CN115768872A - 可在无血清培养基中悬浮培养的新型Vero细胞系及其制备方法以及使用新型细胞系制备疫苗用病毒的方法 - Google Patents
可在无血清培养基中悬浮培养的新型Vero细胞系及其制备方法以及使用新型细胞系制备疫苗用病毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115768872A CN115768872A CN202080082143.5A CN202080082143A CN115768872A CN 115768872 A CN115768872 A CN 115768872A CN 202080082143 A CN202080082143 A CN 202080082143A CN 115768872 A CN115768872 A CN 115768872A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- cell line
- cell
- vero
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/99—Serum-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2770/24152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种sVERO 7C2细胞系,其为一种衍生自WHO分发的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)且能够在无血清组分下悬浮培养的Vero细胞系。此外,本发明涉及一种用于培养Vero细胞的培养方法及一种使用所述Vero细胞制备疫苗用病毒的方法。
Description
技术领域
本申请要求基于2019年10月27日提交的韩国专利申请第10-2019-0154749号的优先权,并且相应申请的说明书和附图中公开的所有内容都被并入本申请。
本发明涉及一种能够在无血清培养基中悬浮培养的来源于Vero的新型细胞系及其制备方法以及使用所述悬浮培养的细胞制备病毒的方法。
背景技术
随着各种类型疫苗的商业化,已经以各种方式开发了制造疫苗的方法。作为传统的疫苗生产方法,一个代表性的例子是使用受精卵生产流感疫苗。在使用受精卵生产疫苗的情况下,难以提供稳定的受精卵供应,因此存在必须调节疫苗生产的限制。另外,必须在无菌设施中饲养适于产品生产的鸡,由此存在成本增加的问题,并且由于难以纯化卵蛋白衍生的成分,因此还存在卵蛋白过敏症者无法接种的缺点。
作为克服使用受精卵生产疫苗的问题的方法,有一种利用细胞培养生产疫苗的方法。由于该疫苗是通过在能够无限生长的动物细胞大规模培养后接种病毒而生产的,因此它可以在短时间内通过大规模生产来供应,并且具有卵蛋白过敏症者可以接种的优点。
这些动物细胞通常是贴壁细胞,并且使用胎牛血清(FBS)进行培养,但是在这种情况下,产品中可能存在未知的动物来源因子,并且产品间可能存在质量差异。另外,胎牛血清比较昂贵,并且存在被如朊病毒、病毒和支原体等感染性蛋白质感染的风险,因此存在产品制造成本的增加,且不能保证安全性的缺点。因此,在疫苗的生产中,优选不使用动物来源的添加剂以及动物来源的血清。
另一方面,悬浮状态下培养细胞的方法作为细胞培养的另一种方法,与贴壁细胞培养方法相比,具有诸多优点,例如易于大规模培养、简化传代过程、减少人力和空间利用。因此,正在进行大量关于无血清悬浮细胞的开发和使用它们进行的病毒增殖的研究。
Vero细胞系是一种已建立的细胞系,因为其对各种病毒如轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、日本脑炎病毒和登革热病毒具有高度敏感性,因此能够增殖各种病毒。然而,由于Vero细胞系对表面具有非常强的附着力,因此需要非常大面积的培养容器或微载体来进行大规模培养,这在疫苗制造过程中产生了大量成本。另外,需要除去附着在载体上的细胞的步骤。在这种情况下,使用动物来源的胰蛋白酶,并且随着动物来源组分的使用,存在细胞损失和损伤的可能性。
因此,为了通过安全有效的动物细胞培养来生产疫苗,需要能够在无血清培养基中悬浮培养的Vero细胞系,并且本发明人先前已经研究了能够无血清悬浮培养的Vero细胞系并获得了专利(韩国专利第10-1831284号)。
