CN105441376A

CN105441376A - 一种用于培养病毒的无血清培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN105441376A
Application number: CN201510965947.0A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 徐家华; 张文炎; 何芳; 唐兆新; 高艳
Original assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2035-12-22
Also published as: CN105441376B

Abstract

本发明涉及一种用于培养病毒的无血清培养基，该培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80-90%培养液、4-10%氨基酸、3-10%血清替代因子和0.05-0.5%抗氧化剂。本发明还提供该培养基的制备方法：分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。本发明用于培养病毒的无血清培养基，便于病毒繁殖结束后的病毒液的纯化，降低了疫苗生产成本；此外制备方法简单、易操作。

Description

一种用于培养病毒的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种用于培养病毒的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

二十世纪以来，细胞培养技术已成为工业化生产生物活性物质、疫苗、载体，如单克隆抗体、药用蛋白质、基因工程药物等常用的手段，细胞培养技术与基因工程技术、酶工程技术和发酵工程技术密切相关，在整个生物技术产业的发展中起到了关键的核心作用。此外细胞培养技术的日臻完善，促进蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。从当前发展趋势来看，细胞悬浮培养、无血清培养是近年来生物技术产业化发展的方向。

目前，许多兽用疫苗都通过细胞培养来进行生产，在生产过程往往需要使用血清，而血清的存在增加了细胞表达产物安全性的不确定因素，具有可能导致过敏反应、批次间差异大、易受污染和成本较高等缺点。此外，血清中成分较为复杂，多含有分子量较大的组分，影响病毒的分离纯化，且容易被支原体感染，这一现实问题已经成为动物细胞无血清培养技术研究和应用发展动力。随着无血清培养技术的不断进步为动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足病毒的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是利用病毒生产疫苗重要条件。目前已有一些市售细胞培养的无血清培养基，但是现有市售无血清培养基存在细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。

中国专利申请号为201410467191.2的发明专利申请文件，无血清培养基及其用途和一种猪病毒的培养方法，该无血清培养基以MEM为基础培养基，添加的氨基酸及其他组分多达45种，组分非常复杂。

因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种便于病毒繁殖、质量可控、安全可靠用于培养病毒的无血清培养基及其制备方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于培养病毒（本发明中的培养病毒是指将病毒接种到宿主细胞后，移种到培养基中，病毒在宿主细胞中进行繁殖，最后使宿主细胞裂解的过程）的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80-90%培养液、4-10%氨基酸、3-10%血清替代因子和0.05-0.5%抗氧化剂；

所述培养液选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1）、HB培养基、BEM培养基中的一种；

所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1-2g、色氨酸1.5-2g、苯异亮氨酸0.5-1g、缬氨酸0.5-2g、苏氨酸1-1.5g、亮氨酸0.5-1g、甘氨酸0-1g、异亮氨酸0-1.5g、丝氨酸0.5-1g、天冬氨酸0.5-1.5g、精氨酸0.5-1g和谷氨酰胺0-1.5g；

所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白和贴壁因子一种或几种；

所述抗氧化剂为抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E、类胡萝卜素、尿酸、枸橼酸、EDTA、泛醌和多酚类抗氧化剂中的一种或几种。

进一步地，所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮质醇和甲状腺激素中的一种或几种；

所述结合蛋白为转铁蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金属蛋白和色蛋白中的一种或几种；

所述贴壁因子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一种或几种。

进一步地，所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白、贴壁因子和微量元素的混合物。

进一步地，所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白和贴壁因子以(0.2-1):(0-1):(0.2-1)

配比混合所得的混合物。

优选地，一种用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：90%培养液、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化剂；

所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1g、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸0.5g、缬氨酸0.5g、苏氨酸1g、亮氨酸1g、甘氨酸1g、异亮氨酸0.5g、丝氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g、精氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g；

所述生长因子为：皮质醇；

所述结合蛋白为：转铁蛋白；

所述贴壁因子为：鱼精蛋白；

所述血清替代因子为皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以0.8:1:1配比混合所得的混合物；

所述抗氧化剂为谷胱甘肽和枸橼酸以1:1配比组成的混合物。

相应地，本发明还提供该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤为：分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。

此外，本发明还提供用于培养病毒的无血清培养基在病毒培养中的用途。

与现有的技术相比，本发明具有以下技术优势：

本发明用于培养病毒的无血清培养基，通过加入氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，与培养液混合，所制得的培养基不存在由于血清的存在增加细胞表达产物不确定的因素，且减少了去除血清中含有分子量较大的物质纯化步骤，降低后续疫苗纯化后的难度。病毒繁殖结束后，通过离心去除宿主细胞碎片，然后进行简单的超滤即可将去除外源性的小分子蛋白及其他物质，节约了操作步骤、简化了疫苗纯化的工艺，降低了生产成本；同时，在培养液中加入抗氧化剂对细胞生长也具有促进作用，主要用于抑制培养过程中活性氧对细胞的损伤，从而增加病毒产率。本发明提供的培养基制备方法操作简单、便于实现大规模生产的需要。

具体实施方式

实施例1

一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：90%DMEM-F12培养基（1:1）、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化剂；

所述抗氧化剂为谷胱甘肽和枸橼酸以1:1配比组成的混合物。

该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其步骤为：分别取配方量的DMEM-F12培养基、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。

实施例2

一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：85%DMEM培养基、8%氨基酸、8%血清替代因子和0.1%抗氧化剂；

