CN104962516A - 一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM培养液作为基础培养基，在DMEM培养液中加入有全营养组分：氨基酸、维生素、蛋白营养素、无机盐；调控组分：糖代谢激素、生长因子、抗氧化剂。本发明所公开的无血清培养基能够以较低的成本用于培养人间充质干细胞，为其提供全面的营养，并有效调控其成长，使得人间充质干细胞在培养过程中具有良好的活性，改善了间充质干细胞的培养过程，避免间充质干细胞培养过程中对动物血清的需求，降低动物蛋白的残留及动物来源病毒污染的可能性。

Description

一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基，属于生化领域。

背景技术

间充质干细胞由于具有良好的自我增殖能力和多向分化潜能，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力。已有的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达，因此可作为组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，在造血干细胞移植和器官移植中也具有广泛的应用前景。

由于存在上述需要，如何大规模的培养和繁殖间充质干细胞是本领域目前关注的热点问题之一。常规的技术方案是在实验室条件下，向培养基中添加胎牛血清使其得到有效培养。这样的培养方式会影响细胞增殖效率及生物学性能，而且存在动物血清质量不佳导致的病毒污染风险，造成细胞制品的异种蛋白污染。

针对以上问题，本领域提出的一种解决方案是在将人间充质干细胞培养到最后1～2代时，将含胎牛血清培养基替换成无血清培养基，但残留的异种蛋白污染始终存在，无法彻底去除；另一种解决方案是全程培养采用无血清培养基，这就要无血清培养基中具有足够的营养物质以维持细胞的良好生长，导致高品质的人间充质干细胞无血清培养基的成本极高，同时一旦营养成分配比设计不合理就会使得干细胞培养失控，使得其难以大规模产业化应用，也难以调控人间充质干细胞制品的品质。

发明内容

针对现有技术的存在的问题，申请人对人间充质干细胞的培养问题进行了深入研究，从而发明了一种无血清培养基，通过改进其中的各组分用量和类型，为人间充质干细胞的生长培养提供充足的营养，同时保证其良好的品质。

具体的说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM培养液作为基础培养基，在DMEM培养液中加入有全营养组分：氨基酸、维生素、蛋白营养素、无机盐；调控组分：糖代谢激素、生长因子、抗氧化剂，各成分的用量为在1ml的DMEM培养液中，糖类代谢激素10-20μg、氨基酸120-250μg、生长因子200-500ng、维生素40-100ng、蛋白营养素500-1200ng、抗氧化剂100-180μg、无机盐8-35mg。

通过上述组成，利用全营养组分保证人间充质干细胞的良好成长和繁殖，提供其培养所需各种元素；同时，所添加的调控组分能够对培养的人间充质干细胞增殖速度进行调整，防止过度增长影响所得人间充质干细胞制品的品质。

其中，所用的氨基酸包含细胞生长所需的氨基酸至少包含一种或几种必需氨基酸，和一种或几种半必需氨基酸，以便为其具有良好的活性，且使干细胞在营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化。优选所用氨基酸的组成为必需氨基酸包括苏氨12-15μg、亮氨酸24-30μg、异亮氨酸18-22μg、赖氨酸9-14μg、蛋氨酸30-40μg；半必需氨基酸包括甘氨酸8-14μg、精氨酸9-16μg、丝氨酸30-35μg、酪氨酸28-35μg。

其中，所用的维生素在所给定的浓度范围内能够提高干细胞的增殖能力，与生长因子中间产生协同作用增加生长因子对干细胞的增殖效应。其中，所用维生素优选如下：叶酸20-55ng、d-泛酸钙17-23ng、氯化胆碱3-10ng、维生素B123-10ng、肌醇1-5ng。

其中，所用的蛋白营养素能够保持干细胞增殖过程中的活力，优选其组成如下：重组人转铁蛋白15-40ng、腐胺20-25ng、重组人血清白蛋白500-1100ng。

其中，所用的无机盐为干细胞增殖生长提供基本的生存环境，所用无机盐提供干细胞保持其活性所需的离子环境。优选的，所述无机盐包括氯化钙33-40μg、氯化钾70-300μg、氯化钠10-30mg、柠檬酸铁0.8-1μg。在该用量下，提供较为理想的pH环境。

