CN114181914A - 一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法 - Google Patents

一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种轮状病毒培养方法，所述方法先使用无血清培养基对宿主细胞进行逐级扩大培养至生物反应器，然后使用添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基在生物反应器中对轮状病毒进行培养，所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；所述方法可在保证病毒滴度不降低的情况下省略细胞洗涤的过程，同时排除因血清、猪源胰蛋白酶等引入外源因子的风险。

Description

一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法
技术领域
本发明涉及一种基于无血清培养基的轮状病毒培养方法，属于生物技术领域。
背景技术
轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科，是引起五岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体之一，全球每年感染人数上亿，造成死亡人数数十万。95%以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒。据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡病例高达60万，而腹泻病例则高达2亿。
轮状病毒在1973年首次被发现，但至今仍无特效药。安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。轮状病毒疫苗免疫可以显著的降低婴幼儿因轮状病毒感染而造成的重症腹泻的比例。过去，由于传代细胞系和大规模培养技术的使用，轮状病毒疫苗生产技术已取得了令人瞩目的成就。然而，目前的轮状病毒疫苗生产用培养基需添加胎牛血清、猪胰蛋白酶等动物源性成分，存在外源因子（extraneous agents，EA）污染的风险。
外源因子是指生物制品生产过程中存在于菌毒种、细胞基质及生产制品所用的原材料及制品中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和病毒，通常外源因子主要指病毒性外源因子（简称外源病毒）。在过去60年中，轮状病毒疫苗生产发生过多起疫苗被污染外源病毒事件，葛兰素史克公司（GSK）的轮状病毒疫苗Rotarix中曾发现猪圆环病毒（PCV）污染，可能是生产过程中使用猪胰酶携带所致。
除猪圆环病毒污染以外，从胎牛血液提取的胎牛血清、从猪胰脏提取的猪胰蛋白酶等动物源性成分还会给轮状病毒疫苗生产带来包括牛病毒性腹泻病毒（BVD）、牛副流感病毒3型（PI3）、牛腺病毒（BAV-3）、牛细小病毒（BPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）在内的多种外源因子污染风险。因上述部分外源因子具有致病性，污染可能会引起生物安全问题，为了避免外源因子污染的出现，各国药典均规定了需在轮状病毒疫苗生产过程中进行全面的外源因子质控检查。然而，为了尽可能的从根源性的杜绝外源因子污染风险，开发无动物源性成分的轮状病毒疫苗生产工艺势在必行。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种轮状病毒培养方法，所述方法包括如下步骤：
宿主细胞的制备：使用无血清培养基将宿主细胞逐级扩大培养至添加有微载体的生物反应器中至宿主细胞长满微载体后，排出上清，得到待接种的生物反应器；所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；
轮状病毒的培养：将轮状病毒毒株活化并接种至病毒维持液中后，将经接种的病毒维持液添加至待接种的生物反应器中进行病毒培养，得到轮状病毒培养液；所述病毒维持液为添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为1~7µg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为4µg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述消化为：将宿主细胞于预热至35~38℃的消化液中浸泡30~60s，浸泡结束后，弃去消化液，将宿主细胞于35~38℃下消化5~10min，得到经消化的宿主细胞；所述消化液为添加有无动物源性胰蛋白酶的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.2~1.2mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.8mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液中还添加有金属离子螯合剂。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.1~0.3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为浓度0.01~0.05M、pH 7.2~7.6的PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述中和为：在消化后的宿主细胞中添加中和液至浸没宿主细胞，得到经中和的宿主细胞悬液；所述中和液为添加有无动物源性胰蛋白酶抑制剂的无血清培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.25~4mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.5mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒毒株活化为：在轮状病毒的病毒液中加入无动物源性胰蛋白酶和氯化钙进行病毒活化，得到病毒活化液。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为5~15μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为10μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为400~800μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为600μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶为重组胰蛋白酶。
在本发明的一种实施方式中，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述逐级扩大培养的条件为：于35~38℃培养4~7d。
在本发明的一种实施方式中，所述经活化的轮状病毒在病毒维持液中的接种量为0.0001~0.1MOI。
在本发明的一种实施方式中，所述病毒培养的条件为：于30~50rpm、35~38℃、pH7.2~7.6、DO 40~60%下培养2~4d。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒活化的条件为：于35~38℃孵育0.5~1.5h。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为Vero细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述逐级扩大培养包括如下步骤：
