배양 기술은 MSC 줄기 세포 특성의 손실로 증명된 바와 같이 이러한 환경을 제공하지 못하고 있다. 대신에, 이들은 노화를 겪거나, "자발적으로" 특정 세포 계통으로 되거나, 형질전환 세포로 된다.

일부 양태에서, 본 발명은 ECM에 대한 부착에 의한 MSC의 분리를 제공한다. 놀랍게도, ECM 부착 방법을 사용하여, 사람 제대혈로부터 다수의 배아 유사 줄기 세포를 분리하였다. 현재 기재된 방법에 의해, 사람 골수(hBM) 세포로 생성된 세포 무함유의 고유한 ECM을 재구성할 수 있다. ECM은 적어도 부분적으로 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 소형 류신 풍부 프로테오글리칸, 예를 들면, 비글리칸 및 데코린, 및 기저막의 주요 성분, 예를 들면, 퍼레칸 및 라미닌을 포함한다. 이러한 모든 기질 단백질은 세포 부착, 이동, 증식, 분화 및 생존을 조절하는데 매우 중요하다. hBM-ECM의 성분 및 독특한 구조는 MSC를 지지하는 생체내 미세환경의 주요 특징을 모방하며, hUCB-MSC 부착 및 증식을 현저하게 증가시키고, 줄기 세포 특성을 유지한다.

골수 세포에 의해 생성된 ECM은 UCB-MSC 부착 및 증식과 줄기 세포 특성 유지를 향상시켰다. 이러한 시스템을 사용하여, 사람 UCB는 ECM에 부착하지만 플라스틱에 부착하지 않은 다수의 MSC를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 더구나, 낮은 씨딩 밀도(3 X 10⁴ 내지 1 X 10⁵ MNC/cm²)의 1차 세포를 ECM 상에서 배양하는 경우, 다수의 콜로니를 형성하였다. 이러한 데이터는 EMC 상에서 배양된 UCB-MSC가 플라스틱 상에서보다 콜로니 형성 능력이 훨씬 높음을 나타낸다. 콜로니 형성 단위(CFU)의 측정에 따르면, UCB-MSC의 빈도는 이전에 보고된 것(1 X 10⁸개의 MNC에서 0.4 내지 30개)보다 1,000배 이상(760 내지 92,500배) 높은 1 X 10⁸개의 MNC에서 22,800 내지 37,000개이다.

보다 중요하게는, 이러한 연구에 의해, ECM으로 수득된 hUCB 유래의 MSC(hUCB-MSC)를 어떠한 특이적 분화 유도 없이 면역기능저하 마우스에 이식하면, 골, 근육, 지방, 혈관, 샘 및 신경 섬유를 포함한 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 생성하는 것으로 나타났다. ECM으로 분리된 후 ECM 상에서 배양된 hUCB-MSC가 hES 세포 특성을 발휘하는 고유한 다능성 세포이기 때문에, 이러한 세포는 "사람 제대혈 유래의 배아 유사 줄기 세포(hUCB-ELSC)"라고 불리운다.

놀랍게도, 이러한 신규한 기술을 사용하여, 단지 1개의 제대혈 단위만으로부터 다수의 UCB-ELSC를 수득할 수 있다. 어떠한 특이적인 분화 유도 없이도, ECM 상에서 배양된 hUCB-MSC(심지어 계대 6회 내지 8회)는 hES와 같은 생체내에서 3개의 배아 배엽층으로부터 기원하는 각종 조직으로 매우 효과적으로 분화할 수 있다. 이러한 독특한 특징을 기초로 하여, 현재 개시된 방법은 다음에 매우 유용하다.

1. 조직 공학 기초 연구

ECM 부착으로 수득된 다수의 고도 정제된 hUCB-MSC는 거동을 조절하는 분자 기전의 연구를 촉진시킬 것이다.

2. 약물 발견

ECM 상에서 유지된 고도 정제된 hUCB-MSC는 시험관 내에서 약물 스크리닝에 사용할 수 있다.

3. 조직 공학 임상 용도

다수의 고유한 다능성 UCB-ELSC는 예측가능한 미래에 세포 기반 임상 분야를 위한 ES 세포의 대체물일 수 있다.

