CN114272366B - 一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法及疫苗,属于疫苗制造的领域，其中一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，依次包括以下步骤：S1：培养瓶上Vero细胞的无血清适应驯化；S2：生物反应器上Vero细胞的无血清扩增培养；S3：生物反应器中在Vero细胞上接种JEV；S4：病毒的收获、灭活、浓缩以及纯化；S5：对疫苗原液进行冻干处理；本申请具有提高人用乙型脑炎灭活疫苗的安全性、减少人用乙型脑炎灭活疫苗的副作用的效果。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗制造的领域，尤其是涉及一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法及疫苗。
背景技术
乙型脑炎简称乙脑，是由日本脑炎病毒(JEV)引起的一种人兽共患的蚊媒传染病，属于黄病毒属，主要通过库蚊传播，多流行于亚洲及太平洋地区；且乙脑的危害极大，被世界卫生组织列为重点传染病之一。
JEV感染最初表现为不典型高热，病程通常持续2-3周，临床表现主要为高热、头痛、昏迷、震颤、运动障碍以及神经系统缺陷等症状，儿童常有惊厥发作，如强直阵痉挛发作或局灶性发作；在感染后可能出现免疫介导的横贯性脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎以及NMDA脑炎。
目前，仍无有效药物治疗乙脑感染，主要通过接种乙型脑炎疫苗来防治。乙型脑炎疫苗包括用Nakayama/Beijing-1毒株接种鼠脑生产的灭活疫苗、Beijing-1/SA14-14-2毒株接种PHK/VERO细胞生产的灭活疫苗、SA14-14-2毒株接种原代地鼠肾细胞(PHKC)生产的减毒活疫苗以及黄病毒-乙脑病毒嵌合病毒接种VERO细胞生产的嵌合减毒活疫苗。
其中，Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗有效降低了人体感染JEV后的乙型脑炎发病率；但是，灭活的乙型脑炎疫苗虽然经过一定的处理，但是其仍会含有少量的异体蛋白，会刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞，导致呼吸道过敏症、荨麻疹机血管性水肿以及神经系统过敏症等异常的免疫反应，且存在外源病毒污染的潜在风险，人用乙型脑炎灭活疫苗存在具有较多的副作用，安全性较低。
发明内容
为了提高人用乙型脑炎灭活疫苗的安全性，减少人用乙型脑炎灭活疫苗的副作用，本申请提供一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法及疫苗。
第一方面，本申请提供一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，采用如下的技术方案：
一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，依次包括以下步骤：
S1：培养瓶上Vero细胞的无血清适应驯化；
S2：生物反应器上Vero细胞的无血清扩增培养；
S3：生物反应器中在Vero细胞上接种JEV；
S4：病毒的收获、灭活、浓缩以及纯化；
S5：对疫苗原液进行冻干处理。
通过采用上述技术方案，在疫苗制作的上游工艺中，对Vero细胞进行无血清适应驯化，得到适应无血清培养基的Vero细胞株，使用该Vero细胞株在生物反应器中进行细胞扩增培养和病毒接种的过程中，使用的是无血清培养基，减少了血清中动物源性物质的潜在病毒危害，且减少了血清供应不稳定对疫苗质量造成的影响。
优选的，所述步骤S1中使用混合培养基对Vero细胞进行培养。
优选的，所述混合培养基中包括含血清培养基、无血清培养基以及混合液组。
优选的，所述混合液组包括血清浓度递减的第一混合液、第二混合液以及第三混合液。
优选的，所述第一混合液中含有7.5％的胎牛血清；所述第二混合液中含有5％的胎牛血清；所述第三混合液中含有2.5％的胎牛血清。
通过采用上述技术方案，混合培养基包括含血清培养基、无血清培养基以及血清浓度呈递减的混合液组，使用该混合培养基对Vero细胞进行连续培养，可得到适应无血清培养基的Vero细胞株。
优选的，所述混合培养基中含有白芨多糖。
优选的，所述白芨多糖浓度为0.1-0.3mol/L。
通过采用上述技术方案，在混合培养基中加入白芨多糖，在该混合培养液中对Vero细胞进行培养，可促进Vero细胞贴壁生长，提高驯化过程中的细胞贴壁率，增大步骤S1中每一步无血清适应驯化的成功率，进而缩短步骤S1所需的培养时间：一般驯化培养时间需要45-60天，而使用添加了0.15-0.25mol/L的白芨多糖的混合培养基中进行驯化培养，所需要的培养时间一般在30-40天，可实现提高疫苗生产效率的效果。
