CN105524877A - 一种脐带间充质干细胞的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种脐带间充质干细胞的分离方法，它包括如下步骤：(1)取新鲜脐带，剪短，去除血污；(2)剪碎成体积为2～3mm³的组织块，均匀平铺于包被了细胞外基质的培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养1～4h，然后添加间充质干细胞培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养；(3)在培养第5天时，对培养基进行半换液；在培养第8天时，去掉所有组织块，并对培养基进行全换液；在细胞融合度为30-40％时收获细胞，即可。本发明方法可以高效的分离脐带间充质干细胞，操作简单，应用前景良好。

Description

一种脐带间充质干细胞的分离方法

技术领域

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离方法。

背景技术

间充质干细胞(MesenchymalStemCell，MSC)是一群具有强大的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，在免疫调节和抗炎症反应方面效果显著，因此被大量应用于临床研究和治疗，其适应症涵盖移植物抗宿主反应(GVHD)、神经系统疾病、糖尿病、肝病等多种重大疾病。

脐带间充质干细胞是从新生儿脐带中分离获得，具有更加原始、增殖能力更强和免疫原性更低等特点，同时脐带间充质干细胞来源丰富、取材方便且没有伦理等因素的限制，是目前间充质干细胞最重要的来源。

研究表明，每厘米脐带中理论上含有约1×10⁶个间充质干细胞。目前国内外常用的分离方法主要有酶消化法和组织块贴壁法两种：酶消化法成本高，容易对细胞造成的损伤甚至细胞突变，临床应用存在极大风险；组织块贴壁法具有操作简便，成本低廉和细胞损伤小等优点，因而更合适临床的应用，但现有常规的组织块贴壁法得到脐带间充质干细胞细胞周期较长，效率低，导致获得的原代细胞数量较少，且纯度不高，易混杂内皮细胞，不能达到MSC临床使用的国际标准，导致临床应用较为困难。

发明内容

为了解决前述问题，本发明提供了一种改良的组织块贴壁法。

本发明脐带间充质干细胞的分离方法，它包括如下步骤：

(1)取新鲜脐带，剪短，去除血污；

(2)剪碎成体积为2～3mm³的组织块，均匀平铺于包被了细胞外基质的培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养1～4h，然后添加间充质干细胞培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养；

(3)在培养第5天时，对培养基进行半换液；在培养第8天时，去掉所有组织块，并对培养基进行全换液；在细胞融合度为30-40％时收获细胞，即可。

细胞外基质：存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的一组蛋白质混合物，帮助细胞附着和生长，包括纤维性成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为蛋白聚糖)等。明胶或者Cellstart基质均属于细胞外基质。

半换液：去除培养皿中一半培养基，再补充一半新鲜的培养基。

全换液：除去培养皿中所有的培养基，再补充新鲜的培养基。

优选地，步骤(1)中，所述剪短是剪为长度为1～1.5cm小片段。

优选地，步骤(1)中，所述去除血污的方法是PBS溶液清洗。

优选地，步骤(2)中，所述细胞外基质是明胶或者Cellstar基质。

其中，所述明胶的浓度为0.1～0.5％(w/v)；所述Cellstart基质的浓度为1％～2％(w/v)。优选地，所述明胶的浓度为0.2％(w/v)；所述Cellstart基质的浓度为2％(w/v)。

优选地，步骤(2)中，添加培养基之前的培养时间为2h。

本发明间充质干细胞培养基可以是含血清间充质干细胞培养基或无血清间充质干细胞培养基，但动物血清带来的异源污染会为临床使用带来风险，因此，优选为无血清间充质干细胞培养基。

其中，无血清间充质干细胞培养基可以为STEMPROMSCSFM。

本发明还提供了前述方法制备的脐带间充质干细胞。

本发明方法可以促进细胞从脐带组织中爬出，有效地提高了脐带间充质干细胞的分离效率，使得单位长度脐带组织获得间充质干细胞的数量大大提升，也可以提高脐带间充质干细胞的纯度并达到了MSC临床使用的国际标准，能够临床使用。同时，本发明方法操作简便，成本低廉，应用前景良好。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1基质浓度筛选实验结果；

图2与传统方法的比较的实验结果；

图3第5天显微镜下观察结果；左图：未包被基质实验组；右图：包被基质实验组；

图4本发明实验组第8天显微镜下观察结果；左图：去除组织块前右图：去除组织块后；

图5本发明实验组第11天显微镜下观察结果；

图6生长曲线；

图7流式细胞术检测结果；

图8体外诱导分化实验结果。

具体实施方式

实施例1本发明分离纯化方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿用1ml0.2％明胶包被过夜，去除残留明胶；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM，购自LifeTechnologies公司)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

