JP2012521780A - ヒト臍帯血に由来する間葉系幹細胞の単離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は概して生物学の分野に関する。とりわけ、本発明は、臍帯血(UCB)から間葉系幹細胞を単離して増殖させるための方法に関する。
幹細胞は、今日の生物医学で最も魅力的な領域の一つである。間葉系幹細胞(MSC)は、その自己複製能と多系列への分化能とのために大きな治療可能性を有する。
本発明は、ECMへの接着によりMSCを単離する方法を提供し、かつ単離MSCの使用を提供する。
MSCは、その自己複製能と多系列への分化能とに起因して、大きな治療可能性を有する。MSCは多能性幹細胞であって、様々な細胞タイプへと分化することができる。インビトロまたはインビボにおいてMSCが分化することが示されている細胞タイプは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞を含む。本明細書中に使用される用語「幹細胞」は、一種又は複数種の細胞系列を生じる細胞を指す。
今日まで、MSCの単離は、そのプラスチック接着能に依存してきた。従って、プラスチックへの接着能が不十分なためにUCB中の真のMSCの一部は見落とされる可能性が高い。さらに、幹細胞には、その機能を維持するための専用の微小環境が必要である。MSCの幹細胞特性が喪失することから分かるように、現状の組織培養技術ではこの環境が提供されていない。かわりにこれは、老化するか、「自発的に」特定の細胞系列にコミットするか、または形質転換細胞になる。
1.組織工学基礎研究:ECM接着により得られる、高度に精製された大量のhUCB-MSCによって、その挙動を制御する分子機序の研究が促進される。
2.創薬:ECM上で維持される、高度に精製されたhUCB-MSCは、インビトロでのドラッグスクリーニングに使用可能である。
3.組織工学の臨床使用:大量の未変性且つ多能性のUCB-ELSCは、近い将来、細胞ベースの臨床応用に関してES細胞の代替物となる可能性がある。
本発明の好ましい態様を実証するために、以下の実施例を含める。後述の実施例中に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能すると本発明者により発見された技術を表しており、かつしたがって、その実施に関して好ましい様態を構成するとみなされ得ることが、当業者により理解されるべきである。しかしながら、本開示を鑑みて当業者は、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく開示される具体的態様において多くの変更が可能でありかつ同様もしくは同等の結果が得られることを理解されたい。
(1)新鮮な単離ヒト骨髄単核細胞(MSCを含む、20〜30歳のドナーから入手)をALLCELLS(Emeryville、CA)から購入する。
(1)Ficoll密度勾配を使用した、hUCBの単核細胞(MNC)の単離:抗凝固処理した臍帯血を平衡塩類溶液(BSS)で希釈する(1:1)。希釈臍帯血を50mlチューブ中で、10mlのFicoll-Paque PREMIUM 溶液(GE Healthcare BioSciences社、Piscataway、NJ)層上にゆっくりと重ねる(比率4:1)。層状の血液試料を、18〜20℃にて30分間、480gで遠心分離する。単核/白色層を回収して新しい50mlチューブに入れ;3倍容量のBSSをMNCに加え;細胞懸濁物を、18〜20℃にて6分間、480gで遠心分離し;ペレットを10mlの2%FBS含有α-MEM中に再懸濁する。細胞を計数し、生存率を確認する。
方法:
プラスチックと骨髄由来ECMに対してMSCが接着する能力を比較するために、細胞1×106個/cm2にてプラスチック上に細胞を播種し、4、24、および72時間インキュベートした。プラスチックから非接着細胞を回収し、ECM上に再播種して、さらに24時間インキュベートした。接着細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、定量した(図8)。脂肪生成および筋形成の判定は、それぞれ脂肪生成培地または筋形成培地中に維持した細胞により行った。
UCB中の接着細胞の大多数は、インキュベーション4時間時点でECMへ付着することができた。一方、プラスチックには、ほとんど細胞は付着しなかった。しかしながら、プラスチックから回収された非接着細胞は、ECMへ付着する多数の細胞を含んでいた。ECM接着性の細胞は、インビトロで、脂肪細胞および筋肉細胞に分化することができる。
(1)移植:
0.5×106個の前培養されたhUCB-MSC(継代6〜8代目)を、移植媒体であるヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム(HA/TCP)セラミック粉末またはGelfoamへと載せて、10週齢の免疫不全ベージュマウス(NIH-bg-nu-xid)の背面内に皮下移植した。
移植2〜4ヶ月後に、移植物を回収し、4%ホルムアルデヒドを用いて、室温で固定する。パラフィン包埋移植物の4μm連続切片を、H&E染色および免疫染色により試験する。ドナーのhUCB-MSCから分化した組織は、抗ヒト特異的RNP抗体(1:60;Millipore/Chemicon)で免疫染色することにより検出可能である。
大量のUCB-MSCがECMに接着したが、プラスチックには接着しなかった
骨髄細胞により作られた細胞外マトリックス(ECM、図1、図2)は、hUCB-MSCの付着と増殖とを向上させると共に、その幹細胞特性を保持した。このシステムを使用して、ECMには接着するがプラスチックには接着しない多数のMSCが、ヒトUCBに含まれることが分かった。初代細胞をMNC 3×104〜1×105個/cm2の播種密度でECM上にて培養した場合、多数のコロニーが形成された(図3、4)。このデータが示すのは、ECM上で培養されたhUCB-MSCが、プラスチック上で培養されたものよりも遙かに大きなコロニー形成能を有することである。コロニー形成単位(CFU)の測定によると、hUCB-MSCの出現頻度は、MNC 1×108個当たり22,800〜37,000個であり、これは、他者により従前に報告された(MNC 1×108個当たり0.4〜30個)よりも少なくとも1,000(760〜92,500)倍大きい。