优选的，所述步骤S1中对Vero细胞进行消化时，先使用DPBS冲洗Vero细胞，再使用重组胰酶进行细胞消化。
通过采用上述技术方案，重组胰酶是大肠杆菌中表达的一种基因工程蛋白，不含有动物源性物质，以重组胰蛋白酶代替传统的猪胰酶，可减少猪源性病毒污染的可能，提高人用乙型脑炎灭活疫苗的安全性；在一般的细胞消化操作中，首先使用大量的重组胰酶对细胞进行冲洗，接着再使用少量的重组胰酶对细胞进行消化，而在本申请中，使用DPBS代替重组胰酶对细胞进行冲洗，减少细胞消化过程中所需要的重组胰酶量，进而实现降低生产成本的效果。
优选的，所述步骤S3中生物反应器中培养液的pH为7.7-7.9。
通过采用上述技术方案，在疫苗的生产过程中，一般在pH为7.6的条件下进行病毒的接种；而本申请中，在pH为7.7-7.9的条件下进行病毒接种，电镜下观察的病毒形态好，滴度更高；将步骤S3中生物反应器中培养液的pH调整为7.7-7.9，可实现提高疫苗效价的效果。
第二方面，本申请提供一种人用乙型脑炎灭活疫苗，采用如下的技术方案：
一种人用乙型脑炎灭活疫苗，根据上述任一所述的一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法制备得到。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
(1)本申请提供了一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，在该方法中依次使用血清浓度呈递减的混合培养基对Vero细胞进行无血清适应驯化，得到适应无血清培养基的Vero细胞株，使得可在疫苗制备的细胞阶段去掉牛血清的使用，在病毒接种阶段不使用牛血清和人血白蛋白，从而去掉动物源成分，大大降低外源病毒的污染；并且在细胞消化时，以重组胰酶代替传统的猪胰酶，减少猪源性病毒污染，实现减小通过该方法制备得到的疫苗的副作用、提高疫苗安全性的效果。
(2)通过在混合培养基中加入0.1-0.3mol/L的白芨多糖，可促进Vero细胞贴壁生长，提高驯化过程中的细胞贴壁率，进而提高Vero细胞在第一混合液、第二混合液以及第三混合液中培养的成功率，减少重复培养的可能，进而将驯化时间从原本的45-60天缩短至30-40天，实现提高疫苗生产效率的效果。
(3)通过在步骤S1中设置先用DPBS冲洗Vero细胞，再用少量的重组胰酶进行细胞消化，可减少培养过程中使用的重组胰酶的量，实现节约生产成本的效果。
附图说明
图1是实施例1中经过含有不同浓度的白芨多糖的培养基培养后Vero细胞的电镜图；
图2是实施例2中在pH值为7.6和7.8的维持液进行病毒增殖后JEV病毒形态的电镜图。
具体实施方式
本申请涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：
白芨多糖(叶源生物科技有限公司，货号为S23140)；
无血清培养基(赛默飞公司，货号为11681020)；
Leibovitz's L-15(Merck公司，货号为L1518)；
DPBS(Merck公司，货号为D8537)；
β-丙内酯(Merck公司，货号为247073-5G)；
Sepharose 6FF分子筛(叶源生物公司，货号为S14085)。
以下结合附图1-2对本申请作进一步详细说明。
疫苗是指具有免疫保护性的抗原如蛋白质、多肽、多糖或核糖等与免疫佐剂混合制备而成；机体通过注射或口服等途径接种疫苗后，疫苗中的抗原发挥免疫原性作用，刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质，如细胞因子、特异性抗体机细胞因子等，机体再次接受到相同的抗原刺激时，会更加迅速地发生免疫应答反应，迅速分泌或产生免疫保护物质来阻断病原体的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力。疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、联合疫苗以及核酸疫苗等类型。
在乙型脑炎疫苗中，将JEV接种在Vero细胞上进行培养，然后经过灭活、纯化处理后获得保留JEV几乎全部组分的疫苗制品，该疫苗为灭活疫苗。其中，经过处理的JEV失去了感染性，但是保留了较强的免疫原性和较好的安全性。
在疫苗生产的过程中，通过在培养基中添加血清或人血白蛋白，为Vero细胞和JEV的增殖提供必要的蛋白以及生长激素等物质；但是，在该方法中引入了动物源性物质，其存在着成分不确定、批间差异大、外源病毒污染等潜在风险。