一级扩大培养：取1支Vero细胞用10mL无血清培养基复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到经消化液消化处理的T25细胞瓶；
二级扩大培养：将中和液以2mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T25细胞瓶中后，用8mL无血清培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到重悬液；将重悬液和无血清培养基按照体积比1:5混合后，均分至2个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到2个经消化液消化处理的T75细胞瓶；
三级扩大培养：将中和液以5mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T75细胞瓶中后，用25mL无血清培养基重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份重悬液；将2份重悬液分别和无血清培养基按照体积比1:5混合后，均分至4个T225细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的T225细胞瓶；弃去T225细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以10mL/瓶的添加量添加至T225细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T225细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到4个经消化液消化处理的T225细胞瓶；
四级扩大培养：将中和液以10mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T225细胞瓶中后，用20mL无血清培养基重悬T225细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份重悬液；将4份重悬液合并，并补加无血清培养基至总体积为2L后，添加至1个2L的10层细胞工厂内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，将预热至37℃的消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到经消化液消化处理的10层细胞工厂；
五级扩大培养：将中和液以50mL/层的添加量添加至经消化液消化处理的10层细胞工厂中后，用150mL/层的无血清培养基重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到重悬液；在重悬液中补加无血清培养基至总体积为12L后，均分至6个10层细胞工厂内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到6个长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，将预热至37℃的消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到6个经消化液消化处理的10层细胞工厂；
六级扩大培养：将中和液以50mL/层的添加量添加至经消化液消化处理的10层细胞工厂中后，用150mL/层的无血清培养基重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到6份重悬液；将6份重悬液合并后添加至经前处理的生物反应器中；在生物反应器中补加无血清培养基至重悬液的总体积为40L后，设置生物反应器内细胞培养的参数为搅拌转速35rpm、温度37℃、pH 7.2、DO 50%对生物反应器内的Vero细胞进行培养，Vero细胞培养期间，每24h检测培养液的葡萄糖含量，当葡糖糖含量低于1.5g/L时使用无血清培养基开始灌流培养，控制培养液的葡糖糖含量不低于1.5g/L；待Vero细胞在生物反应器内培养5d至长满微载体进入平台期后，停止搅拌并静置20min，使微载体充分沉降后排出上清，得到待接种的生物反应器。
本发明还提供了上述轮状病毒培养方法在制备轮状病毒疫苗中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述轮状病毒疫苗为轮状病毒灭活疫苗或轮状病毒减毒活疫苗。
本发明还提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：
轮状病毒的培养：使用上述轮状病毒培养方法对轮状病毒毒株进行培养，得到轮状病毒培养液；
轮状病毒的后处理：将轮状病毒培养液经载体过滤、宿主细胞破碎、离心澄清、病毒灭活、宿主DNA降解、浓缩以及纯化，得到轮状病毒灭活疫苗。
本发明还提供了一种轮状病毒减毒活疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：
轮状病毒的培养：使用上述轮状病毒培养方法对轮状病毒减毒株进行培养，得到轮状病毒培养液；
轮状病毒的后处理：将轮状病毒培养液经微载体过滤以及过滤澄清，得到轮状病毒减毒活疫苗。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种轮状病毒培养方法，所述方法为先使用无血清培养基将宿主细胞逐级扩大培养至添加有微载体的生物反应器中至宿主细胞长满微载体后，排出上清，得到待接种的生物反应器，再将经活化的轮状病毒毒株接种至病毒维持液中后，将经接种的病毒维持液添加至待接种的生物反应器中进行病毒培养，得到轮状病毒培养液，所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞，所述病毒维持液为添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基；研究表明，基于微载体的生物反应器培养工艺在病毒滴度上明显优于传统的细胞工厂培养工艺，并且，基于无动物源性原辅料的生物反应器培养工艺可替代含血清及猪源胰蛋白酶的生物反应器培养工艺，因此，所述方法可在保证病毒滴度不降低的情况下省略宿主细胞洗涤的过程，同时，可排除因血清、猪源胰蛋白酶等引入外源因子的风险，从根源性上杜绝了轮状病毒疫苗生产过程中的外源因子污染。
进一步地，所述消化为将宿主细胞于预热至35~38℃的消化液中浸泡30~60s，浸泡结束后，弃去消化液，将宿主细胞于35~38℃下消化5~10min，得到经消化的宿主细胞，所述消化液为添加有无动物源性胰蛋白酶的缓冲液，所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.8mg/mL；0.8mg/mL的浓度可使得宿主细胞充分分散，同时，不伤害宿主细胞的状态。
进一步地，所述中和为在消化后的宿主细胞中添加中和液至浸没宿主细胞，得到经中和的宿主细胞悬液，所述中和液为添加有无动物源性胰蛋白酶抑制剂的无血清培养基，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在缓冲液中的浓度为0.5mg/mL；0.5mg/mL的浓度可使得宿主细胞充分伸展贴壁，并且生长状态良好，同时，不影响后续宿主细胞消化时重组胰蛋白酶的活性。
进一步地，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为4µg/mL；4µg/mL的浓度可提高轮状病毒的病毒滴度，同时，降低疫苗生产纯化的压力。
附图说明
图1：Vero细胞在不同培养基中的生长情况。
图2：不同浓度重组胰蛋白酶对细胞的消化效果。
图3：不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂对胰酶的中和效果。
图4：病毒维持液中重组胰蛋白酶添加浓度对轮状病毒生长的影响