实施例2本发明分离纯化方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿用1ml2％的Cellstart基质包被过夜，去除残留Cellstart基质；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

实施例3本发明分离纯化方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿用1ml0.1％明胶包被过夜，去除残留明胶；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1.5cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1.5cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于明胶预处理的培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

实施例4本发明分离纯化方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿用1ml0.5％明胶包被过夜，去除残留明胶；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养1h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

实施例5本发明分离纯化方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿用1ml1％Cellstart基质包被过夜，去除残留Cellstart基质；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养4h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

实施例6基质浓度筛选试验

1、实验方法

培养皿预处理：10cm细胞培养皿分别用1ml1％的Cellstart基质、0.2％的Cellstart基质、0.2％的明胶包被过夜，去除残留基质；对照组不包被基质。

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带放置在明胶包被的培养皿中，添加1ml胎牛血清后将脐带剪碎至2～3mm³大小组织块并均匀平铺于培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(LG-DMEM/F12及10％胎牛血清)10ml继续在相同条件下培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；第11天收获细胞并进行细胞计数。

2、实验结果

如图1所示，预先用0.2％明胶或者0.2～1％的Cellstart基质处理10cm细胞培养皿后，能够明显提升原代细胞数量；其中1％cellsart预处理效果最好。

本发明方法中，细胞外基质可以为明胶或者Cellstart基质，优选为Cellstart基质。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1与传统方法的比较

1、试验方法

培养皿预处理：

未包对照组：未包被任何基质；

明胶包被实验组：明胶(0.2％浓度)包被培养皿；

Cellstart包被实验组：Cellstart基质(2％浓度)包被培养皿。

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于上述三种培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

2、试验结果

试验结果如图2所示

试验结果如图3所示：

每1cm长度脐带，对照组获得原代细胞的数量为(104±55)×10⁴个/皿；明胶包被实验组获得的原代细胞数为(179±99)×10⁴个/皿；Cellstart包被实验组获得的原代细胞为(287±98)×10⁴个/皿；

由此可见，采用本发明方法可以在相同时间内获得更多的原代间充质干细胞，因而可以大大提升细胞生产的效率，节约脐带原材料和成本。

实验例2细胞爬出实验

1、试验方法

培养皿预处理：

未包对照组：未包被任何基质；

明胶包被实验组：明胶(0.2％浓度)包被培养皿；

组织块法分离脐带间充质干细胞：用眼科剪将新鲜脐带剪成1cm长度，用PBS清洗脐带血污；每1cm长度脐带剪碎至2～3mm³大小组织块，并均匀平铺于上述两种培养皿中；放置37℃5％CO₂条件下培养2h，然后添加间充质干细胞培养基(STEMPROMSCSFM)10ml在相同条件下继续培养；第5天进行培养基半换液；第8天全换液并去掉所有组织块；在细胞融合度为30～40％时收获细胞。

检测：分别在第5、8、11天通过显微镜观察细胞生长情况；

2、试验结果

实验结果如图3～5所示：

在第5天时，对照组脐带组织块紧贴培养皿且不透光，少量长梭形脐带间充质干细胞从脐带组织中爬出；而本发明包被基质实验组的脐带组织块紧贴培养皿底部且不透光，大量长梭形脐带间充质干细胞从脐带组织中爬出；

在第8天时，本发明包被基质实验组在去除组织块前，脐带组织块紧密贴壁，长梭形间充质干细胞围绕脐带组织块生长；去除组织块后，组织块位置形成空白区域没有细胞生长，而间充质干细胞围绕这些空白区域成放射状生长；在第11天时，本发明包被基质实验组的间充质干细胞长满空白区域，并形成很大的细胞集落。

实验结果可以说明，本发明方法可以有效促进细胞从脐带组织中爬出。

实验例3本发明方法制备得到的脐带间充质干细胞的性质检测

1、试验方法

(1)传代培养：取实施例1制备脐带间充质干细胞原代细胞，去除培养皿中培养基，用PBS漂洗2次；每皿中加入1ml0.05％胰酶(含0.02％EDTA)，放置于37℃培养箱中消化，至细胞变圆回缩，立刻补加2ml血清培养基(LG-DMEM/F12及10％胎牛血清)终止消化；轻柔吹打下皿底的细胞，并将细胞悬液转移进50ml离心管，400g离心5分钟，沉淀细胞；弃上清，再用10mlPBS洗涤细胞沉淀，400g离心5分钟，沉淀细胞；弃上清，用10ml新鲜无血清培养基重悬细胞团，吹打混匀，按照5×10⁵/cm²接种到T75培养瓶中，置于CO₂培养箱中，于37℃，5％CO2浓度下培养；待细胞长至80％汇合度，收获细胞用于传代或冻存。