III. 실시예

다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위해 포함된다. 다음 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술을 나타내고, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 본 발명의 견지에서, 개시되어 있는 특정 양태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 동일한 결과를 여전히 수득할 수 있음은 당업자에게 명백하다.

실시예 1 - 배양된 골수 세포 유래의 세포 무함유 ECM 의 제조

(1) ALLCELLS(미국 캘리포니아주 에머리빌 소재)로부터 새로이 분리된 사람 골수 단핵 세포(20 내지 30세의 제공자로부터 수득된 MSC를 함유함)를 구입한다.

(2) 세포를 T175 플라스크 상에 8.5 내지 17 X 10⁴/cm²의 밀도로 플레이팅하고, 글루타민(4mM), 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml) 및 15 % 예비선택된 우태아 혈청을 함유하는 α-MEM에서 배양한다. 24시간 후, 비부착 세포를 제거하고, 새로운 배지를 첨가하고, 70% 컨플루언스(confluence)까지 성장시킨다(2 내지 3주).

(3) 배양물을 PBS로 세척한다. 0.05% 트립신을 사용하여 부착 세포를 분리시킨다. 세포를 수거하고, 재현탁시키고, 조직 배양 플라스틱 상에 6 X 10³ 세포/cm²로 재씨딩하고, 15일 동안 배양시킨다. 3 내지 4일 마다 배지의 반을 교환하고, 아스코르브산(50μM)을 배양 최종 8일 동안 첨가한다. PBS로 광범위하게 세척한 후, PBS 중의 20mM NH₄OH, pH 7.4를 함유하는 0.5% 트리톤 X-100으로 37℃에서 5분 동안 항온처리하여 세포를 제거한다. 이어서, 플레이트를 PBS로 4회 세척하고, 50㎍/ml 겐타마이신 및 0.25㎍/ml 펀지존을 함유하는 PBS를 첨가하고, 4℃에서 4개월까지 저장한다.

실시예 2 - hUCB 로부터 MSC 의 분리 및 배양

(1) 피콜 밀도 구배(Ficoll density Gradient)를 사용하여 hUCB 단핵 세포(MNC)를 분리한다: 항응고 제대혈을 평형 염 용액(BSS)으로 희석한다(1:1). 희석된 제대혈을 50ml 튜브 중의 10ml의 Ficoll-Paque PREMIUM 용액(미국 뉴저지주 피스케이트어웨이 소재의 GE Healthcare BioSciences Corp.) 층에 서서히 넣는다(비율 4:1). 층을 형성한 혈액 샘플을 18 내지 20℃에서 480g로 30분 동안 원심분리한다. 단핵/백색 층을 새로운 50ml 튜브에 수거하고, BSS 3용적을 MNC에 첨가하고, 세포 현탁액을 18 내지 20℃에서 480g로 6분 동안 원심분리하고, 펠릿을 2% FBS를 함유하는 α-MEM에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고, 생존력을 검사한다.

(2) 1 X 10⁶MNC/cm²의 밀도로 사람 골수 세포 유래의 ECM로 사전코팅된 배양 플레이트 또는 접시에 씨딩한다. 최초 플레이팅 24시간 후 비부착 세포를 제거한다. 부착 세포를 PBS로 격렬하게 2회 세척하고, 진탕시켜 조혈 세포를 함유하는 모든 비부착 세포를 제거하고, 새로운 배지를 첨가한다. 37℃에서 5% CO₂ 함유 가습 대기 하에 MSC(hUCB-MSC)를 함유하는 생성된 섬유모세포성 부착 세포를 배양한다.

(3) 1주에 1회씩 배지를 교환한다. 확장 배지는 20% FBS로 구성된다. MSC가 70 내지 90%의 컨플루언스에 도달할 때까지 MSC를 배지에 유지한다. 0.05%의 트립신을 사용하여 서브컨플루언스(subconfluence)에서 세포를 수거할 수 있다. 제2 계대에서, 세포를 6 X 10³/cm²의 평균 밀도로 다시 플레이팅한다.

(4) 섬유모세포성 콜로니 형성 단위(CFU-F)로 불리는 단일 분리된 섬유모세포성 콜로니의 생성은 저밀도(1 X 10³ 내지 1 X 10⁵ 세포/cm²)에서 MNC를 초기에 씨딩하여 달성될 수 있다.