在本发明中，为了实现人间充质干细胞的生长增殖最优化，使用了多种调节成分对其进行微调。下面就各调节成分的作用进行详细说明。

其中，所用的糖类代谢激素以胰岛素为主要成分，辅之以胰岛素反调节激素，胰岛素的用量为12-15μg，胰岛素反调节激素的用量为50-600ng。

在上述中，使用胰岛素能够促进干细胞的生长，刺激干细胞生长过程中的增殖；使用胰岛素反调节激素用来抑制胰岛素的副作用(胰岛素的使用会略微促进干细胞凋亡)。

其中，所用的胰岛素反调节激素可以采用常见的类型，包括但不限于生长激素、皮质醇。

在本发明中，所用的生长因子用来促进干细胞贴壁，促进其增殖纯化。优选的，生长因子包括内皮细胞生长因子80-260ng、成纤维细胞生长因子100-150ng、肝细胞生长因子40-75ng。

在本发明中，所用抗氧化剂能有效抑制干细胞增殖过程中的凋亡现象。优选的，抗氧化剂包括谷胱甘肽90-130μg、维生素C 10-13μg、维生素E 10-15μg。

在本发明的无血清培养基中，为了防止pH环境设置不当对干细胞增殖的影响，本发明的血清培养基中还加入有pH指示剂，其用量为0.1-0.5mg。

通过添加pH指示剂，能够确认培养基溶液的酸碱性。由于合理的生长环境要求偏中性，因此上述pH指示剂优选为酚红。

在上述技术方案的基础上，本发明还公开了一种用于培养人间充质干细胞的无血清悬浮培养基，能够使细胞保持悬浮状态并良好生长，消除贴壁生长的机械应力影响，使人间充质干细胞制剂能够获得更好的活性。为实现上述目的，是在前述无血清培养基中加入表面活性剂和/或微载体作为悬浮载体，悬浮载体的用量为0.5-5mg。

为了最佳化匹配本发明培养基的组成，上述所用的表面活性剂优选聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、微载体优选Cytodex^TM。添加上述表面活性剂或微载体的培养基能够在3D立体空间内培养细胞，使细胞生长环境更符合其在生物体内生理状态下的环境。

申请人进行的实验显示，本发明的无血清培养基通过合理添加营养物质，并复之以调节组分，在低成本的前提下得到了培养效果极为接近胎牛血清培养基的无血清培养基，使用该培养基能够在间充质干细胞传代至2代时即可换用无血清培养，传代至4到6代所得的干细胞制剂无任何胎牛血清残留。

附图说明

图1为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞至5代的干细胞分布形态示意图；

图2为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞至5代的干细胞分布图中非均匀区域所占面积分布；

图3为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞2-6代培养中细胞倍增时间DPT变化趋势图；

图4为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞早期和晚期的细胞活性变化图。

具体实施方式

在下述实施例中，申请人提供了本发明培养基应用于人间充质干细胞增殖的若干具体实现及其效果。如下所提供的实施仅是示意性的，并不对本发明构成特别限定。本领域技术人员在理解和掌握本发明实质精神的基础上对各成分类型和用量进行的合理调整依旧属于本发明的保护范围。

实施例1

在本实施中，提供了本发明无血清培养基的若干具体实现，并初步以人骨髓间充质干细胞BM-MSC研究其在各种组合条件下的干细胞生长增殖情况。

组成1：在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素50ng、皮质醇20ng、胰岛素12μg、甘氨酸8μg、精氨酸9μg、苏氨酸12μg、丝氨酸30μg、亮氨酸25μg、异亮氨酸18μg、L-赖氨酸9μg、蛋氨酸30μg、L-酪氨酸28μg、内皮细胞生长因子100ng、成纤维细胞生长因子100ng、肝细胞生长因子40ng、叶酸30ng、d-泛酸钙17ng、氯化胆碱3ng、维生素B12 3ng、肌醇1ng、重组人转铁蛋白15ng、腐胺20ng、重组人血清白蛋白500ng、谷胱甘肽95μg、维生素C 10μg、维生素E 10μg、氯化钙35μg、氯化钾70μg、氯化钠10mg、柠檬酸铁0.8μg。