图5：三种培养工艺对轮状病毒病毒滴度的影响。
图6：Vero细胞在微载体表面贴壁的生长情况。
图7：Vero细胞在生物反应器内的生长曲线。
图8：轮状病毒在50L生物反应器内的生长曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例、对比例和实验例中涉及的缓冲液如下：
PBS缓冲液：先称取8.5g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后用HCl调节pH至7.35，最后加蒸馏水定容至1L，即得0.01M、pH 7.4的PBS缓冲液。
下述对比例和实验例中涉及的消化液如下：
0.25%胰酶消化液：先称取2.5g猪源胰蛋白酶（购自Gibco公司）、0.2g EDTA溶解于PBS缓冲液中，然后用HCl调节pH至7.4，最后加PBS缓冲液定容至1L，即得0.25%胰酶消化液。
实验例1：无血清培养基对Vero细胞生长特性的影响
本实验例提供了无血清培养基对Vero细胞生长特性的影响实验，实验过程包括如下步骤：
步骤一：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL含10%（v/v）胎牛血清（购自兰州荣晔公司）的DMEM培养基（购自Gibco公司）复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到传代液；
步骤二：将传代液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至2个T75细胞瓶内，于37℃继续培养7d至Vero细胞长满单层，得到2个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T75细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞40s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到重悬液；
步骤三：将重悬液于1500rpm离心3min后弃上清，取沉淀合并后，用12mL PBS缓冲液重悬后均分至3管离心管中，再次于1500rpm离心3min后弃上清，取3份沉淀分别用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基、无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco公司）、无血清培养基2（VirusPro®，购自上海源培生物公司）重悬至细胞密度为1.0×105cell/mL，得到细胞悬液；以1种培养基为1组，将每组细胞悬液均分至7个T25瓶中，于37℃进行培养，培养期间，每天随机取1瓶，参照步骤一的方法消化、重悬并吹打均匀后计数，持续统计6天，得到各组Vero细胞的生长曲线，统计结果见图1。
由图1可知，使用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基对Vero细胞进行培养时，可在培养第5天达到细胞密度8.1×105 cell/mL；使用无血清培养基1对Vero细胞进行培养时，细胞生长最快，可在培养第5天长满，达到平台期，此时，细胞密度为1.09×106cell/mL；使用无血清培养基2对Vero细胞进行培养时，细胞生长速度略快于含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基，可在培养第5天达到细胞密度为8.25×105cell/mL。结果表明Vero细胞在无血清培养基中也能长势良好，并且，Vero细胞在无血清培养基1中的长势尤为突出，远优于Vero细胞在含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基中的生长情况。
实验例2：重组胰蛋白酶的使用浓度对Vero细胞消化效果的影响
本实验例提供了重组胰蛋白酶的使用浓度对Vero细胞消化效果的影响实验，实验过程包含如下步骤：
步骤一：使用含0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA，购自湖南九典制药）的PBS缓冲液将重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）配置成浓度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL的消化液1~5；
步骤二：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL含10%（v/v）胎牛血清（购自兰州荣晔公司）的DMEM培养基（购自Gibco公司）复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到传代液；
步骤三：将传代液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至6个T25细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到6个长满单层Vero细胞的T25细胞瓶；随机取5个长满单层Vero细胞的T25细胞瓶，弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞2次，洗涤结束后，将预热至37℃的消化液1~5以2mL/瓶的添加量分别添加至5个T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液1~5，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco公司）重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，吹打均匀后，在显微镜下观察T25细胞瓶内Vero细胞的松散情况并拍照，观察结果见图2，当细胞不成团且充分分散成单个细胞时，证明此浓度下重组胰蛋白酶将细胞充分消化。
由图2可知，当重组胰蛋白酶浓度达到0.8mg/mL及以上时，Vero细胞充分分散，考虑到重组胰蛋白酶浓度过高会影响细胞状态，因此，选择0.8mg/mL作为细胞消化时重组胰蛋白酶的使用浓度。
实验例3：大豆胰蛋白酶抑制剂的使用浓度对Vero细胞中和效果的影响
本实验例提供了大豆胰蛋白酶抑制剂的使用浓度对Vero细胞中和效果的影响实验，实验过程包含如下步骤：
步骤一：使用无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco公司）将大豆胰蛋白酶抑制剂（购自Gibco公司）配置成浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL的中和液1~5；使用含0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS缓冲液将重组胰蛋白酶配置成浓度为0.8mg/mL的消化液；
步骤二：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL含10%（v/v）胎牛血清（购自兰州荣晔公司）的DMEM培养基（购自Gibco公司）复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到传代液；
步骤三：将传代液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至6个T25细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到6个长满单层Vero细胞的T25细胞瓶；随机取5个长满单层Vero细胞的T25细胞瓶，弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞2次，洗涤结束后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量分别添加至5个T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到5个经消化液消化处理的T25细胞瓶；
