CN105441378A

CN105441378A - 一种培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方法

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Publication number: CN105441378A
Application number: CN201510965938.1A
Authority: CN
Inventors: 陈瑞爱; 徐家华; 唐兆新; 张文炎; 高艳
Original assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明涉及一种培养Vero细胞用的无血清培养基，该培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化剂溶液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%。本发明还提供该培养基的制备方法：分别取配方量的基础培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得。本发明培养Vero细胞用的无血清培养基，能够促进Vero细胞的快速贴壁，培养的Vero细胞能够保持较好的细胞形态，具有更好的细胞增殖速率，且本发明无血清培养基组分简单，降低了成本，制备容易。

Description

一种培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

自1995年WHO呼吁采用细胞为基质生产疫苗，细胞培养在疫苗生产过程中发挥的作用越来越受人们的重视。而过去，在使用血清培养细胞的过程中，增加了细胞表达产物安全性的不确定因素，并且采用含血清的培养基进行细胞的培养，可能由于血清的存在导致过敏反应发生、批次间差异大、易受污染和成本较高等缺点，这一现实问题已经成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动力。随着无血清培养技术的不断进步，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

Vero细胞是WHO允许用于疫苗生产的细胞株，它对多种病毒敏感，是现阶段病毒疫苗生产的最主要的细胞基质。Vero细胞无血清培养技术提高了病毒疫苗生产工艺的可靠性、产品质量的可控性和安全性。目前，Vero细胞无血清培养已在包括狂犬病疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、流感疫苗、肾综合征出血热疫苗、甲型肝炎疫苗、呼肠病毒疫苗等的研发和生产中得到应用。

无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售的无血清培养基，如Sigma公司的EX-CELLMDCK和GIBCD公司的VP-SFM，但是现有市售无血清培养基存在细胞贴壁性差、细胞增殖不够理想、价格昂贵、成分不明等缺陷。

中国专利申请号为200710187466.7的专利，公开了一种用于Vero细胞的培养基及其培养方法，该培养基以SFM为基础培养基，添加的细胞因子及其他组分50多种，组分非常复杂。

因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种质量可控、安全可靠、成分简单的培养Vero细胞用的无血清培养基及其制备方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化剂溶液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%；

所述基础培养液选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM-F12培养基（1:1）、HB培养基、BEM培养基中的一种；

所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成：赖氨酸0.5-1g、色氨酸0.5-1.5g、苯异亮氨酸0.5-1g、缬氨酸0.5-1g、亮氨酸0.5-1.5g、甘氨酸0-1g、异亮氨酸0.5-1.5g、苏氨酸0-1g、丝氨酸0.5-1g、精氨酸0.5-1g、天冬氨酸0-1g和谷氨酰胺0.5-1g；

所述血清替代因子溶液中溶剂为基础培养液，溶质为生长因子、结合蛋白和贴壁因子中的一种或几种组合；

所述抗氧化剂溶液中溶剂为基础培养液，溶质为抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E、类胡萝卜素、尿酸、枸橼酸、EDTA、泛醌和多酚类抗氧化剂中的一种；

所述酵母抽提物溶液溶剂为PBS，溶质为酵母提取物；

所述乙醇胺溶液溶剂为PBS，溶质为乙醇胺。

进一步地，所述抗氧化剂溶液的浓度为0.5-2mg/L；

所述酵母抽提物溶液的浓度为4-10mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为0.5-2mL/L。

进一步地，所述血清替代因子的溶质由生长因子、结合蛋白和贴壁因子以配比为(0.2-1):(0-1):(0.4-1)混合所得的混合物。

进一步地，所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮质醇和甲状腺激素中的一种或几种组合；

所述结合蛋白为转铁蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金属蛋白和色蛋白中的一种或几种组合；

所述贴壁因子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一种或几种组合。

优选地，一种培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇胺溶液0.1%；

所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成：赖氨酸0.5g、色氨酸1g、苯异亮氨酸0.5g、缬氨酸1g、亮氨酸1g、甘氨酸0.5g、异亮氨酸1g、苏氨酸0.5g、丝氨酸0.5g、精氨酸1g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g；

所述血清替代因子的溶质由皮质醇、转铁蛋白和鱼精蛋白以配比为0.5:0.5:0.8混合所得的混合物；

所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为谷胱甘肽，浓度为1mg/L；

所述酵母抽提物溶液的溶剂为PBS，溶质为酵母抽提物，浓度为6mg/L；

所述乙醇胺溶液的的溶剂为PBS，溶质为乙醇胺，浓度为0.5mL/L。

相应地，本发明还提供该培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤为：分别取配方量的基础培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得；

所述氨基酸溶液由如下方法制成：取配方量的赖氨酸、色氨酸、苯异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的基础培养液，即得；