然而,之前注册专利(韩国专利第10-1831284号)的悬浮Vero细胞系Vero Sky7458在细胞增殖和病毒感染性方面显示出的一些效果有限。
发明内容
技术问题
在本研究中,在开发新细胞的过程中,本发明人已经通过选择具有优异功能的细胞的过程,尝试建立了与之前注册的专利细胞系(Vero Sky 7458)相比具有更优异的细胞增殖、细胞形态和病毒增殖的新的悬浮Vero细胞系。
因此,本发明的目的是提供一种Vero细胞系,其可用于疫苗用病毒增殖,并且能够进行无血清培养和悬浮培养以解决由使用血清和贴壁培养所引起的污染或培养效率低下的问题。
本发明的另一个目的是通过提供一种在细胞增殖或病毒增殖能力方面比之前注册的专利细胞系(Vero Sky 7458)具有更优异效果的细胞系,来提供一种更有效的病毒增殖和疫苗生产方法。
更具体地,本发明的一个目的是提供以下实施方式。
实施方式1,Vero细胞系sVERO 7C2(保藏编号KCLRF-BP-00470)。
实施方式2,实施方式1的Vero细胞系中,所述Vero细胞系来源于WHO分发的Vero细胞,其不需要血清来用于细胞生长,且无需附着用载体,可以悬浮培养。
实施方式3,前述实施方式中任意一项的Vero细胞系中,所述细胞系增殖病毒。
实施方式4,使用前述实施方式中任意一项的细胞系制备疫苗用病毒的方法;或前述实施方式中任意一项的细胞系用于制备疫苗用病毒的用途。
实施方式5,前述实施方式中任意一项的方法或用途中,所述病毒选自黄热病毒、寨卡(Zika)病毒、轮状病毒、登革热病毒、流感病毒、麻疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、HSV-1、HSV-2、狂犬病病毒、RS病毒、呼肠孤病毒3型、细小病毒、柯萨奇病毒、腺病毒1-47型、拉沙病毒、大疱性口炎病毒和牛痘病毒组成的组。
实施方式6,前述实施方式中任意一项的方法或用途中,所述病毒为黄热病毒或寨卡病毒。
实施方式7,一种用于制备前述实施方式中任意一项的细胞系的方法,所述细胞系不需要血清来用于细胞生长,并且无需附着用载体,可以悬浮培养,所述方法包括:
(a)准备从WHO获得的Vero细胞;
(b)使所述Vero细胞适应在无血清培养基中生长;以及
(c)使步骤(b)中筛选出的贴壁Vero细胞适应在没有附着用载体的悬浮状态下生长。
实施方式8,一种生产疫苗用的病毒的方法,包括:
(a)将前述实施方式中任意一项的Vero细胞以1×105-9×105个细胞/mL的浓度接种到无血清细胞培养基中;
(b)包括在维持搅拌速度为40-90rpm,且pH为6.5-7.5的培养条件下培养所述细胞的步骤,在转瓶中将所述Vero细胞增殖到5.0×105-4.7×106个细胞/mL的细胞密度;
(c)用黄热病毒或寨卡病毒感染增殖的Vero细胞;
(d)培养被感染的增殖的Vero细胞;以及
(e)从细胞培养组合物中分离黄热病毒或寨卡病毒。
实施方式9,前述实施方式的任意一项所述的方法中,在步骤(b)期间,将新鲜的培养基添加到细胞培养物中,或去除部分培养基并用新鲜培养基替换。
本发明的其他的目的和优点将在以下的发明内容、权利要求和附图中变得更加明显。
技术方案
为了实现上述目的,本发明提供了一种新型悬浮Vero细胞系(韩国细胞系研究基金会保藏编号:KCLRF-BP-00470),其具有优异的病毒感染性,并且与之前注册的专利细胞系Vero Sky 7458相比,生长速率进一步提高了70-100%,该细胞系是一种可以悬浮在无血清培养基中的新型细胞系,并且来源于WHO分发的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)。
此外,为了实现上述目的,本发明提供一种用于制备所述新型悬浮Vero细胞系的方法,该方法包括:
1)使贴壁Vero细胞系适应无血清培养基;
2)选择显示优良生长的细胞;
3)将选择的细胞悬浮在无血清培养基中;以及
4)从悬浮细胞中选择细胞凝集力低、增殖能力优异的细胞并进行连续传代培养。
另外,为了实现上述目的,本发明另一方面提供一种制备疫苗的方法,该方法包括:
1)用病毒感染本发明的新型悬浮Vero细胞系;
2)在悬浮状态下培养病毒感染的细胞;以及
3)从细胞培养物中分离病毒。
此外,为了实现上述目的,本发明提供本发明的新型细胞系的表征结果,包括:
1)评价新型悬浮Vero细胞系的致瘤性;
2)确定新型悬浮Vero细胞系的来源;以及
3)评价新型悬浮Vero细胞系的长期稳定性。
技术效果