因此，在本申请中提供了一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，该方法包括依次以下的步骤：
S1：培养瓶上Vero细胞的无血清适应驯化；
S2：生物反应器上Vero细胞的无血清扩增培养；
S3：生物反应器中在Vero细胞上接种JEV；
S4：病毒的收获、灭活、浓缩以及纯化；
S5：对疫苗原液进行冻干处理。
通过步骤S1可得到适应无血清培养基的Vero细胞株，使得后续的步骤中不引入血清等动物源性物质。
在步骤S1中使用混合培养基进行Vero细胞的无血清适应驯化，混合培养基包括含血清培养基、无血清培养基以及混合液组；其中，含血清培养基为含10％胎牛血清的MEM培养基，无血清培养基为含4mM谷氨酰胺的无血清培养基，混合液组包括血清浓度递减的第一混合液、第二混合液以及第三混合液，上述培养基和混合液组构成了血清浓度呈递减的培养体系，在该体系中进行Vero细胞的连续培养，逐步增强Vero细胞的无血清适应能力，最终驯化得到适应无血清培养基的Vero细胞株。
并且，在上述混合培养基中加入白芨多糖，白芨多糖的浓度为0.1-0.3mol/L，白芨多糖可促进Vero细胞贴壁生长，提高驯化培养的成功率，进而缩短驯化培养所需要的时间，实现提高生产效率的效果。
同时，在步骤S1中对Vero细胞进行消化传代培养时，首先使用DPBS冲洗细胞，再使用重组胰酶进行细胞消化，减少培养过程中使用的重组胰酶的量，实现降低生产成本的效果。
在步骤S3中进行病毒接种时，生物反应器中培养液的pH值在7.7-7.9，在该条件下增殖得到的病毒在电镜下观察的形态更好，并且由此制得的疫苗的滴度以及效价相比于在一般的条件下(pH＝7.6)制得的疫苗更高。
在本申请中还提供了一种人用乙型脑炎灭活疫苗，该疫苗是由上述的一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法制备得到的，该疫苗在生产的过程中未引入血清等动物源性物质，副作用较小，生物安全性较高，且疫苗的质量较稳定。
实施例1：Vero细胞的无血清适应驯化
1、Vero细胞的驯化
在本实施例中，使用混合培养基对来源于ATCC的Vero细胞进行无血清适应驯化，具体的操作步骤如下所示：
(1)Vero细胞的复苏；
(2)在混合培养基中驯化Vero细胞；
步骤1：将复苏的Vero细胞置于含血清培养基中进行培养，待细胞长满单层后，先使用DPBS冲洗细胞，接着使用重组胰酶消化细胞，进行传代；
步骤2：将复苏的Vero细胞置于第一混合液中进行培养，待细胞长满单层后，先使用DPBS冲洗细胞，接着使用重组胰酶消化细胞，进行传代；
步骤3：将复苏的Vero细胞置于第二混合液中进行培养，待细胞长满单层后，先使用DPBS冲洗细胞，接着使用重组胰酶消化细胞，进行传代；
步骤4：将复苏的Vero细胞置于第三混合液中进行培养，待细胞长满单层后，先使用DPBS冲洗细胞，接着使用重组胰酶消化细胞，进行传代；
步骤5：将复苏的Vero细胞置于无血清培养基中进行培养。
通过上述步骤，经过五代可得到适应无血清培养基的Vero细胞株。
2、混合液组中含血清培养基和无血清培养基的比例
混合液组中包括血清浓度呈递减的第一混合液、第二混合液以及第三混合液，设置了5组不同的混合液组对生长状况相近的Vero细胞进行培养，且每组混合液组设置20组平行试验，得到的结果如表1所示：
表1.
从表1中可以看出，当第一混合液、第二混合液以及第三混合液中含血清培养基和无血清培养基的比例分别为3:1、1:1以及1:3，即第一混合液、第二混合液以及第三混合液中分别含有7.5％、5％以及2.5％时，对Vero细胞进行驯化得到适应无血清培养基的细胞株所需用的时间最短。
3、混合培养基中白芨多糖的浓度
在Vero细胞的驯化过程中，发明人发现在培养基中加入白芨多糖可有效缩短细胞驯化的时间，且在电镜下观察到Vero细胞的细胞贴壁率更高，说明在培养基中加入白芨多糖可增强Vero细胞的贴壁能力，促进Vero细胞的贴壁生长，有利于Vero细胞通过第一混合液、第二混合液以及第三混合液的培养，减少驯化过程中重复培养的操作，进而缩短驯化时间。
在本实施例中，设置了一系列含有不同浓度的白芨多糖的培养基，在该培养基中对同一批生长情况相近的细胞进行培养，并在电镜下观察经过培养后细胞的形态，结果如图1所示。
从图1中可以看出，加入的白芨多糖的浓度时，细胞贴壁率比未加入白芨多糖的细胞贴壁率高，并且在加入的白芨多糖的浓度为0.1-0.3mol/L时，细胞贴壁生长的情况理想。
并且，设置一系列含有不同浓度的白芨多糖的混合培养基，使用该培养基对同一批生长状况相近的Vero细胞进行培养，且每组混合液组设置20组平行试验，得到的结果如表2所示：
表2.