步骤四：将中和液1~5以2mL/瓶的添加量分别添加至在5个经消化液消化处理的T25细胞瓶中后，用18mL无血清培养基1重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到重悬液1~5；取10mL重悬液1~5分别添加至5个T25细胞瓶中后，于37℃培养24h，培养结束后，在显微镜下观察细胞伸展、贴壁、生长情况并拍照，观察结果见图3。
由图3可知，当中和液中大豆胰蛋白酶抑制剂浓度为0.25mg/mL时，Vero细胞皱缩抱团，没有充分伸展及贴壁生长，表明此浓度没有充分中和Vero细胞消化时残留的重组胰蛋白酶，而当大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度达到0.5mg/mL及以上时，Vero细胞充分伸展贴壁，并且生长状态良好。考虑到大豆胰蛋白酶抑制剂浓度过高会影响后面Vero细胞消化时重组胰蛋白酶的活性，因此，选择0.5mg/mL作为大豆胰蛋白酶抑制剂的使用浓度。
实验例4：重组胰蛋白酶的使用浓度对轮状病毒培养滴度的影响
本实验例提供了重组胰蛋白酶的使用浓度对轮状病毒培养滴度的影响实验，实验过程包含如下步骤：
步骤一：使用无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco公司）将重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）配置成分别含有0µg/mL、1µg/mL、4µg/mL、7µg/mL、10µg/mL重组胰蛋白酶的病毒维持液1~5；使用含0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS缓冲液将重组胰蛋白酶配置成浓度为0.8mg/mL的消化液；使用无血清培养基1将大豆胰蛋白酶抑制剂配置成浓度为0.5mg/mL的中和液；
步骤二：取2支Vero细胞（购自ATCC）分别用10mL无血清培养基1复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到2个经消化液消化处理的T25细胞瓶；
步骤三：将中和液以2mL/瓶的添加量分别添加至在2个经消化液消化处理的T25细胞瓶中后，用8mL无血清培养基1重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份重悬液；将2份重悬液分别和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，分别均分至4个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到4个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去4个T75细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以5mL/瓶的添加量分别添加至4个T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到4个经消化液消化处理的T75细胞瓶；
步骤四：将中和液以5mL/瓶的添加量分别添加至在4个经消化液消化处理的T75细胞瓶中后，用25mL无血清培养基1重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份重悬液；将4份重悬液合并，得到混合液；将混合液和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，均分至24个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到24个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；随机取15个T75细胞瓶弃上清后，随机分为5组，每组3瓶，并在5组T75细胞瓶中分别加入30mL病毒维持液1~5；
步骤五：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）1mL，在病毒液中加入终浓度10μg/mL的重组胰蛋白酶（购自上海雅心生物公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h，得到病毒活化液；将病毒活化液按照0.001MOI的接种量分别接种至8组添加有病毒维持液的T75细胞瓶中后，于37℃下培养7d，培养期间，每天从各组T75细胞瓶内取样并使用酶联免疫斑点法（参见文献：Li, Tingdong; Lin, Haijun;Yu, Linqi; Xue, Miaoge; Ge, Shengxiang; Zhao, Qinjian; Zhang, Jun; Xia,Ningshao (2014). Development of an enzyme-linked immunospot assay fordetermination of rotavirus infectivity. Journal of Virological Methods, 209,7-14.）检测病毒滴度，持续统计7天，统计结果见图4。
由图4可知，当病毒维持液中重组胰蛋白酶的浓度为4~7µg/mL时，病毒滴度整体较高且在第3~4天病毒滴度达到峰值，其中，病毒维持液中重组胰酶浓度为4µg/mL时，T75细胞瓶内上清峰值滴度达7.1 lgFFU/mL。考虑到重组胰蛋白酶使用浓度过高会增加疫苗生产纯化的压力，因此，病毒维持液中重组胰蛋白酶的使用浓度选择4µg/mL。
对比例1：轮状病毒的培养方法
本对比例提供了传统的基于含血清培养基、猪源胰蛋白酶及细胞工厂的轮状病毒培养方法，具体步骤如下：
步骤一：使用DMEM培养基（购自Gibco公司）将猪源胰蛋白酶（购自Gibco公司）配置成含有15µg/mL猪源胰蛋白酶的病毒维持液；
步骤二：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到一级传代液；
步骤三：将一级传代液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至2个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到2个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T75细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用30mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份二级传代液；
步骤四：将2份二级传代液合并，得到混合液；将混合液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至4个T225细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到4个长满单层Vero细胞的T225细胞瓶；弃去T225细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T225细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以10mL/瓶的添加量添加至T225细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T225细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用20mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T225细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份三级传代液；
