CN105420182A

CN105420182A - 一种无血清的脐带间充质干细胞培养基

Info

Publication number: CN105420182A
Application number: CN201510796481.6A
Authority: CN
Inventors: 杨继建; 杜丽英; 田丽娜; 王伟; 徐娅妮; 孙镇; 秦倍倍
Original assignee: Shandong Jingyuan Biotech Co Ltd
Current assignee: Shandong Jingyuan Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明提供一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，属于细胞培养技术领域，该无血清的脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份有：碱性成纤维生长因子hFGF；表皮生长因子hEGF；胰岛素hI；白血病抑制因子hLIF；黄芪多糖APS；脐带间充质细胞在上述培养基中传代培养及扩增，之后对培养细胞表面标记分析。本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基克服了血清外源性污染缺陷和细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。其不含血清，可避免动物源血清成份对细胞培养的影响；可用于研究脐带间充质干细胞的分化增殖调节机制。

Description

一种无血清的脐带间充质干细胞培养基

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说是一种无血清的脐带间充质干细胞培养基。

背景技术

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，细胞表面强表达特异性标记CD90，CD73，CD105，而不表达造血系或内皮系细胞的标记CD45、CD14、CD11、CD34、CD19，低表达或不表达主要组织相容性抗原HLA-DR。研究显示，脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞含量和增殖能力均优于后者，且免疫原性低、取材方便、无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。

在实际临床应用中，无外源性污染和细胞数量是保证脐带间充质干细胞治疗的必要因素。目前，脐带间充质干细胞的培养体系大都含有动物血清(如胎牛血清)，一方面由于血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另一方面采用添加血清培养的干细胞进行体内移植，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。目前，市场上存在的无血清干细胞培养基用于培养脐带间充质干细胞培养时，一部分由于无血清培养基组成方面的不足，生长速度慢，容易出现老化的特征影响细胞的大量扩增，一部分培养基中添加了昂贵的抗体等特殊因子，增加了脐带间充质干细胞扩增成本。以上弊端一定程度上阻碍了脐带间充质干细胞的临床治疗应用。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，克服血清外源性污染缺陷和细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种脐带间充质细胞在无血清的脐带间充质干细胞培养基中传代培养及扩增的实验方法，该实验方法的步骤是：

(一)首先制备无血清的脐带间充质干细胞培养基，该无血清的脐带间充质干细胞培养基包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：1-20ng/mL；

表皮生长因子hEGF：1-20μg/mL；

胰岛素hI：1-20μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.1-5ng/mL；

L-谷氨酰胺：1-10mM；

2-巯基乙醇：50-200μM；

亚硒酸钠：20-50nM；

转铁蛋白：10-30μg/mL；

人白蛋白：10-100mg/mL；

纤连蛋白：50-200μg/mL；

黄芪多糖APS：50-200μg/mL。

(二)脐带间充质细胞在上述培养基中传代培养及扩增的实验步骤是：

a.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，2min内即可溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；

b.把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫，然后250倍重力的转速离心5分钟；

c.弃上清液，分别加2mL预热的的上述培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d.标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37℃、5％CO₂培养箱中；

e.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞；

培养皿中的细胞覆盖率达到80％～90％时按1:3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为本发明培养基；显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况；拍照纪录；

f.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至80％融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×10⁴个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔板，每孔加入80μL浓度为5g/L的MTT溶液后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜DMSO，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度OD值，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，纪录结果；

(三)培养细胞的表面标记分析的试验步骤是：

取P2代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1:1的0.05％质量浓度胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/mL的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基克服了血清外源性污染缺陷和细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题。

本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，不含血清，可避免动物源血清成份对细胞培养的影响；成份明确，可用于研究脐带间充质干细胞的分化增殖调节机制；培养基中添加了植物多糖黄芪多糖促进脐带间充质干细胞的增殖，替代特殊抗体因子，降低了成本。

培养于本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基中的脐带间充质干细胞保持良好的贴壁特性，脐带间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态。

本发明生长培养基中的脐带间充质干细胞在54小时前能够生长至平台期。但对照生长培养基中的脐带间充质干细胞只能在66小时后才能够生长至平台期。由此可以看出，本发明的生长培养基能够有效地加速脐带间充质干细胞的生长速度。