组成2：在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素200ng、皮质醇25ng、胰岛素14μg、甘氨酸12μg、精氨酸12μg、苏氨酸12μg、丝氨酸35μg、亮氨酸27μg、异亮氨酸20μg、L-赖氨酸10μg、蛋氨酸35μg、L-酪氨酸30μg、内皮细胞生长因子200ng、成纤维细胞生长因子120ng、肝细胞生长因子60ng、叶酸40ng、d-泛酸钙20ng、氯化胆碱5ng、维生素B12 5ng、肌醇3ng、重组人转铁蛋白30ng、腐胺20ng、重组人血清白蛋白700ng、谷胱甘肽100μg、维生素C 10μg、维生素E 12μg、氯化钙36μg、氯化钾200μg、氯化钠20mg、柠檬酸铁1μg。

组成3：在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素500ng、皮质醇25ng、胰岛素15μg、甘氨酸14μg、精氨酸16μg、苏氨酸15μg、丝氨酸35μg、亮氨酸30μg、异亮氨酸22μg、L-赖氨酸14μg、蛋氨酸40μg、L-酪氨酸35μg、内皮细胞生长因子250ng、成纤维细胞生长因子150ng、肝细胞生长因子75ng、叶酸55ng、d-泛酸钙23ng、氯化胆碱10ng、维生素B12 10ng、肌醇5ng、重组人转铁蛋白40ng、腐胺25ng、重组人血清白蛋白1000ng、谷胱甘肽130μg、维生素C 12μg、维生素E 15μg、氯化钙40μg、氯化钾300μg、氯化钠30mg、柠檬酸铁1μg。

上述的无血清培养基通过如下方式使用：人骨髓间充质干细胞初代在牛血清DMEM培养液中贴壁培养，用本发明的无血清培养进行继代培养，传代至5代(共计培养18天，每三天更换一次培养基)，检测培养基组成和干细胞增殖情况，如表1所示。

表1：传代5代的BM-MSC增殖情况

由上述可见，本发明所得培养人间充质干细胞的无血清培养基可用于稳定、高效的增殖培养人间充质干细胞，所得人间充质干细胞无污染，品质好。

在上述实验过程中，作为对比，以同样的方式申请人使用了含有牛血清的培养基对上述干细胞进行全程的增殖传代，发现其尽管具有更好的增殖效率(DPT更短)，但其所得干细胞传代产物存在显著的牛血清污染，在进行观察时需要对其进行特定的红色染料染色才能较好的对增殖产物进行统计和观察。以同样质量的培养基质量而论，牛血清培养基的商品成本大约为本发明无血清培养基的5-7倍。

在上述实验设计过程中，申请人也曾对本领域近期出现的无血清培养基的性能进行了监测，例如CN103805562A公开的无血清培养基，用于增殖人间充质干细胞尽管具有较好的效率，但是所得干细胞品质较差，镜下可观察到较为明显的干细胞聚集混浊情况，显示出该技术方案在设计时为对干细胞增殖效率进行有效的调控。

实施例2

以上述组成2的无血清培养基为例，分别对脂肪来源的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞以细胞培养基(含DMEM、10v/v％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺)进行贴壁培养，然后以本发明的无血清培养基进行传代培养，观察不同培养体系获得的细胞形态，并检测其活性。

如图1所示，分别显示了脂肪来源的间充质干细胞a、骨髓间充质干细胞b传代过程中每代的细胞形态变化，显示了本发明无血清培养基传代培养品质好、分布较为均匀。

参考图2所示，表示的干细胞增殖形态图像中粗糙结构区域(即传代干细胞无序增殖和聚集)在整体中的面积分数，该结果显示本发明的无血清培养增殖干细胞粗糙结构区域远低于1％，显示出本发明传代培养增殖干细胞品质非常理想。

参考图3所示，显示了采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞培养中细胞倍增时间DPT变化趋势，上述变化趋势显示采用本发明的培养基具有良好的增殖效率。

参考图4所示，显示了早期1-2代脂肪来源的间充质干细胞a、骨髓间充质干细胞b传代到5-6代后的活性变化，通过流式细胞仪分析早期和晚期的活性变化，细胞活性基本无降低。