步骤五：将4份三级传代液合并，并补加含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基至总体积为2L后，添加至1个10层细胞工厂（购自Thermo Fisher公司，培养体积2L）内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，用DMEM培养基洗涤10层细胞工厂内的Vero细胞，得到待接种的10层细胞工厂；
步骤六：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）1mL，在病毒液中加入终浓度15μg/mL的猪源胰蛋白酶和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h，得到病毒活化液；将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至2L病毒维持液中，得到接种液；将接种液添加至待接种的10层细胞工厂中，于37℃培养4d至病毒滴度达到峰值，得到轮状病毒培养液。
上述方法中，步骤六的轮状病毒培养时间由预实验确定，预实验如下：
在步骤六对轮状病毒连续培养5d，培养期间，每天从10层细胞工厂中对培养液进行取样并使用酶联免疫斑点法（参见文献：Li, Tingdong; Lin, Haijun; Yu, Linqi;Xue, Miaoge; Ge, Shengxiang; Zhao, Qinjian; Zhang, Jun; Xia, Ningshao (2014).Development of an enzyme-linked immunospot assay for determination ofrotavirus infectivity. Journal of Virological Methods, 209, 7-14.）检测病毒滴度，检测结果见图5的培养工艺1。
由图5可知，轮状病毒在10层细胞工厂中生长良好，并在培养第4天病毒滴度达到最高7.16 lgFFU/mL。
对比例2：轮状病毒培养方法
本对比例提供了传统的基于含血清培养基、猪源胰酶及生物反应器的轮状病毒培养方法，具体步骤如下：
步骤一：使用DMEM培养基（购自Gibco公司）将猪源胰蛋白酶（购自Gibco公司）配置成含有15µg/mL猪源胰蛋白酶的病毒维持液；取40g微载体（Cytodex-1，购自GE公司）倒入PBS缓冲液中，于室温（25℃）浸泡24h后，用PBS缓冲液洗涤2遍，得到经水化的微载体；将经水化的微载体全部倒入生物反应器（购自南京百帕斯，工作体积10L）中，校准pH电极后进行灭菌，得到经前处理的生物反应器；
步骤二：取2支Vero细胞（购自ATCC）分别用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T25细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去0.25%胰酶消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用10mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份一级传代液；
步骤三：将2份一级传代液分别和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至4个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到4个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T75细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用30mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份二级传代液；
步骤四：将4份二级传代液合并，得到混合液；将混合液和含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基按照体积比1:5混合后，均分至8个T225细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到8个长满单层Vero细胞的T225细胞瓶；弃去T225细胞瓶内上清后，用PBS缓冲液洗涤T225细胞瓶内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以10mL/瓶的添加量添加至T225细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T225细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用20mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬T225细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到8份三级传代液；
步骤五：将8份三级传代液合并，并补加含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基至总体积为4L后，均分至2个10层细胞工厂（购自Thermo Fisher公司，培养体积2L）内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到2个长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，用PBS缓冲液洗涤10层细胞工厂内的Vero细胞，洗涤结束后，将猪源胰蛋白酶配置而成的0.25%胰酶消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，消化结束后，用2000mL（200mL/层）含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到2份四级传代液；
步骤六：将2份四级传代液合并后添加至经前处理的生物反应器中；在生物反应器中补加含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基至重悬液的总体积为10L后，设置生物反应器内细胞培养的参数为搅拌转速35rpm、温度37℃、pH 7.2、DO（溶解氧含量）50%对生物反应器内的Vero细胞进行培养，Vero细胞培养期间，每24h检测培养液的葡萄糖含量，当葡糖糖含量低于2.0g/L时使用含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基开始灌流培养，控制培养液的葡糖糖含量不低于2.0g/L；待Vero细胞在生物反应器内培养5d至Vero细胞长满微载体进入平台期后，停止搅拌并静置20min，使微载体充分沉降后排出上清，得到待清洗的生物反应器；
步骤七：在生物反应器中补加DMEM培养基至重悬液的总体积为10L后，重启搅拌对生物反应器内的微载体进行清洗，清洗结束后，停止搅拌并静置20min，使微载体充分沉降后排出上清；重复此过程5次以充分去除残留血清，得到待接种的生物反应器；