(2)检测

A、绘制脐带间充质干细胞生长曲线

在六孔细胞板中接种脐带间充质干细胞，1×10⁵个/孔，共6孔；每天取1孔计数：弃去培养基，用PBS洗涤一次，加入1ml0.05％胰酶(含0.02％EDTA)放置于37℃培养箱中消化，至细胞变圆回缩，立刻补加1mlLG-DMEM/F12(含10％胎牛血清)培养基终止消化；轻柔吹打下孔板中的细胞，取样进行计数；连续6天计数后，绘制脐带间充质干细胞生长曲线。

B、脐带间充质干细胞流式检测

取2×10⁶个细胞，用PBS洗涤2次，再用250ulPBS重悬细胞并分成5份进行抗体孵育：每50μl细胞悬液分别加入CD45-FITC、HLA-DR-FITC、CD90-FITC和CD105-PE流式抗体各10μl，并设置流式阴性对照，室温避光孵育20分钟后用PBS洗涤2次，最后用500ulPBS重悬后在BeckmanFC500流式细胞仪上进行分析。

C、分化特性检测

成骨诱导和成脂诱导实验：脐带间充质干细胞按照1×10⁵个细胞/孔接种在六孔细胞板中，待细胞长至80％汇合度时，更换培养基为成骨诱导培养基(高糖DMEM、10％胎牛血清、地塞米松10M,β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml；)和成脂诱导培养基(高糖DMEM、10％胎牛血清,胰岛素10μg/ml)，然后每三天更换诱导培养基；成骨诱导14天后用茜素红染色，成脂诱导10天后用油红染色。

成软骨诱导实验：脐带间充质干细胞调整密度为2×10⁷个/ml，接种细胞团至6孔板中，添加成软骨诱导培养基(高糖DMEM、10％胎牛血清、抗坏血酸50μg/ml、100nmol/L地塞米松、40μg/ml脯氨酸、50mg/mlITS和TGF-β110ng/ml)；每三天更换诱导培养基，14天后用甲苯胺蓝染色。

2、试验结果

(1)生长曲线

生长曲线如图6所示，可以看出，本发明方法分离得到的脐带间充质干细胞生长快速。

(2)流式检测

如图7所示，表面标志物CD45和HLA-DR小于2％，表面标志物CD90和CD105大于95％，证明获得足够纯度的脐带间充质干细胞，达到MSC临床使用的国际标准。

实验结果说明，本发明分离方法可以获得高纯度的脐带间充质干细胞。

(3)分化特性检测

如图8所示，成脂诱导分化的细胞脂滴经油红染成红色，成骨诱导分化形成的骨结节被茜素红染成红色；而成软骨诱导分化中细胞分泌的酸性糖胺多糖和胶原染成红色；说明本发明方法获得的脐带间充质干细胞能够在体外分别向脂肪、骨和软骨三个方向分化。

实验结果说明，本发明方法获得的细胞具有成脂、成骨和成软骨多项分化潜能，具有典型的间充质干细胞特性，说明本发明方法的确分离得到了脐带间充质干细胞。

综上，本发明方法可以有效促进细胞从脐带组织中爬出，可以大大提高单位长度脐带组织分离得到的脐带间充质干细胞数量，有效地提高了脐带间充质干细胞的分离效率，也可以提高获得脐带间充质干细胞的纯度，达到了MSC临床使用的国际标准。可以临床使用。

Claims (9)

1.一种脐带间充质干细胞的分离方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取新鲜脐带，剪短，去除血污；

(2)剪碎成体积为2～3mm³的组织块，均匀平铺于包被了细胞外基质的培养皿中，在37℃、5％CO₂条件下培养1～4h，然后添加间充质干细胞培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养；

(3)在培养第5天时，对培养基进行半换液；在培养第8天时，去掉所有组织块，并对培养基进行全换液；在细胞融合度为30～40％时收获细胞，即可。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述剪短是剪短为长1～1.5cm的小段。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(1)中，所述去除血污的方法是采用PBS溶液清洗。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述细胞外基质是明胶或者Cellstart基质。

5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于：所述明胶的浓度为0.1～0.5％(w/v)；所述Cellstart基质的浓度为0.2～2％(w/v)。

6.根据权利要求5所述的分离方法，其特征在于：所述明胶的浓度为0.2％(w/v)；所述Cellstart基质的浓度为1％～2％(w/v)。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，添加培养基之前的培养时间为2h。

8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述间充质干细胞培养基是无血清间充质干细胞培养基。

9.权利要求1～8任意一项所述方法制备的脐带间充质干细胞。