실시예 3 - ECM 과 플라스틱에 대한 MSC 부착의 비교

방법: 골수 유래의 ECM과 플라스틱에 대한 MSC의 부착 능력을 비교하기 위해, 세포를 플라스틱 상에 1x10⁶ 세포/cm²로 씨딩하여 4, 24 및 72시간 동안 항온처리하였다. 비부착 세포를 플라스틱으로부터 수거하고 ECM 상에 다시 씨딩하여 24시간 동안 추가로 항온처리하였다. 부착 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 정량화하였다(도 8 참조). 지방형성 및 근육형성 배지에 각각 유지시킨 세포로 지방형성 및 근육형성을 측정하였다.

결과: UCB에서 대부분의 비부착 세포는 4시간 항온처리하면 ECM에 부착할 수 있었다. 대조적으로, 더 적은 세포가 플라스틱에 부착하였다. 그러나, 플라스틱으로부터 수거한 비부착 세포는 ECM에 부착한 다수의 세포를 포함하고 있었다. ECM 상에 부착한 세포는 시험관 내에서 지방 세포 및 근육 세포로 분화할 수 있다.

실시예 4 - 이식 및 분화 평가

(1) 이식: 미리 배양된 0.5 X 10⁶개의 hUCB-MSC(계대 6회 내지 8회)를 이식 비히클 하이드록시아파타이트/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP) 세라믹 분말 또는 젤폼에 주입하고, 10주령의 면역결핍 베이지 마우스(NIH-bg-nu-xid)의 등면에 피하 이식하였다.

(2) 분화 평가: 이식한지 2 내지 4개월 후 실온에서 이식물을 수거하고 4% 포름알데하이드로 고정한다. H&E 및 면역염색으로 4㎛의 파라핀으로 연속 포매된 이식물을 검사한다. 항-사람 특이적인 RNP 항체[1:60; 밀리포어/케미콘(Chemicon)]로 면역염색하여 제공자의 hUCB-MSC로부터 분화된 조직을 검출할 수 있다.

실시예 5 - 결과

다수의 UCB - MSC 는 ECM 에 부착되지만 플라스틱에 부착되지 않았다. 골수 세포로 제조된 세포외기질(ECM, 도 1 및 2)은 hUCB-MSC 부착 및 증식을 향상시키고 줄기 세포 특성을 유지하였다. 이러한 시스템을 사용하여, 사람 UCB는 ECM에 부착하지만 플라스틱에 부착하지 않은 다수의 MSC를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 1차 세포를 3 X 10⁴ 내지 1 X 10⁵ MNC/cm²의 씨딩 밀도로 ECM 상에서 배양하는 경우, 다수의 콜로니를 형성하였다(도 3 및 4 참조). 이러한 데이터는 EMC 상에서 배양된 hUCB-MSC가 플라스틱 상에서보다 콜로니 형성 능력이 훨씬 높음을 나타낸다. 콜로니 형성 단위(CFU)의 측정에 따르면, hUCB-MSC의 빈도는 이전에 보고된 것(1 X 10⁸개의 MNC에서 0.4 내지 30개)보다 1,000배 이상(760 내지 92,500배) 높은 1 X 10⁸개의 MNC에서 22,800 내지 37,000개이다.

ECM 에 부착된 UCB 세포는 SSEA -4 및 다른 MSC 마커를 발현하지만 조혈 세포 마커를 발현하지 않았다. ECM에 부착된 세포의 표현형을 유동 세포계수 분석으로 측정하였는데, 이들 세포의 약 40%는 ES 세포 마커 SSEA-4(15)를 발현하고, 세포의 약 90%도 또한 CD29, CD105, CD166 및 CD146을 포함한 수개의 MSC 마커를 발현하지만, CD34 및 CD45 조혈 세포 마커를 발현하지 않는 것으로 나타났다(도 8 참조). 대조적으로, 플라스틱에 부착된 세포는 더 적은 SSEA-4⁺ 세포 및 MSC 마커를 발현하는 소수의 세포를 포함하였다. 이러한 결과는 ECM에 부착된 세포의 표현형이 플라스틱에 부착된 세포의 표현형과 매우 상이함을 나타냈다. ECM 부착으로 분리된 세포는 독특하며, 비교적 균일한 MSC 집단을 함유할 수 있다. 이러한 세포는 또한 ES 세포의 일부 특징을 가질 수 있다.