| 组别 | 白芨多糖浓度(mol/L) | 平均培养天数 |
| 1 | 0 | 50.3 |
| 2 | 0.05 | 49.5 |
| 3 | 0.1 | 39.5 |
| 4 | 0.2 | 36.2 |
| 5 | 0.3 | 38.3 |
| 6 | 0.4 | 51.0 |
从表2中可以看出，当加入的白芨多糖的浓度在0.1-0.3mol/L时，成功驯化得到适应无血清培养基所需用的时间相比于未加入白芨多糖所需用的时间明显缩短，说明在驯化的过程中加入0.1-0.3mol/L的白芨多糖有利于将Vero细胞驯化成适应无血清培养基的细胞株，可实现提高生产效率的效果。
实施例2：乙型脑炎病毒在无血清培养系统中的增殖
在乙型脑炎灭活疫苗的生产中，包括将JEV接种到Vero细胞上进行增殖的步骤。在本实施例中，提供了一种乙型脑炎病毒在无血清培养系统中增殖的方法，在该方法中，将JEV接种到经由实施例1培养得到的适应无血清培养基的Vero细胞上，具体操作步骤如下所示：
步骤1、细胞增殖：将经过实施例1驯化得到的Vero细胞置于无血清培养基中培养，待细胞长至单层后，弃掉上清液；
步骤2、病毒接种：按照MOI＝0.001-0.1接入JEV吸附1h；
步骤3、病毒培养：病毒接种后加入维持液，置于33℃、5％CO2培养箱中进行培养；
步骤4、病毒收获：培养1天后换液，换液3天后收获病毒液(1收)，收获完毕后，补加维持液，再培养3天后收获病毒液(2收)。
其中，步骤3中的维持液为含有浓度为4mmol/L谷氨酰胺的无血清培养基或Leibovitz's L-15；且维持液的pH值为7.7-7.9；与一般病毒接种条件的pH＝7.6相比，将维持液的pH值控制在7.7-7.9之间，有利于JEV在Vero细胞上的增殖，且在电镜下观察到的病毒形态更好。
图2为在电镜下观察到的JEV病毒形态，左图为在pH为7.6的维持液中进行JEV增殖，右图为在pH为7.8的维持液中进行JEV增殖，从图中可以看出，pH＝7.8的病毒形态比pH＝7.6的病毒形态更好，说明在pH＝7.8的维持液进行JEV增殖的效果更佳。
对通过上述方法收获得到的1收和2收病毒液进行滴度检测，并且以有血清培养系统为对照组，含血清培养系统为0.2％人白维持液，其由Leibovitz's L-15和0.2％的人血白蛋白组成，检测结果如表3所示：
表3
从表3中可以看出，在无血清培养基找那个进行病毒增殖时，将维持液的pH值控制在7.8可得到更加高的病毒滴度，而在含血清的培养基中，维持液pH控制在7.6和7.8得到的病毒滴度相近。
实施例3：人用乙型脑炎灭活疫苗
1、人用乙型脑炎灭活疫苗的制备
在本实施例中，将使用实施例1所述的方法驯化得到的适应无血清培养基的Vero种子细胞加入生物反应器中，在无血清培养基中与微载体一起进行灌流培养，后沉降微载体和细胞，以维持液更换培养基，接种JEV继续进行灌流培养，收集病毒液，再经过浓缩、过滤、灭活、纯化以及冻干处理后，便可得到人用乙型脑炎灭活疫苗，具体操作步骤如下所示：
步骤1、Vero细胞的扩增培养：将使用实施例1所述的方法驯化得到的适应无血清培养基的Vero种子细胞按照1.0×106个/ml的接种密度接种至生物反应器内，且生物反应器内1000-1200g的片状微载体的密度为18g/L，接种24h后，用无血清培养基在pH为7.0-7.4、37±0.5℃的条件下进行灌流培养5-7天；
步骤2、Vero细胞上的JEV接种：当生物反应器内哈密尔顿活细胞计数仪的PF值达到80时，将反应温度将至33℃，取工作种子按MOI＝0.0025接种病毒，吸附6-24h后以维持液替换培养液进行灌流，维持液的pH控制在7.7-7.9之间，按1v/天的灌流速度收获病毒液，共收获8天；
