CN113980895A - 一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开提供了一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，所述培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为UltraCulture无血清培养基，添加物各组分及浓度为：1.0%‑5.0%血清替代物，1.0‑10.0mM烟酰胺，0.5‑5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。本发明还公开了一种人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，即采用组织培养法结合混合酶消化法，可快速、高效分离得到数量大，纯度高，状态好的脐带间充质干细胞，既缩短原代培养时间，又简便易操作。利用本发明可提高脐带组织的利用率和间充质干细胞得率，并且细胞纯度高，活性好，可满足临床应用的要求。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，涉及一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法。
背景技术
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源于早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。近年来研究发现间充质干细胞对心脑血管疾病、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤及自身免疫性疾病等有明显疗效，参与机体免疫调节和细胞生长。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells ，huc-msc）是存在于新生儿脐带华通胶和血管周围组织中的一种间充质细胞，具有来源广泛，取材方便，增殖能力强，细胞表型稳定，免疫原性低等优点，并且可分泌大量细胞因子参与机体免疫调节，是临床研究与应用的合适材料来源，具有广泛的应用前景。
目前，脐带间充质干细胞的分离方法主要集中在组织贴壁法和酶解法。组织贴壁法制备脐带间充质干细胞所需时间长，操作难度大，接种过程容易污染，原代细胞迁出率较低等因素使得组织贴壁法并未得到批量化应用。酶消化法一般采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化脐带组织华通氏胶进行培养，由于经济成本高，消化时间长，消化率难以把控，容易造成过度消化，细胞贴壁率降低并且大量死亡。因此，亟需开发一种适用于脐带间充质干细胞增殖的培养基和一种高效、安全的脐带间充质干细胞分离纯化方法，为干细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种改良人脐带间充质干细胞培养基和人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，使用该制备方法可促进细胞快速稳定增殖，缩短消化时间，减少细胞损伤，提高细胞得率，降低成本，简化操作。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种改良人脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基。
其中，添加物及各组分浓度：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
其中，添加物各组分及浓度为：2.0%血清替代物，5mM烟酰胺，1nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
为解决上述技术问题，本发明提供一种人脐带间充质干细胞分离纯化方法，包括以下步骤：
（1）采集脐带样本：取足月健康分娩的胎儿脐带10-15 cm置于含1%双抗的生理盐水的采集瓶中，室温下运送至实验室，采集样本需在6 h内进行分离操作；
（2）样本预处理：将脐带样本从采集瓶中取出，置于75%酒精中处理15-30秒，生理盐水洗涤3次，去除残留酒精；
（3）获得华通氏胶：将10-15cm的脐带样本剪成2.0-3.0cm小段，剔除血管，置于含1%双抗的生理盐水中，漂洗去除残留血渍；
（4）剪碎处理：先用15 cm眼科剪将其剪至0.5-1.0cm小段，后用10 cm眼科剪将其均匀剪碎至1mm3组织碎块，在剪碎的过程中即加入1 ml胶原酶Ⅱ进行预消化，收集剪碎组织于50 ml蓝盖瓶中；
（5）混合酶消化：根据脐带组织的长度（厘米）：混合酶（毫升）=1：1.5确定加入混合酶消化的量，置于37℃水浴摇床，250 rpm消化2.5-3.5小时；
（6）离心收集细胞：用70 um筛网将消化后的悬液过滤到50 ml离心管中，用D-Hanks液稀释，1000 g离心10 min，弃上清，重复2次；
（7）细胞接种：将离心收集细胞用完全培养基接种至T-75细胞培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中培养，培养得到细胞即为P0代；
（8）传代培养：待P0代密度达到80-90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代得到的细胞即为P1代，其传代培养方式是以1:3-5；
（9）细胞质检，待P2融合度达到80%即进行细胞质检，包括无菌检测，支原体检测，内毒素检测，流式细胞表型检测及分化能力检测。
其中，混合酶消化法中消化液包括5%中性蛋白酶，5%透明质酸酶，10%胶原酶和混合酶稀释液。
其中，混合酶液的加入量为脐带组织长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5，消化条件为水浴摇床37℃，250 rpm消化2.5-3.5小时。
其中，传代培养时P0代细胞融合度达到80-90%，传代时间间隔2天，传代比例1:4。
其中，细胞质检，检测P3代培养细胞表面标记物，即CD73-APC、CD90-FITC和CD105-PerCP阳性率均大于95%，CD45-PE、CD34-PE 、CD11b-PE、CD19-PE、HLA-DR-PE阳性率均低于2%。
其中，细胞质检过程中，微生物检测，支原体检测均为阴性，内毒素检测小于≤0.5EU/mL，传代培养的脐带间充质干细胞具有成骨，成脂，成软骨分化能力。
附图说明
图1为本发明实施例中人脐带间充质干细胞P0代细胞培养效果图（400×）；
图2为本发明实施例中人脐带间充质干细胞P3代细胞培养效果图（200×）；
图3为本发明实施例中人脐带间充质干细胞P3代细胞经抗体孵育并洗涤后的流式检测结果图；
图4为本发明实施例中人脐带间充质干细胞成骨诱导分化鉴定结果；