步骤八：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）1mL，在病毒液中加入终浓度15μg/mL的猪源胰蛋白酶和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h，得到病毒活化液；将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至10L病毒维持液中，得到接种液；将接种液添加至待接种的生物反应器中后，设置生物反应器内细胞培养的参数为搅拌转速45rpm、温度37℃、pH 7.2、DO 50%对生物反应器内的轮状病毒进行培养；待轮状病毒在生物反应器内培养3d至病毒滴度达到峰值后，停止搅拌，得到轮状病毒培养液。
上述方法中，步骤八的轮状病毒培养时间由预实验确定，预实验如下：
在步骤八对轮状病毒连续培养5d，培养期间，每天从生物反应器内对培养液进行取样并使用酶联免疫斑点法（参见文献：Li, Tingdong; Lin, Haijun; Yu, Linqi; Xue,Miaoge; Ge, Shengxiang; Zhao, Qinjian; Zhang, Jun; Xia, Ningshao (2014).Development of an enzyme-linked immunospot assay for determination ofrotavirus infectivity. Journal of Virological Methods, 209, 7-14.）检测病毒滴度，检测结果见图5的培养工艺3。
由图5可知，轮状病毒在生物反应器中生长良好，并在培养第3天病毒滴度达到最高7.98 lgFFU/mL。
实施例1：轮状病毒培养方法
本实施例提供了基于无血清培养基、重组胰酶、胰酶抑制剂及生物反应器的轮状病毒培养方法，具体步骤如下：
步骤一：使用含0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS缓冲液将重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）配置成浓度为0.8mg/mL的消化液；使用无血清培养基1将大豆胰蛋白酶抑制剂（购自Gibco公司）配置成浓度为0.5mg/mL的中和液；使用无血清培养基1将重组胰蛋白酶配置成含有4µg/mL重组胰蛋白酶的病毒维持液；取40g微载体（Cytodex-1，购自GE公司）倒入PBS缓冲液中，于室温（25℃）浸泡24h后，用PBS缓冲液洗涤2遍，得到经水化的微载体；将经水化的微载体全部倒入生物反应器（购自南京百帕斯，工作体积10L）中，校准pH电极后进行灭菌，得到经前处理的生物反应器；
步骤二：取2支Vero细胞（购自ATCC）分别用10mL无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco）复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到2个经消化液消化处理的T25细胞瓶；
步骤三：将中和液以2mL/瓶的添加量分别添加至2个经消化液消化处理的T25细胞瓶中后，用8mL无血清培养基1重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份重悬液；将2份重悬液分别和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，均分至4个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到4个长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到4个经消化液消化处理的T75细胞瓶；
步骤四：将中和液以5mL/瓶的添加量分别添加至4个经消化液消化处理的T75细胞瓶中后，用25mL无血清培养基1重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份重悬液；将4份重悬液合并，得到混合液；将混合液和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，均分至8个T225细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到8个长满单层Vero细胞的T225细胞瓶；弃去T225细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以10mL/瓶的添加量添加至T225细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T225细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到8个经消化液消化处理的T225细胞瓶；
步骤五：将中和液以10mL/瓶的添加量分别添加至8个经消化液消化处理的T225细胞瓶中后，用20mL无血清培养基1重悬T225细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到8份重悬液；将8份重悬液合并，并补加无血清培养基1至总体积为4L后，均分至2个10层细胞工厂（购自Thermo Fisher公司，培养体积2L）内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到2个长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，将预热至37℃的消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到2个经消化液消化处理的10层细胞工厂；
步骤六：将中和液以50mL/层的添加量分别添加至在2个经消化液消化处理的10层细胞工厂中后，用1500mL（150mL/层）无血清培养基1重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到2份重悬液；将2份重悬液合并后添加至经前处理的生物反应器中；在生物反应器中补加无血清培养基1至重悬液的总体积为10L后，设置生物反应器内细胞培养的参数为搅拌转速35rpm、温度37℃、pH 7.2、DO（溶解氧含量）50%对生物反应器内的Vero细胞进行培养，Vero细胞培养期间，每24h检测培养液的葡萄糖含量，当葡糖糖含量低于1.5g/L时使用无血清培养基1开始灌流培养，控制培养液的葡糖糖含量不低于1.5g/L；待Vero细胞在生物反应器内培养5d至长满微载体进入平台期后，停止搅拌并静置20min，使微载体充分沉降后排出上清，得到待接种的生物反应器；
步骤七：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）1mL，在病毒液中加入终浓度10μg/mL的重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h，得到病毒活化液；将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至10L病毒维持液中，得到接种液；将接种液添加至待接种的生物反应器中后，设置生物反应器内培养参数为搅拌转速45rpm、温度37℃、pH 7.2、DO（溶解氧含量）50%对生物反应器内的轮状病毒进行培养；待轮状病毒在生物反应器内培养3d至病毒滴度达到峰值后，停止搅拌，得到轮状病毒培养液。
上述方法中，步骤七的轮状病毒培养时间由预实验确定，预实验如下：
在步骤七对轮状病毒连续培养5d，培养期间，每天从生物反应器内对培养液进行取样并使用酶联免疫斑点法（参见文献：Li, Tingdong; Lin, Haijun; Yu, Linqi; Xue,Miaoge; Ge, Shengxiang; Zhao, Qinjian; Zhang, Jun; Xia, Ningshao (2014).Development of an enzyme-linked immunospot assay for determination ofrotavirus infectivity. Journal of Virological Methods, 209, 7-14.）检测病毒滴度，检测结果见图5的培养工艺2。