所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1g、色氨酸2g、苯异亮氨酸0.8g、缬氨酸1g、苏氨酸1g、亮氨酸1g、甘氨酸0.5g、异亮氨酸0.5g、丝氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g、精氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g；

所述血清替代因子为甲状腺激素、转铁蛋白和聚赖氨酸以0.6:0.8:1配比混合所得的混合物；

所述抗氧化剂为类胡萝卜素。

该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其步骤为：分别取配方量的DMEM培养基、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。

实施例3

一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80%HB培养基、6%氨基酸、5%血清替代因子和0.08%抗氧化剂；

所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1.5g、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸0.8g、缬氨酸1g、苏氨酸1.2g、亮氨酸0.8g、甘氨酸0.5g、异亮氨酸1g、丝氨酸0.8g、天冬氨酸0.8g、精氨酸0.8g和谷氨酰胺1g；

所述血清替代因子为胰岛素、磷蛋白和糖蛋白以0.5:0.8:0.5配比混合所得的混合物；

所述抗氧化剂为抗坏血酸。

该用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其步骤为：分别取配方量的HB培养基、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。

实施例4

一种用于培养病毒的无血清培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：90%HB培养基、6%氨基酸、6%血清替代因子和0.2%抗氧化剂；

所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1g、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸1g、缬氨酸0.5g、苏氨酸1g、亮氨酸0.5g、甘氨酸0.5g、异亮氨酸1.5g、丝氨酸0.5g、天冬氨酸1g、精氨酸0.5g和谷氨酰胺1g；

所述血清替代因子为胰岛素、转铁蛋白和皮质醇以0.6:0.8:0.5配比混合所得的混合物；

所述抗氧化剂为谷胱甘肽。

试验例1不同培养基对MDCK细胞生长的影响

1、实验方法：在25ml方瓶中，分别用实施例1-4制得的无血清培养基培养MDCK细胞，并以市售Invitrogen公司的无血清培养基VP-SFM(货号11681020)作为对照，以细胞比生长速率为指标，观察不同培养基中MDCK细胞贴壁情况以及对细胞生长的影响，采用台盼蓝染色计数，并以公式：细胞活性(%)=活细胞数/细胞总数×100%，计算细胞活性。

2、实验结果：见表1。

在方瓶中，用实施例1-4无血清培养基培养的MDCK细胞，极少数呈悬浮状态，大部分贴壁良好，与市售VP-SFM培养的MDCK细胞生长情况大致相同。由表1可知，用实施例1-4无血清培养基培养的MDCK细胞，在培养72h后细胞密度达到最高，96h后细胞开始凋亡，72h实施例1-4培养的细胞活性均在95.0%以上，比生长率达到0.45以上，要比市售VP-SFM培养的细胞活性和比生长率好，其中以实施例1制得的培养基效果较佳。

表1转瓶中不同培养基对MDCK细胞生长的影响

试验例2不同培养基培养MDCK细胞生产H7N9禽流感病毒的比较

1、实验方法：在96孔板上使用本发明实施例1-4制得的培养基和市售VP-SFM培养基培养MDCK细胞，每孔接种50μLH7N9禽流感病毒，密封后将培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，每隔24h测定细胞上清液中病毒的HA滴度。

2、实验结果：见表2。

由表2可知，H7N9病毒接种在不同的培养基中，在接种72-120h，均以实施例1制得的培养基上清的HA滴度最高，为6.0-6.4，本发明实施例1-4制得的培养基上清的HA滴度均高于市售VP-SFM培养基上清的HA滴度。其中滴度增加最快的时间段为72h，在72h之后滴度产生较为缓慢。

表2H7N9病毒接种在MDCK细胞后不同培养基培养液上清的HA滴度（log₂）

由于已经通过以上较佳实施例描述了本发明，在本发明的精神和/或范围内，任何针对本发明的替换/或组合来实施本发明，对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且包含在本发明之中。

Claims

1.一种用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80-90%培养液、4-10%氨基酸、3-10%血清替代因子和0.05-0.5%抗氧化剂。

2.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述培养液选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1）、HB培养基、BEM培养基中的一种。

3.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸由以下重量的组分组成：赖氨酸1-2g、色氨酸1.5-2g、苯异亮氨酸0.5-1g、缬氨酸0.5-2g、苏氨酸1-1.5g、亮氨酸0.5-1g、甘氨酸0-1g、异亮氨酸0-1.5g、丝氨酸0.5-1g、天冬氨酸0.5-1.5g、精氨酸0.5-1g和谷氨酰胺0-1.5g；

所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白和贴壁因子中的一种或几种；

4.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：90%培养液、5%氨基酸、5%血清替代因子和0.1%抗氧化剂；

所述血清替代因子为生长因子、结合蛋白、贴壁因子和微量元素的混合物。

5.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述血清替代因子

为生长因子、结合蛋白和贴壁因子以(0.2-1):(0-1):(0.2-1)配比混合所得的混合物。

6.如权利要求1-5任一所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，

所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮质醇和甲状腺激素中的一种或几种；

7.如权利要求5所述的用于培养病毒的无血清培养基，其特征在于，所述血清替代因

子为皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以0.8:1:1配比混合所得的混合物。

8.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤为：分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。

9.如权利要求1-8任一所述的用于培养病毒的无血清培养基在培养病毒中的用途。