图5为本发明实施例中人脐带间充质干细胞成脂诱导分化鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种改良人脐带间充质干细胞培养基，在无血清培养基UltraCulture加入2%血清替代物，添加物的组分及终浓度计包括：5mM烟酰胺，1nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸。1%谷氨酰胺。
实施例2
一种人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)采集脐带样本：取足月健康分娩的胎儿脐带10-15 cm置于含1%双抗的生理盐水的采集瓶中，室温下运送至实验室，采集样本需在6 h内进行分离操作；
(2)脐带样本预处理：将脐带样本从采集瓶中取出，置于75%酒精中处理15-30秒，生理盐水洗涤3次，去除残留酒精；将10-15cm的脐带样本剪成2.0-3.0cm小段，剔除血管，置于含1%双抗的生理盐水中，漂洗去除残留血渍；用15 cm眼科剪将其剪至0.5-1.0cm 小段，后用10 cm眼科剪将其均匀剪碎至1mm3组织碎块，在剪碎的过程中加入1 ml胶原酶Ⅱ进行预消化，收集剪碎组织于50 ml蓝盖瓶中；
(3)分离脐带间充质干细胞
根据脐带组织的长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5确定加入混合酶消化的量，置于37℃水浴摇床，250 rpm消化2.5-3.5小时。混合酶液比例为中性蛋白酶（1mg/ml）：透明质酸酶（1mg/ml）：胶原酶Ⅱ（1mg/ml）：稀释液(0.9%Nacl)=1:1:2:16，用70 um筛网将消化后的上清过滤到50 ml离心管中，用D-Hanks液稀释，1000 g离心10 min，弃上清，重复2次；
(4)细胞培养
原代培养：将离心收集细胞用完全培养基接种至T-75细胞培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中培养，培养得到细胞即为P0代；
传代培养：待P0代密度达到80-90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代得到的细胞即为P1代，其传代培养方式是以1传4的比例进行；
(5)细胞质检
检测P3代培养细胞表面标记物，即CD73-APC、CD90-FITC和CD105-PerCP阳性率均大于95%，CD45-PE、CD34-PE 、CD11b-PE、CD19-PE、HLA-DR-PE阳性率均低于2%。微生物检测，支原体检测均为阴性，内毒素检测小于≤0.5EU/mL，传代培养的脐带间充质干细胞具有成骨，成脂，成软骨分化能力。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加物，所述添加物各组分及浓度为：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为间充质干细胞无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述添加物及各组分浓度：1.0-5.0%血清替代物，1.0-10.0mM烟酰胺，0.5-5nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
4.根据权利要求1所述的改良人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于，所述添加物各组分及浓度为：2.0%血清替代物，5mM烟酰胺，1nM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，1%谷氨酰胺。
5.一种改良人脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集脐带样本：取足月健康分娩胎儿脐带10-15 cm置于含1%双抗的生理盐水的采集瓶中，室温下运送至实验室，采集样本需在6 h内进行分离操作；
（2）样本预处理：将脐带样本从采集瓶中取出，置于75%酒精中处理15-30秒，生理盐水洗涤3次，去除残留酒精；
（3）获得华通氏胶：将10-15cm的脐带样本剪成2-3cm小段，剔除血管，置于含1%双抗的生理盐水中，漂洗去除残留血渍；
（4）剪碎处理：先用15 cm眼科剪将其剪至0.5-1.0cm 小段，后用10 cm眼科剪将其均匀剪碎至1mm3组织碎块，在剪碎的过程中即加入1 ml胶原酶Ⅱ进行预消化，收集剪碎组织于50 ml蓝盖瓶中；
（5）混合酶消化：根据脐带组织的长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5确定加入混合酶消化的量，置于37℃水浴摇床，250 rpm消化2.5-3.0小时；
（6）离心收集细胞：用70 um筛网将消化后的悬液过滤到50 ml离心管中，用D-Hanks液稀释，1000 g离心10 min，弃上清，重复2次；
（7）细胞接种：将离心收集细胞用完全培养基接种至T-75细胞培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中培养，培养得到细胞即为P0代；
（8）传代培养：待P0代密度达到80-90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代得到的细胞即为P1代，其传代比例1:3-5；
（9）细胞质检，待P2融合度达到80%即进行细胞质检，包括无菌检测，支原体检测，内毒素检测，流式细胞表型检测及分化能力检测。
6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述混合酶消化法中消化液包括5%中性蛋白酶，5%透明质酸酶，10%胶原酶Ⅱ和混合酶稀释液。
7. 根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述所述混合酶液的加入量为脐带组织长度（厘米）：混合酶（毫升）=1:1.5，消化条件为水浴摇床37℃，250 rpm消化2.5-3.0小时。
8.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，传代培养时P0代细胞融合度达到80-90%，传代时间间隔2天，传代比例1:4。
9.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，细胞质检时检测P3代培养细胞表面标记物，即CD73-APC、CD90-FITC和CD105-PerCP阳性率均大于95%，CD45-PE、CD34-PE 、CD11b-PE、CD19-PE、HLA-DR-PE阳性率均低于2%。
10.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，细胞质检过程中，微生物检测，支原体检测均为阴性，内毒素检测小于≤0.5EU/mL，传代培养的脐带间充质干细胞具有成骨，成脂，成软骨分化能力。
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