由图5可知，轮状病毒在生物反应器中生长良好，并在培养第3天病毒滴度达到最高7.89 lgFFU/mL。
比较对比例1~2和实施例1的结果可知，基于微载体的生物反应器培养工艺在病毒滴度上明显优于传统的细胞工厂培养工艺。比较对比例2和实施例1的结果可知，两者在病毒峰值滴度上基本一致，表明基于无动物源性原辅料的生物反应器培养工艺可替代含血清及猪源胰蛋白酶的生物反应器培养工艺，在保证病毒滴度不降低的情况下省略了细胞洗涤的过程，同时排除了因血清、猪源胰蛋白酶等引入外源因子的风险，从根源性上杜绝了轮状病毒疫苗生产过程中的外源因子污染风险。
实施例2：轮状病毒的规模化培养方法
本实施例提供了轮状病毒的规模化培养方法，具体步骤如下：
步骤一：使用含0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS缓冲液将重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）配置成浓度为0.8mg/mL的消化液；使用无血清培养基1将大豆胰蛋白酶抑制剂（购自Gibco公司）配置成浓度为0.5mg/mL的中和液；使用无血清培养基1将重组胰蛋白酶配置成含有4µg/mL重组胰蛋白酶的病毒维持液；取160g微载体（Cytodex-1，购自GE公司）倒入PBS缓冲液中，于室温（25℃）浸泡24h后，用PBS缓冲液洗涤2遍，得到经水化的微载体；将经水化的微载体全部倒入生物反应器（购自南京百帕斯，容积50L，不锈钢）中，校准pH电极后进行灭菌，得到经前处理的生物反应器；
步骤二：取1支Vero细胞（购自ATCC）用10mL无血清培养基1（VP SFM，购自Gibco）复苏至T25细胞瓶内，于37℃培养24h后换液，继续于37℃培养5d至Vero细胞长满单层；弃去T25细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以2mL/瓶的添加量添加至T25细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T25细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到经消化液消化处理的T25细胞瓶；
步骤三：将中和液以2mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T25细胞瓶中后，用8mL无血清培养基1重悬T25细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到重悬液；将重悬液和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，均分至2个T75细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的T75细胞瓶；弃去T75细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以5mL/瓶的添加量添加至T75细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T75细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到2个经消化液消化处理的T75细胞瓶；
步骤四：将中和液以5mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T75细胞瓶中后，用25mL无血清培养基1重悬T75细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到2份重悬液；将2份重悬液分别和无血清培养基1按照体积比1:5混合后，均分至4个T225细胞瓶内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的T225细胞瓶；弃去T225细胞瓶内上清后，将预热至37℃的消化液以10mL/瓶的添加量添加至T225细胞瓶中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将T225细胞瓶内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到4个经消化液消化处理的T225细胞瓶；
步骤五：将中和液以10mL/瓶的添加量添加至经消化液消化处理的T225细胞瓶中后，用20mL无血清培养基1重悬T225细胞瓶内的Vero细胞并吹打均匀，得到4份重悬液；将4份重悬液合并，并补加无血清培养基1至总体积为2L后，添加至1个10层细胞工厂（购自Thermo Fisher公司，培养体积2L）内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，将预热至37℃的消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到经消化液消化处理的10层细胞工厂；
步骤六：将中和液以50mL/层的添加量添加至经消化液消化处理的10层细胞工厂中后，用1500mL（150mL/层）无血清培养基1重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到重悬液；在重悬液中补加无血清培养基1至总体积为12L后，均分至6个10层细胞工厂内，于37℃继续培养5d至Vero细胞长满单层，得到6个长满单层Vero细胞的10层细胞工厂；弃去细胞工厂内上清后，将预热至37℃的消化液以50mL/层的添加量添加至10层细胞工厂中浸泡Vero细胞30s，浸泡结束后，弃去消化液，将10层细胞工厂内的Vero细胞于37℃下消化8min，得到6个经消化液消化处理的10层细胞工厂；
步骤七：将中和液以50mL/层的添加量添加至经消化液消化处理的10层细胞工厂中后，用1500mL（150mL/层）无血清培养基1重悬10层细胞工厂内的Vero细胞并震荡均匀，得到6份重悬液；将6份重悬液合并后添加至经前处理的生物反应器中；在生物反应器中补加无血清培养基1至重悬液的总体积为40L后，设置生物反应器内细胞培养的参数为搅拌转速35rpm、温度37℃、pH 7.2、DO（溶解氧含量）50%对生物反应器内的Vero细胞进行培养，Vero细胞培养期间，每24h检测培养液的葡萄糖含量，当葡糖糖含量低于1.5g/L时使用无血清培养基1开始灌流培养，控制培养液的葡糖糖含量不低于1.5g/L；待Vero细胞在生物反应器内培养5d至长满微载体进入平台期后，停止搅拌并静置20min，使微载体充分沉降后排出上清，得到待接种的生物反应器；
步骤八：取轮状病毒CDC-9株的病毒液（购自美国CDC）3mL，在病毒液中加入终浓度10μg/mL的重组胰蛋白酶（RPT0203，购自上海雅心生物公司）和终浓度为600μg/mL的氯化钙（购自Sigma公司）后，于37℃水浴锅活化1h，得到病毒活化液；将病毒活化液按照0.001MOI的接种量接种至40L病毒维持液中，得到接种液；将接种液添加至待接种的生物反应器中后，设置生物反应器内培养参数为搅拌转速45rpm、温度37℃、pH 7.2、DO（溶解氧含量）50%对生物反应器内的轮状病毒进行培养；待轮状病毒在生物反应器内培养3d至病毒滴度达到峰值后，停止搅拌，得到轮状病毒培养液。
上述方法中，步骤七的Vero细胞培养时间和步骤八的轮状病毒培养时间均由预实验确定，预实验如下：
预实验一：在步骤七对Vero细胞连续培养5d，培养期间，每天从生物反应器内对培养液进行取样拍照，观察Vero细胞在微载体表面的生长情况，观察结果见图6，并对生物反应器内的Vero细胞密度进行计数，计数方法如下：
从生物反应器取样10mL至15mL离心管中，于室温（25℃）下静置10min后弃上清，得到沉淀；在离心管中补加消化液至沉淀的总体积为10mL后，将离心管于37℃消化10min，消化结束后，用吸管吹打离心管中的微载体，得到细胞悬液；吸取10µL细胞悬液用细胞计数板计数；根据计数结果绘制Vero细胞在生物反应器内的生长曲线，绘制结果见图7。