步骤3、病毒液的浓缩：收获得到的病毒液经0.65μm滤膜澄清，并用截流分子量为300KD滤膜超滤浓缩20-30倍，浓缩后的病毒液中蛋白质含量在10-15mg/mL；
步骤4、病毒液的灭活：往经过浓缩的病毒液中加入β-丙内酯，在4℃下搅拌灭活24h，后在37℃下水解2h；
步骤5、病毒液的纯化：依次使用阳离子交换色谱柱以及Sepharose 6FF分子筛对经过灭活的病毒液进行层析，并且检测纯化液在280nm的紫外光吸光值，当吸光值为50mAU开始收集、吸光值回到50mAU结束收集；
步骤6、冻干稀释液的制备：将麦芽糖、海藻糖、山梨醇、精氨酸等溶解于PBS溶液中，并用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤；
步骤7、半成品的配制：将经过纯化的病毒液与冻干稀释液按1:3-1:10的体积比混合，蛋白质的含量在12-18μg/Ml,且抗原含量不低于1:8；
步骤8、冻干成品的制备：将半成品封装至西林瓶中，将半成品快速降温至-45℃，在此温度下维持4-6小时，后在-15℃退火，退火时间为10-30min。退火后，再将温度降低至-45℃，在此温度下维持4-6小时后，抽真空至0.1mbar，然后升温至-30℃，8-10小时之后升温至-20℃，4-6小时之后升温至27℃维持6-8小时
其中，在步骤1和2中使用生物反应器进行细胞培养，提高了细胞密度，实现大规模、高密度培养，同时可以消除疫苗产品批次间差异和培养周期的不稳定性，可提高疫苗的质量；在步骤5中使用阳离子交换层析法以及凝胶过滤层析法对进行纯化，过滤细胞破碎产物和细胞代谢产物，提高病毒抗原的纯净性，减小疫苗的副作用，进而提高疫苗的安全性；并且在疫苗中添加麦芽糖、海藻糖、山梨醇、精氨酸作为冻干保护剂，有利于疫苗保持玻璃化，使得疫苗具有复溶效率高、物理性状好以及质量稳定性高等优点。
2、人用乙型脑炎灭活疫苗的评价
对由步骤2收获得到的病毒液进行滴度检测，并且对通过上述方法所制得的人用乙型脑炎疫苗进行热稳定性试验、牛血清蛋白残留、Vero细胞DNA残留量以及Vero细胞蛋白质残留量等相关参数的检测，检测结果如表4所示：
表4
从表4中可以看出，在上述的制备人用乙型脑炎疫苗的方法中，在pH为7.8的维持液中进行病毒的增殖，病毒的繁殖能力、滴度以及疫苗的效价比含血清维持液的高，且疫苗中无牛血清蛋白残留，疫苗具有更高的安全性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
S1：培养瓶上Vero细胞的无血清适应驯化；
S2：生物反应器上Vero细胞的无血清扩增培养；
S3：生物反应器中在Vero细胞上接种JEV；
S4：病毒的收获、灭活、浓缩以及纯化；
S5：对疫苗原液进行冻干处理；
所述步骤S1中使用混合培养基对Vero细胞进行培养；
所述混合培养基包括含血清培养基、无血清培养基以及混合液组；
所述混合液组包括血清浓度递减的第一混合液、第二混合液以及第三混合液；
所述第一混合液中含有7.5%的胎牛血清；所述第二混合液中含有5%的胎牛血清；所述第三混合液中含有2.5%的胎牛血清；
所述混合培养基中含有白芨多糖；所述白芨多糖浓度为0.1-0.3mol/L；
所述步骤S3中生物反应器中维持液的pH为7.7-7.9。
2.根据权利要求1所述的一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S1中对Vero细胞进行消化时，先使用DPBS冲洗Vero细胞，再使用重组胰酶进行细胞消化。
3.一种人用乙型脑炎灭活疫苗，其特征在于，根据权利要求1或2所述的一种制备人用乙型脑炎灭活疫苗的方法制备得到。
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