ECM 상에서 배양된 hUCB - MSC 는 생체내에서 3개의 배아 배엽층 기원의 조직을 생성하였다. ECM 시스템은 사람 제대혈 유래의 배아 유사 세포를 풍부하게 한다. ECM으로 수득된 후 ECM 상에서 배양된 hUCB-MSC는 시험관 내에서 배아체를 형성하였으며(도 5 및 6 참조), 이는 배아 줄기 세포의 독특한 특징이다. 어떠한 특이적인 분화 유도도 없이, hUCB-MSC를 면역기능저하 마우스에 이식한 결과, 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함한 3개의 배아 배엽층 유래의 조직이 생성되었다. 이러한 조직은 항-사람 특이적인 RNP 항체로 면역염색하여 검출된 제공자의 hUCB-MSC로부터 분화된다. 대부분의 이식물은 hES 세포와 같은 세포에 의해 생성된 비균일 조직을 포함하였으나, 기형종은 발생하지 않았다(도 9 참조).

부착된 후 ECM 상에서 배양된 hUCB 세포의 표현형은 hES 및 hBM - MSC 의 표현형과 상이하다. hUCB-MSC를 추가로 정의하고 특성화하기 위해, 본 발명자들은 ECM 부착으로 분리된 UCB-MSC가 NANOG, OCT4, TDGF1, DNMT3B, GABRB3 및 Sox2를 발현하는지 여부를 검사하였으며, 이들 모두는 hES 세포에 의해 강하게 발현된다[참조: Adewumi et al ., 2007]. ECM 부착으로 분리된 UCB-MSC에 의해 발현된 이들 유전자의 수준은 hES 세포에 의해 발현된 수준보다 훨씬 낮았지만, 플라스틱 부착으로 분리된 UCB-MSC와 사람 골수 유래의 중간엽 줄기 세포(hBM-MSC) 둘 다에 의해 발현된 수준보다 훨씬 높았다(도 10 참조). 이는 ECM 부착으로 분리된 UCB-MSC가 기형종을 형성하지 않은 이유를 설명할 수 있으며, 이는 이전의 연구 결과에 의해 이들 유전자의 일부로 혼입된 체세포가 기형종을 형성하는 것으로 명백히 나타난 바와 같다. UCB는 BM 유래의 ECM에 부착되어 있지만 플라스틱에 부착되어 있지 않은 다수의 배아 유사 줄기 세포를 포함할 수 있고, ECM 부착 방법으로 수득된 UCB-MSC는 고전적인 플라스틱 부착 방법으로 분리된 UCB-MSC와 구별되는 특성을 가질 수 있는 는 것으로 보인다. ECM 부착으로 수득된 UCB-MSC의 분화 단계는 ES 세포와 유사하고, 전통적인 플라스틱 부착 방법으로 분리된 UCB-MSC와 비교하여 분화가 일찍 일어날 수 있다. 이들 데이터를 종합해보면, ECM 부착으로 분리된 hUCB-MSC는 이전에 특성화된 유형의 줄기 세포(hESC, hBM-MSC, 지방 조직-MSC, 골막-MSC 등, 및 심지어 표준 플라스틱 부착 방법을 사용하여 분리된 hUCB-MSC)와 비교하여 상이한 부류의 줄기 세포에 이들 세포의 배치를 보장하기에 충분히 독특한 특성을 갖는 것으로 나타난다.

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본원에 개시되어 있고 청구되어 있는 모든 조성물 및/또는 방법은 본원의 견지에서 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 일부 양태의 관점에서 기재되어 있지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재되어 있는 조성물 및 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 가해질 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 보다 상세하게는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련되는 특정 제제가 본원에 기재되어 있는 제제 대신에 치환되면서 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 유사한 모든 치환물 및 변형물은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.

참고문헌

다음 문헌은, 이들이 본원에 설명된 것에 보충하여 예시적인 절차 또는 기타 세부사항을 제공할 정도로, 구체적으로 본원에 참조로 인용된다.