本发明所述无血清培养基和对照组培养基培养MSC流式细胞表型对比结果显示，本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC阳性表达CD73、CD90、CD105，阴性表达CD14、CD19、CD34和CD45，没有统计学差异。

附图说明

图1A和图1B为不同干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形态图片：

图1A为本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形态图片；

图1B为普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的形态图片。

图2不同的生长培养基中生长的脐带间充质干细胞的生长曲线图：

图2中的1曲线为本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基培养的生长曲线图；

图2中的2曲线为普通干细胞培养基培养的脐带间充质干细胞的生长曲线图；

图2中，横坐标表示生长时间(单位为小时)，纵坐标表示550nm处测定各孔吸光光度值(OD值)。

具体实施方式

下面对本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基作以下详细说明。

本发明的一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，以及利用该培养基使脐带间充质细胞传代培养及扩增能力的实验方法，其句哟实施的实验是：

(一)无血清培养基中细胞因子的组合实验：

所选用的生长因子：重组人成纤维细胞生长因子2(hFGF)、人重组胰岛素(hI)、人重组表皮生长因子(hEGF)、人重组白血病抑制因子(hLIF)和黄芪多糖(APS)浓缩液，经无菌过滤除菌，冷藏或冻藏备用。

对于不同的生长因子设计不同的浓度(表1)添加到培养液中并根据生长曲线找到该生长因子的最佳效应浓度。经过浓度的筛选实验将最佳浓度的不同生长因子进行组合(表2)，考察各自对干细胞生长情况的影响(表3)，得到最佳生长因子组合培养液。

表1各种生长因子的浓度

表2细胞因子及浓度组合表

表3不同组合的培养基体系中细胞生长增殖的对比

表4极差分析结果

表4是日本田口正交试验得出结果。

根据表4结果分析：综合培养相同天数后细胞收获量和所需成本考量，各生长因子最佳效应浓度最终确定为：

hFGF的最佳浓度为10ng/ml，

hEGF的最佳浓度为10μg/ml，

hI的最佳浓度为10μg/ml，

hLIF的最佳效应浓度为1ng/ml，

APS的最佳效应浓度为0.1mg/ml。

(二)脐带间充质细胞在培养基中传代培养及扩增能力的比较分析

1.把经常规法分离所得并液氮保存的脐带间充质干细胞冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动(2min内溶解)，同时预热上述培养基。

2.把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫。然后250G转速离心5分钟。

3.弃上清液，分别加2mL预热的上述培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布。

4.标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37℃、5％CO₂培养箱中。

5.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞。培养皿中的细胞覆盖率达到80％～90％时按1∶3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为本发明培养基和普通干细胞培养基。显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况。图1A所示，培养于本发明无血清的脐带间充质干细胞培养基中的脐带间充质干细胞保持良好的贴壁特性，脐带间充质干细胞均呈现出梭形的成纤维状细胞形态。

6.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至80％融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×10⁴个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔板，每孔加入80μL的MTT溶液(5g/L)后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度值(OD值)，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，结果如图2所示，本发明生长培养基中的脐带间充质干细胞在54小时前能够生长至平台期。但对照生长培养基中的脐带间充质干细胞只能在66小时后才能够生长至平台期。由此可以看出，本发明的生长培养基能够有效地加速脐带间充质干细胞的生长速度。

(三)培养细胞的表面标记分析

取P2代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1∶1的0.05％胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为10⁶/ml的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。结果见表4。本发明所述无血清培养基和对照组培养基培养MSC流式细胞表型对比结果显示，本发明提供的无血清培养基和对照组培养基MSC阳性表达CD73、CD90、CD105，阴性表达CD14、CD19、CD34和CD45，没有统计学差异。

表5P2代细胞表面分子标记表达百分比

本方法中所述的DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

本方法中所述的DMEM是dulbecco'smodifiedeaglemedium的缩写，所以其特点主要包括以下：(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍；(3)含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；(4)含有微量的铁离子。

该DMEM培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养；如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