所述血清替代因子溶液由如下方法制成：取配方量的由生长因子、结合蛋白和贴壁因子，溶解于配方量的基础培养液，即得：

所述抗氧化剂溶液由如下方法制成：取抗氧化剂，溶解于基础培养液，配成浓度为0.5-2mg/L的溶液，即得：

所述酵母抽提物溶液由如下方法制成：取酵母抽提物，溶解于PBS，配成浓度为4-10mg/L的溶液，即得；

所述乙醇胺溶液由如下方法制成：取乙醇胺，溶解于PBS，配成浓度为0.5-2mL/L的溶液，即得。

此外，本发明还提供该培养Vero细胞用的无血清培养基在Vero细胞培养中的用途。

与现有的技术相比，本发明具有以下技术优势：

本发明提供了一种培养Vero细胞用的无血清培养基，与市售的无血清培养基相比，本发明提供的培养基能够促进Vero细胞的快速贴壁，培养的Vero细胞能够保持较好的细胞形态，具有更好的细胞增殖速率，且本发明无血清培养基组分简单，降低了成本。此外，本发明提供的制备方法简单，制得的无血清培养基用于Vero细胞的培养，培养获得的细胞表现出优异的细胞性能。

具体实施方式

本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1

一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇胺溶液0.1%；

所述酵母抽提物溶液的浓度为6mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为0.5mL/L。

该培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其步骤为：分别取配方量的基础培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得；

其中氨基酸溶液制备方法为：取配方量的赖氨酸、色氨酸、苯异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的基础培养液，即得；

血清替代因子溶液制备方法为：取配方量的由生长因子、结合蛋白和贴壁因子，溶解于配方量的基础培养液，即得：

抗氧化剂溶液制备方法为：取谷胱甘肽，溶解于基础培养液，配成浓度为1mg/L的溶液，即得：

酵母抽提物溶液制备方法为：取酵母抽提物，溶解于PBS，配成浓度为6mg/L的溶液，即得；

乙醇胺溶液制备方法为：取乙醇胺，溶解于PBS，配成浓度为0.5mL/L的溶液，即得。

实施例2

一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液92%、氨基酸溶液2%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.2%、酵母抽提物溶液0.7%、乙醇胺溶液0.1%；

所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成：赖氨酸1g、色氨酸0.5g、苯异亮氨酸1g、缬氨酸0.5g、亮氨酸0.5g、甘氨酸1g、异亮氨酸1g、苏氨酸0.5g、丝氨酸1g、精氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺0.5g；

所述血清替代因子的溶质由胰岛素、色蛋白和聚赖氨酸以配比为0.4:0.2:0.6混合所得的混合物；

所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为类胡萝卜素，浓度为0.5mg/L；

所述酵母抽提物溶液的浓度为8mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为0.8mL/L。

制备方法参考实施例1。

实施例3

一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液92%、氨基酸溶液3%、血清替代因子溶液4%、抗氧化剂溶液0.2%、酵母抽提物溶液0.6%、乙醇胺溶液0.2%；

所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成：赖氨酸0.5g、色氨酸1g、苯异亮氨酸1g、缬氨酸1g、亮氨酸1g、甘氨酸0.5g、异亮氨酸1g、苏氨酸0.5g、丝氨酸1g、精氨酸1g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺1g；

所述血清替代因子的溶质由表皮生长因子、磷蛋白和脂蛋白以配比为0.6:0.4:0.8混合所得的混合物；

所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为枸橼酸，浓度为0.8mg/L；

所述酵母抽提物溶液的浓度为10mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为0.5mL/L。

制备方法参考实施例1。

实施例4

一种培养Vero细胞用的无血清培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液88%、氨基酸溶液5%、血清替代因子溶液6%、抗氧化剂溶液0.3%、酵母抽提物溶液0.6%、乙醇胺溶液0.1%；

所述氨基酸溶液中的溶剂为基础培养液，溶质由以下重量的成分组成：赖氨酸0.5g、色氨酸1.5g、苯异亮氨酸0.5g、缬氨酸1g、亮氨酸1.5g、甘氨酸1g、异亮氨酸1.5g、苏氨酸0.5g、丝氨酸1g、精氨酸0.5g、天冬氨酸0.5g和谷氨酰胺1g；

所述血清替代因子的溶质由成纤维生长因子、磷蛋白和聚赖氨酸以配比为0.4:0.2:0.6混合所得的混合物；

所述抗氧化剂溶液的溶剂为基础培养液，溶质为枸橼酸，浓度为1mg/L；

所述酵母抽提物溶液的浓度为10mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为1mL/L。

制备方法参考实施例1。

试验例1不同培养基对Vero细胞生长的影响

1、实验方法：在工作体积为250ml的转瓶中，分别用实施例1-4制得的无血清培养基培养Vero细胞，并以市售Invitrogen公司的无血清培养基VP-SFM(货号11681020)作为对照，、以相同的密度接种，并加入经PBS洗涤的Cytodex3微载体，培养条件：37℃，5%CO₂，转速40r/min。观察不同培养基对细胞生长的影响。采用结晶紫方法计数。