预实验二：在步骤八对轮状病毒连续培养7d，培养期间，每天从生物反应器内对培养液进行取样并使用酶联免疫斑点法（参见文献：Li, Tingdong; Lin, Haijun; Yu,Linqi; Xue, Miaoge; Ge, Shengxiang; Zhao, Qinjian; Zhang, Jun; Xia, Ningshao(2014). Development of an enzyme-linked immunospot assay for determination ofrotavirus infectivity. Journal of Virological Methods, 209, 7-14.）检测病毒滴度，检测结果见图8。
由图6可知，Vero细胞在培养第1天吸附在微载体表面并伸展，之后的2~5天细胞增殖复制并铺满微载体表面。
由图7可知，Vero细胞在微载体表面生长速度较快，并在培养第5天细胞密度达2.65×106cell/mL。
由图8可知，轮状病毒在生物反应器中生长良好，并在培养第3天病毒滴度达到最高7.84 lgFFU/mL。
比较实施例1~2的结果可知，尽管使用了规格更大的50L生物反应器，但是两者的病毒滴度数据具有较高的一致性，说明基于无动物源性原辅料的生物反应器培养工艺具有极好的稳定性，不随着生产规模的扩大而显著下降，可用以轮状病毒疫苗的大规模工业化生产。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (22)

1.一种轮状病毒培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
宿主细胞的制备：使用无血清培养基将宿主细胞逐级扩大培养至添加有微载体的生物反应器中至宿主细胞长满微载体后，排出上清，得到待接种的生物反应器；所述逐级扩大培养过程中，使用无动物源性胰蛋白酶对上一级扩大培养得到的宿主细胞进行消化，使用无动物源性胰蛋白酶抑制剂对经消化的宿主细胞进行中和，以及，使用无血清培养基对经中和的宿主细胞进行重悬以获得供下一级扩大培养的宿主细胞；
轮状病毒的培养：将轮状病毒毒株活化并接种至病毒维持液中后，将经接种的病毒维持液添加至待接种的生物反应器中进行病毒培养，得到轮状病毒培养液；所述病毒维持液为添加有无动物源性胰蛋白酶的无血清培养基；
所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为1~7µg/mL；
所述中和为：在消化后的宿主细胞中添加中和液至浸没宿主细胞，得到经中和的宿主细胞悬液；所述中和液为添加有无动物源性胰蛋白酶抑制剂的无血清培养基；
所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.25~4mg/mL；
所述消化为：将宿主细胞于预热至35~38℃的消化液中浸泡30~60s，浸泡结束后，弃去消化液，将宿主细胞于35~38℃下消化5~10min，得到经消化的宿主细胞；所述消化液为添加有无动物源性胰蛋白酶的缓冲液；
所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.2~1.2mg/mL；
所述轮状病毒毒株活化为：在轮状病毒的病毒液中加入无动物源性胰蛋白酶和氯化钙进行病毒活化，得到病毒活化液；
所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为5~15μg/mL。
2.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在无血清培养基中的浓度为4µg/mL。
3.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在缓冲液中的浓度为0.8mg/mL。
4.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述缓冲液中还添加有金属离子螯合剂。
5.如权利要求4所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.1~0.3g/L。
6.如权利要求5所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂在缓冲液中的浓度为0.2g/L。
7.如权利要求4所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸。
8. 如权利要求4~7任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述缓冲液为浓度0.01~0.05M、pH 7.2~7.6的PBS缓冲液。
9.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂在无血清培养基中的浓度为0.5mg/mL。
10.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶在轮状病毒的病毒液中的浓度为10μg/mL。
11.如权利要求1所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为400~800μg/mL。
12.如权利要求11所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述氯化钙在轮状病毒的病毒液中的浓度为600μg/mL。
13.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶为重组胰蛋白酶。
14.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述无动物源性胰蛋白酶抑制剂为大豆胰蛋白酶抑制剂。
15.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述逐级扩大培养的条件为：于35~38℃培养4~7d。
16.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述经活化的轮状病毒在病毒维持液中的接种量为0.0001~0.1MOI。
17. 如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述病毒培养的条件为：于30~50rpm、35~38℃、pH 7.2~7.6、DO 40~60%下培养2~4d。
18.如权利要求1~3任一项所述的轮状病毒培养方法，其特征在于，所述轮状病毒活化的条件为：于35~38℃孵育0.5~1.5h。
19.权利要求1~18任一项所述的轮状病毒培养方法在制备轮状病毒疫苗中的应用。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述轮状病毒疫苗为轮状病毒灭活疫苗或轮状病毒减毒活疫苗。
21.一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
轮状病毒的培养：使用权利要求1~18任一项所述的轮状病毒培养方法对轮状病毒毒株进行培养，得到轮状病毒培养液；
轮状病毒的后处理：将轮状病毒培养液经载体过滤、宿主细胞破碎、离心澄清、病毒灭活、宿主DNA降解、浓缩以及纯化，得到轮状病毒灭活疫苗。
22.一种轮状病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
轮状病毒的培养：使用权利要求1~18任一项所述的轮状病毒培养方法对轮状病毒减毒株进行培养，得到轮状病毒培养液；
轮状病毒的后处理：将轮状病毒培养液经微载体过滤以及过滤澄清，得到轮状病毒减毒活疫苗。
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