本方法中所述的DMEM培养基可以采用下述成分的DMEM培养基。

DMEM细胞培养基成份：

序号	化合物名称	含量(mg/L)	序号	化合物名称	含量(mg/L)
						1	无水氯化钙·2H₂O	265.00	18	L-丝氨酸	42.00
2	硝酸铁·9H₂O	0.10	19	L-苏氨酸	95.00
						3	氯化钾	400.00	20	L-色氨酸	16.00
4	无水硫酸镁	97.67	21	L-酪氨酸	72.00
						5	氯化钠	6400.00	22	L-缬氨酸	94.00
6	无水磷酸二氢钠	109.00	23	D-泛酸钙	4.00
						7	丁二酸	75.00	24	酒石酸胆碱	7.20
8	丁二酸钠	100.00	25	叶酸	4.00
						9	L-盐酸精氨酸	84.00	26	肌醇	7.20
10	L-盐酸胱氨酸	63.00	27	烟酰胺	4.00
						11	甘氨酸	30.00	28	核黄素	0.40
12	L-盐酸组氨酸	42.00	29	盐酸硫胺	4.00
						13	L-异亮氨酸	105.00	30	盐酸吡哆辛	4.00
14	L-亮氨酸	105.00	31	葡萄糖	1000.00
						15	L-盐酸赖氨酸	146.00	32	丙酮酸钠	110.00
16	L-甲硫氨酸	30.00	33	酚红	9.03
						17	L-苯丙氨酸	66.00

本方法中所述的细胞MTT测试：

MTT全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT主要有两个用途：

1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定；

2.细胞增殖及细胞活性测定。

MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(Zā)(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢(Zā)，用酶标仪在490nm波长处(英文说明书写的是570nm)测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

Claims

1.一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，其特征在于包括基础培养基和添加成份；其中，基础培养基为DMEM培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：1-20ng/mL；

表皮生长因子hEGF：1-20μg/mL；

胰岛素hI：1-20μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.1-5ng/mL;

L-谷氨酰胺：1-10mM；

2-巯基乙醇：50-200μM；

亚硒酸钠：20-50nM；

转铁蛋白：10-30μg/mL；

人白蛋白：10-100mg/mL；

纤连蛋白：50-200μg/mL；

黄芪多糖APS：50-200μg/mL。

2.一种如权利要求1所述的无血清的脐带间充质干细胞培养基，添加成份及其含量如下：

碱性成纤维生长因子hFGF：5-15ng/mL，优选10ng/mL；

表皮生长因子hEGF：5-15μg/mL，优选10μg/mL；

胰岛素hI：5-18μg/mL，优选10μg/mL；

白血病抑制因子hLIF：0.5-2.5ng/mL，优先1ng/mL;

L-谷氨酰胺：5-8mM，优选5mM；

2-巯基乙醇：80-150μM，优选100μM；

亚硒酸钠：25-40nM，优选30nM；

转铁蛋白：15-25μg/mL，优选25μg/mL；

人白蛋白：30-80mg/mL，优选50mg/mL；

纤连蛋白：80-150μg/mL，优选100μg/mL；

黄芪多糖APS：80-150μg/mL，优选100μg/mL。

3.一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，其特征在于该实验方法的步骤是：

（一）首先制备如权利要求1～2任一项的无血清的脐带间充质干细胞培养基；

（二）传代培养及扩增步骤：

b．把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有9mL培养基的15mL的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫，然后250倍重力的转速离心5分钟；

c．弃上清液，分别加2mL预热的的上述培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到T25的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d．标好细胞种类和日期、培养基种类等，放入37℃、5%CO₂培养箱中；

e.细胞贴壁后换培养基，保证去除死细胞；

培养皿中的细胞覆盖率达到80%～90%时按1:3的比例传代至细胞培养板中，传代使用的生长培养基为本发明培养基；显微镜下观察脐带间充质干细胞生长状况；拍照纪录；

f.传至第2代时，MTT法检测细胞活性绘制细胞生长曲线，具体操作：将生长至80％融合度的第2代脐带间充质干细胞酶解悬浮，调整细胞浓度至1×10⁴个/mL，加入24孔板，每孔800μL，置于37℃、饱和湿度、5％的CO₂培养箱中培养，每隔6小时取出一份24孔板，每孔加入80μL浓度为5g/L的MTT溶液后，37℃下放置4h，在每孔加入600μL的二甲基亚砜DMSO，用酶标仪在550nm处测定各孔吸光光度OD值，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线，纪录结果。

4.如权利要求3所述的一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，其特征在于该方法进一步包括步骤（三）培养细胞的表面标记分析的试验步骤：取P2代的细胞，去掉培养液，PBS洗涤2次，用1:1的0.05%质量浓度胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，用PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制成浓度为106/mL的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤1次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测，进行对比。