实施例3

一种用于培养人间充质干细胞的无血清悬浮培养基，组成如下：在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素200ng、皮质醇25ng、胰岛素14μg、甘氨酸12μg、精氨酸12μg、苏氨酸12μg、丝氨酸35μg、亮氨酸27μg、异亮氨酸20μg、L-赖氨酸10μg、蛋氨酸35μg、L-酪氨酸30μg、内皮细胞生长因子200ng、成纤维细胞生长因子120ng、肝细胞生长因子60ng、叶酸40ng、d-泛酸钙20ng、氯化胆碱5ng、维生素B12 5ng、肌醇3ng、重组人转铁蛋白30ng、腐胺20ng、重组人血清白蛋白700ng、谷胱甘肽100μg、维生素C 10μg、维生素E 12μg、氯化钙36μg、氯化钾200μg、氯化钠20mg、柠檬酸铁1μg、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物1mg。

实施例4

一种用于培养人间充质干细胞的无血清悬浮培养基，组成如下：在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素300ng、皮质醇25ng、胰岛素12μg、甘氨酸12μg、精氨酸15μg、苏氨酸12μg、丝氨酸30μg、亮氨酸30μg、异亮氨酸20μg、L-赖氨酸9μg、蛋氨酸40μg、L-酪氨酸30μg、内皮细胞生长因子100ng、成纤维细胞生长因子100ng、肝细胞生长因子40ng、叶酸50ng、d-泛酸钙20ng、氯化胆碱5ng、维生素B12 10ng、肌醇2ng、重组人转铁蛋白40ng、腐胺20ng、重组人血清白蛋白1000ng、谷胱甘肽100μg、维生素C 10μg、维生素E 10μg、氯化钙40μg、氯化钾200μg、氯化钠20mg、柠檬酸铁1μg、Cytodex^TM2.5mg。

基于同样的实验方法，对实施例3、4公开的无血清悬浮培养基培养增殖人间充质干细胞进行了研究，发现在不降低细胞增殖品质的情况下，可以显著改善细胞倍增时间DPT，改善细胞的增殖效率，改善的程度平均在40％的水平。

Claims (10)

1.一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于以DMEM培养液作为基础培养基，在DMEM培养液中加入有全营养组分：氨基酸、维生素、蛋白营养素、无机盐；调控组分：糖代谢激素、生长因子、抗氧化剂，各成分的用量为在1ml的DMEM培养液中，糖类代谢激素10-20μg、氨基酸120-250μg、生长因子200-500ng、维生素40-100ng、蛋白营养素500-1200ng、抗氧化剂100-180μg、无机盐8-35mg。

2.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于糖类代谢激素以胰岛素为主要成分，辅之以胰岛素反调节激素，胰岛素的用量为12-15μg，胰岛素反调节激素的用量为50-600ng。

3.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于氨基酸至少包含一种或几种必需氨基酸，和一种或几种半必需氨基酸；必需氨基酸包括苏氨12-15μg、亮氨酸24-30μg、异亮氨酸18-22μg、赖氨酸9-14μg、蛋氨酸30-40μg；半必需氨基酸包括甘氨酸8-14μg、精氨酸9-16μg、丝氨酸30-35μg、酪氨酸28-35μg。

4.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于生长因子包括内皮细胞生长因子80-260ng、成纤维细胞生长因子100-150ng、肝细胞生长因子40-75ng。

5.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于维生素包括叶酸20-55ng、d-泛酸钙17-23ng、氯化胆碱3-10ng、维生素B12 3-10ng、肌醇1-5ng。

6.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于蛋白营养素包括重组人转铁蛋白15-40ng、腐胺20-25ng、重组人血清白蛋白500-1100ng。

7.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于抗氧化剂包括谷胱甘肽90-130μg、维生素C 10-13μg、维生素E 10-15μg。

8.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于无机盐包括氯化钙33-40μg、氯化钾70-300μg、氯化钠10-30mg、柠檬酸铁0.8-1μg。

9.根据权利要求1的无血清培养基，其特征在于还加入有pH指示剂，其用量为0.1-0.5mg。

10.一种用于培养人间充质干细胞的无血清悬浮培养基，其特征在于在权利要求1的无血清培养基中加入表面活性剂和/或微载体作为悬浮载体，悬浮载体的用量为0.5-5mg。