2、实验结果：见表1和表2。

在转瓶中，采用实施例1-4无血清培养基培养的Vero细胞与市售VP-SFM培养的Vero细胞生长情况大致相同，细胞先经过一个短暂的延迟期（0-12h），再进入对数生长期。由表1可知，用实施例1-4无血清培养基培养的Vero细胞，在培养72h后细胞密度达到最高，96h后细胞开始凋亡，实施例1-4培养基培养的Vero细胞最高密度平均为14.95×10⁵个/ml，要高于市售VP-SFM培养基培养的Vero细胞最高密度12.8×10⁵个/ml。由表2可知，实施例1-4无血清培养基培养的Vero细胞在24-72h的平均比生长速率分别为：0.64d^-1、0.59d^-1、0.58d^-1和0.57d^-1，均大于市售VP-SFM培养基培养的Vero细胞在24-72h的平均比生长速率0.47d^-1。以上结果表明，实施例1-4培养基培养Vero细胞的活性要比市售的VP-SFM培养基效果要好，其中以实施例1制得的培养基效果较佳。

表1转瓶中不同培养基对Vero细胞生长密度的影响

表2转瓶中不同培养基对Vero细胞比生长速率的影响

试验例2不同培养基培养Vero细胞生产狂犬病病毒的比较

1、实验方法：在96孔板上使用本发明实施例1-4制得的培养基和市售VP-SFM培养基培养Vero细胞，每孔接种60μL狂犬病病毒，密封后将培养板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养，每隔24h测定细胞上清液中的病毒滴度。

2、实验结果：见表3。

由表3可知，狂犬病病毒接种在不同的培养基中，在接种72-120h，均以实施例1培养基上清的病毒滴度最高，在72-120h平均病毒滴度为9.1log₂，而实施例2-4培养基上清在72-120h平均病毒滴度分别为8.9log₂、8.7log₂和8.6log₂，本发明实施例1-4培养基上清在72-120h平均病毒滴度均高于市售VP-SFM培养基上清的平均病毒滴度7.68.6log₂，以上结果表明，实施例1-4培养基培养Vero细胞生产狂犬病病毒要比市售的VP-SFM培养基效果要好，其中以实施例1制得的培养基效果较佳。

表3狂犬病病毒接种在Vero细胞后不同培养基培养液上清的病毒滴度（log₂）

由于已经通过以上较佳实施例描述了本发明，在本发明的精神和/或范围内，任何针对本发明的替换/或组合来实施本发明，对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且包含在本发明之中。

Claims

1.一种培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液85-95%、氨基酸溶液2-5%、血清替代因子溶液2-7%、抗氧化剂溶液0.1-0.5%、酵母抽提物溶液0.8-2%、乙醇胺溶液0.1-0.5%。

2.如权利要求1所述的培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于：

所述血清替代因子溶液中溶剂为基础培养液，溶质为生长因子、结合蛋白和贴壁因子中的一种或几种；

所述酵母抽提物溶液溶剂为PBS，溶质为酵母提取物；

所述乙醇胺溶液溶剂为PBS，溶质为乙醇胺。

3.如权利要求1所述的培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由以下按体积百分数计的成分组成：基础培养液90%、氨基酸溶液4%、血清替代因子溶液5%、抗氧化剂溶液0.1%、酵母抽提物溶液0.8%、乙醇胺溶液0.1%；

所述血清替代因子溶液中溶剂为基础培养液，溶质为生长因子、结合蛋白和贴壁因子的混合物；

所述抗氧化剂溶液的浓度为0.5-2mg/L；

所述酵母抽提物溶液的浓度为4-10mg/L；

所述乙醇胺溶液的浓度为0.5-2mL/L。

4.如权利要求1-3任一所述的培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于，所

述血清替代因子的溶质由生长因子、结合蛋白和贴壁因子以配比为(0.2-1):(0-1):(0.4-1)混合所得的混合物。

5.如权利要求4所述的培养Vero细胞用的无血清培养基，其特征在于，

所述生长因子为胰岛素、白介素-2、表皮生长因子、成纤维生长因子、皮质醇和甲状腺激素中的一种或几种；

所述结合蛋白为转铁蛋白、磷蛋白、脂蛋白、糖蛋白、金属蛋白和色蛋白中的一种或几种；

所述贴壁因子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、糖蛋白、球蛋白和脂蛋白中的一种或几种。

6.如权利要求1-5任一所述的培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于，

所述制备方法步骤为：分别取配方量的基础培养液、氨基酸溶液、血清替代因子溶液、抗氧化剂溶液、酵母抽提物溶液和乙醇胺溶液，混合，即得。

7.如权利要求6所述的培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于，

所述氨基酸溶液由如下方法制成：取配方量的赖氨酸、色氨酸、苯异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺，然后溶在配方量的基础培养液，即得。

8.如权利要求6所述的培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于，

所述血清替代因子溶液由如下方法制成：取配方量的由生长因子、结合蛋白和贴壁因子，溶解于配方量的基础培养液，即得；

所述抗氧化剂溶液由如下方法制成：取抗氧化剂，溶解于基础培养液，配成浓度为0.5-2mg/L的溶液，即得。

9.如权利要求6所述的培养Vero细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述酵母抽提物溶液由如下方法制成：取酵母抽提物，溶解于PBS，配成浓度为4-10mg/L的溶液，即得；

10.如权利要求1-9任一所述的培养Vero细胞用的无血清培养基在培养Vero细胞中的用途。