Adewumi,O et al . Nat . Biotechnol . 25:803-816, 2007

Chen et al., J. Bone Miner . Res ., 22:1943-1956, 2007

Kern et al., Stem Cells, 24:1294-1301, 2006

Soleimani and Nadri, Nat . Protoc . 4:102-106, 2009

Wolfe et al., Methods Mol . Biol ., 449:3-25, 2008

Claims

중간엽 줄기 세포(MSC)의 분리 방법으로서,
(a) 샘플을 수집하는 단계;
(b) 상기 샘플을 세포외기질(ECM)로 사전코팅된(precoated) 배양 접시 상에 씨딩(seeding)하는 단계; 및
(c) 상기 MSC를 분리하는 단계
를 포함하는, 중간엽 줄기 세포(MSC)의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직으로부터 유래하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 샘플이 제대혈(UCB)인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 제대혈이 사람 UCB(hUCB)인, 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 출생 후에 수집되는, 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 hUCB 샘플이 씨딩 전에 단핵 세포를 수집하기 위해 원심분리되는, 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM이 사람 골수 세포로부터 유래되는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 ECM이 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및/또는 라미닌을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 MSC를 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 분화 조직이 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 포함하는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 분화 조직이 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함하는, 방법.
MSC 증식의 촉진 방법으로서,
(a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 MSC를 ECM에 씨딩하여 상기 분리된 MSC 샘플의 증식을 촉진하는 단계
를 포함하는, MSC 증식의 촉진 방법.
제12항에 있어서, 상기 샘플이 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직으로부터 유래하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 샘플이 제대혈(UCB)인, 방법.
제14항에 있어서, 상기 제대혈이 사람 UCB(hUCB)인, 방법.
제12항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM이 사람 골수 세포로부터 유래되는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 ECM이 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및/또는 라미닌을 포함하는, 방법.
분화 조직의 생성 방법으로서,
(a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 MSC를 면역기능저하 마우스에 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계
를 포함하는, 분화 조직의 생성 방법.
제18항에 있어서, 상기 분화 조직이 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 포함하는, 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 분화 조직이 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함하는, 방법.
중간엽 줄기 세포(MSC)의 분리 방법으로서,
(a) 샘플을 수집하는 단계;
(b) 상기 샘플을 세포외기질(ECM)로 사전코팅된 배양 접시 상에 씨딩하는 단계; 및
(c) 상기 MSC를 분리하는 단계
를 포함하는, 중간엽 줄기 세포(MSC)의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 샘플이 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직으로부터 유래하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 샘플이 제대혈(UCB)인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 샘플이 출생 후에 수집되는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 제대혈이 사람 UCB(hUCB)인, 방법.
제23항에 있어서, 상기 hUCB 샘플이 씨딩 전에 단핵 세포를 수집하기 위해 원심분리되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 ECM이 사람 골수 세포로부터 유래되는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 ECM이 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및/또는 라미닌을 포함하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분리된 MSC를 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제29항에 있어서, 상기 분화 조직이 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 상기 분화 조직이 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함하는, 방법.
MSC 증식의 촉진 방법으로서,
(a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 MSC를 ECM에 씨딩하여 상기 분리된 MSC 샘플의 증식을 촉진하는 단계
를 포함하는, MSC 증식의 촉진 방법.
제32항에 있어서, 상기 샘플이 골막, 해면골, 지방 조직, 윤활막, 골격근, 유치, 태아 췌장, 폐, 간, 양수, 제대혈 및 제대 조직으로부터 유래하는, 방법.
제33항에 있어서, 상기 샘플이 제대혈(UCB)인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 제대혈이 사람 UCB(hUCB)인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 ECM이 사람 골수 세포로부터 유래되는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 ECM이 콜라겐 I형, 콜라겐 III형, 피브로넥틴, 비글리칸, 데코린, 퍼레칸 및/또는 라미닌을 포함하는, 방법.
분화 조직의 생성 방법으로서,
(a) 분리된 MSC의 샘플을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 MSC를 면역기능저하 마우스에 이식하여 분화 조직을 수득하는 단계
를 포함하는, 분화 조직의 생성 방법.
제38항에 있어서, 상기 분화 조직이 3개의 배아 배엽층 유래의 조직을 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 분화 조직이 내배엽-샘; 중배엽-골, 근육, 지방, 혈관; 및/또는 외배엽-신경 섬유를 포함하는, 방법.