ECMへ接着した細胞の表現型は、フローサイトメトリー分析により決定され、これによって、これらの細胞の約40%がES細胞マーカーであるSSEA-4(15)を発現したこと、ならびに、前記細胞の約90%はCD29、CD105、CD166、およびCD146を含む数種のMSCマーカーも発現したが造血細胞マーカーであるCD34とCD45との発現はみられなかったことが示唆された(図8)。対照的に、プラスチックへ接着した細胞は、ほとんどSSEA-4+細胞を含まず、少数の細胞がこれらのMSCマーカーを発現した。これらの結果により、ECMへ接着した細胞の表現型がプラスチックへ接着したものと非常に異なることが示唆される。ECM接着により単離された細胞は独特であり、MSCの比較的均質な集団を含む可能性がある。これらの細胞は、ES細胞の特徴の一部を有する可能性もある。
ECMシステムにより、ヒト臍帯血から胚様細胞が濃縮される。ECMにより取得され、続いてECM上で培養されたhUCB-MSCは、胚性幹細胞の独特の特徴である胚体をインビトロで形成した(図5および図6)。いかなる特異的分化誘導も行わずに、hUCB-MSCを免疫無防備状態マウスに移植することにより、以下を含む三種類の胚性胚葉に由来する組織が生成された:内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および外胚葉-神経線維。ドナーhUCB-MSCからこれらの組織が分化し、抗ヒト特異的RNP抗体を用いた免疫染色により検出される。大多数の移植物は、hES細胞のような細胞から生成された様々な異質性組織を含んでいたが、テラトーマは生じなかった(図9)。
hUCB-MSCをさらに定義し特徴付けるため、本発明者らは、ECM接着により単離されたUCB-MSCが、NANOG、OCT4、TDGF1、DNMT3B、GABRB3、およびSox2を発現するかどうかを検討した。これらのマーカーは全て、hES細胞により強く発現される(Adewumiら、2007)。ECM接着により単離されたUCB-MSCが発現しているこれら遺伝子のレベルは、hES細胞が発現しているレベルよりも遙かに低いが、プラスチック接着により単離されたUCB-MSCおよびヒト骨髄由来の間葉系幹細胞(hBM-MSC)が発現しているレベルの両者よりは高いことが分かった(図10)。これは、これらの遺伝子のいくつかを組み込んだ体細胞がテラトーマを形成することは従前の研究により明確に示されているため、ECM接着により単離されたUCB-MSCがテラトーマを形成しなかった理由の説明となる可能性がある。UCBは、BM由来のECMには接着するがプラスチックには接着しない多数の胚様幹細胞を含み得、かつ、ECM接着法により得られたUCB-MSCは、古典的なプラスチック接着法により単離されたものとは異なる特性を有し得るようである。ECM接着により得られたUCB-MSCの分化ステージはES細胞に近い可能性があり、かつこれは、従来のプラスチック接着法により単離されたUCB-MSCと比較して分化のより初期にある可能性がある。以上より、これらのデータは、ECM接着により単離されたhUCB-MSCが、これまでに特徴決定されたタイプの幹細胞(hESC、hBM-MSC、脂肪組織-MSC、骨膜-MSC等、およびさらに、標準的プラスチック接着法を使用して単離されたhUCB-MSC)と比較して、これらの細胞を幹細胞の別のクラスへと位置づける根拠となるのに十分な独特の特性を有していることを示唆する。
[本発明1001]
(a)試料を採取する工程;
(b)細胞外マトリックス(ECM)プレコート培養皿上に該試料を播種する工程;および
(c)間葉系幹細胞(MSC)を単離する工程
を含む、MSCを単離する方法。
[本発明1002]
前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記試料が臍帯血(UCB)である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記試料が出生後に採取される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
播種前に単核細胞を採取するために前記hUCB試料を遠心分離する、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記単離MSCを移植して分化組織を得る工程をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
(a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCの試料の増殖を促進させるために該単離MSCをECM上に播種する工程
を含む、MSC増殖を促進させるための方法。
[本発明1013]
前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記試料が臍帯血(UCB)である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
(a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCを免疫無防備状態マウス中に移植して分化組織を得る工程
を含む、分化組織を産生する方法。
[本発明1019]
前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、本発明1018または1019の方法。
[本発明1021]
(a)試料を採取する工程;
(b)細胞外マトリックス(ECM)プレコート培養皿上に該試料を播種する工程;および
(c)間葉系幹細胞(MSC)を単離する工程
を含む、MSCを単離する方法。
[本発明1022]
前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記試料が臍帯血(UCB)である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記試料が出生後に採取される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、本発明1023の方法。
[本発明1026]
播種前に単核細胞を採取するために前記hUCB試料を遠心分離する、本発明1023の方法。
[本発明1027]
前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記単離MSCを移植して分化組織を得る工程をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1030]
前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
(a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCの試料の増殖を促進させるために該単離MSCをECM上に播種する工程
を含む、MSC増殖を促進させるための方法。
[本発明1033]
前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記試料が臍帯血(UCB)である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、本発明1032の方法。
[本発明1037]
前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
(a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCを免疫無防備状態マウス中に移植して分化組織を得る工程
を含む、分化組織を産生する方法。
[本発明1039]
前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、本発明1039の方法。
Claims (40)
- (a)試料を採取する工程;
(b)細胞外マトリックス(ECM)プレコート培養皿上に該試料を播種する工程;および
(c)間葉系幹細胞(MSC)を単離する工程
を含む、MSCを単離する方法。 - 前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、請求項1記載の方法。
- 前記試料が臍帯血(UCB)である、請求項2記載の方法。
- 前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、請求項3記載の方法。
- 前記試料が出生後に採取される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 播種前に単核細胞を採取するために前記hUCB試料を遠心分離する、請求項4または5記載の方法。
- 前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、請求項7記載の方法。
- 前記単離MSCを移植して分化組織を得る工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、請求項9記載の方法。
- 前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、請求項9または10記載の方法。
- (a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCの試料の増殖を促進させるために該単離MSCをECM上に播種する工程
を含む、MSC増殖を促進させるための方法。 - 前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、請求項12記載の方法。
- 前記試料が臍帯血(UCB)である、請求項13記載の方法。
- 前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、請求項14記載の方法。
- 前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、請求項16記載の方法。
- (a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCを免疫無防備状態マウス中に移植して分化組織を得る工程
を含む、分化組織を産生する方法。 - 前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、請求項18記載の方法。
- 前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、請求項18または19記載の方法。
- (a)試料を採取する工程;
(b)細胞外マトリックス(ECM)プレコート培養皿上に該試料を播種する工程;および
(c)間葉系幹細胞(MSC)を単離する工程
を含む、MSCを単離する方法。 - 前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、請求項21記載の方法。
- 前記試料が臍帯血(UCB)である、請求項22記載の方法。
- 前記試料が出生後に採取される、請求項23記載の方法。
- 前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、請求項23記載の方法。
- 播種前に単核細胞を採取するために前記hUCB試料を遠心分離する、請求項23記載の方法。
- 前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、請求項21記載の方法。
- 前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、請求項27記載の方法。
- 前記単離MSCを移植して分化組織を得る工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、請求項29記載の方法。
- 前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、請求項30記載の方法。
- (a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCの試料の増殖を促進させるために該単離MSCをECM上に播種する工程
を含む、MSC増殖を促進させるための方法。 - 前記試料が骨膜、海綿骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、胎性の膵臓、肺、肝臓、羊水、臍帯血、および臍帯組織に由来する、請求項32記載の方法。
- 前記試料が臍帯血(UCB)である、請求項33記載の方法。
- 前記臍帯血がヒトUCB(hUCB)である、請求項34記載の方法。
- 前記ECMがヒト骨髄細胞に由来する、請求項32記載の方法。
- 前記ECMがI型コラーゲン、III型コラーゲン、フィブロネクチン、バイグリカン、デコリン、パールカン、および/またはラミニンを含む、請求項36記載の方法。
- (a)単離MSCの試料を入手する工程;および
(b)該単離MSCを免疫無防備状態マウス中に移植して分化組織を得る工程
を含む、分化組織を産生する方法。 - 前記分化組織が三種類の胚性胚葉由来の組織を含む、請求項38記載の方法。
- 前記分化組織が内胚葉-腺;中胚葉-骨、筋肉、脂肪、血管;および/または外胚葉-神経線維を含む、請求項39記載の方法。
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