本发明提供了一种新型sVERO 7C2细胞系,其可以在无血清下培养并悬浮于培养物中,与Vero Sky 7458细胞系相比具有更快的生长速率,并且可以有效地用于病毒增殖。本发明还可用于使用这些细胞系生产病毒或疫苗。
附图说明
本说明书所附的附图示出了本发明的优选实施例,并且用于进一步理解本发明的技术思想以及本发明的上述内容,因此本发明不应被解释为限于这些附图中描述的内容。
图1是示出Vero Sky 7458和本发明的新型sVERO 7C2细胞系在125mL转瓶中的细胞增殖的图;
图2是示出Vero Sky 7458和本发明的新型sVERO 7C2细胞系在5L生物反应器中的细胞增殖的图;
图3是Vero Sky 7458和本申请的新型sVERO 7C2细胞系中各细胞形状的图像;
图4和5是示出用于评价本发明的新型sVERO 7C2细胞系的长期稳定性的细胞增殖模式和细胞代谢物浓度的图;
图6和7是示出在Vero Sky 7458和本发明的新型sVERO 7C2细胞系中病毒接种的病毒滴度结果的图。
具体实施方式
本发明的新型sVERO 7C2细胞系来源于由WHO分发的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系),其不需要血清来用于细胞生长,并且无需附着用载体,可以悬浮培养。
在本发明中,术语“无血清培养基”是指其中可以培养本发明建立的细胞系的培养基,其中实质上不添加血清,并且术语“实质上不添加”是指含有0.5(v/v)%以下的血清,优选0.1(v/v)%以下,更优选0.01(v/v)%以下,并且最优选完全不含有血清。
无血清培养基可以是选自由Sky FM03(Lonza)、SFM4CHO(Hyclone)、ProVero1(Lonza)、EX-CELL VERO(Sigma)和VP-SFM(Gibco)组成的组中的至少一种,但不限于此,并且可用于培养动物细胞的任何无血清培养基均可以无限制地应用于本发明。
与Vero Sky 7458细胞系相比,本发明的新型sVERO 7C2细胞系优选表现出细胞生长提高70%或100%以上。其可以根据包括一系列步骤的方法制备,从而选择性地选择出具有相对较快的细胞增殖和较低的细胞凝集的细胞。随着细胞生长的改善,病毒感染的细胞数量增加,这有利于病毒或疫苗的大量生产。
此外,本发明的sVERO 7C2细胞系可悬浮于无血清培养基中,与Vero Sky 7458相比,表现出更高的病毒滴度,因此具有更优异的病毒生产能力。另外,使用致瘤性试验、核型分析和PCR的物种验证试验结果显示,本发明的新型细胞系即使在高传代次数(220次传代)下也没有致瘤性,并且显示其源自猴细胞,因此可有利地用于生产疫苗用病毒。
此外,本发明人将从Vero细胞新建立的能够无血清并悬浮培养的细胞系命名为“sVERO 7C2”,并于2019年9月9日在韩国细胞系研究基金会(KCLRF)保藏,保藏编号为KCLRF-BP-00470。
本发明的一个方面提供一种能够进行无血清悬浮培养的新型sVERO7C2细胞系。例如,其可以根据包括以下步骤的方法制备:(a)将贴壁Vero细胞(WHO)解冻,并在含血清培养基中培养;(b)在降低血清含量的同时培养步骤a)获得的细胞,最后在无血清培养基中培养;(c)在步骤b)获得的细胞中选择细胞增殖快的个体;(d)使步骤c)获得的细胞适应以40-90rpm搅拌的方式进行的悬浮培养;(e)在步骤d)获得的适应悬浮培养的细胞中选择细胞凝集力低且增殖能力优异的个体。
以下将详细描述本发明的sVERO 7C2细胞系的制备方法。
步骤(a)
在步骤(a)中,将Vero细胞(WHO)解冻,然后在37℃和5%CO2的环境下在含有10%胎牛血清(FBS)的候选培养基组中培养。
步骤(b)
在步骤(b)中,步骤(a)中培养的细胞通过在3-4天后使用0.25%胰蛋白酶EDTA悬浮在瓶底得到,然后在降低血清含量的同时以附着状态传代培养。当细胞倍增时间小于48小时时,降低血清比例,并最终用无血清培养基替换。
步骤(c)
在步骤(c)中,通过对步骤(b)中获得的细胞进行单细胞克隆来选择细胞。以1个细胞/孔的浓度将细胞接种到96孔板中,并观察细胞增殖模式。具体地,通过在能够适应无血清培养基培养的细胞中选择增殖能力优异的一个细胞,确保来自单个细胞的同质(homogeneous)细胞系,从而确保未来的细胞增殖能力或病毒感染能力的一致性。在本发明中,分别在Vero细胞(WHO)的无血清适应步骤(c)和悬浮培养适应步骤(e)中进行单细胞克隆,并且通过总共2轮的细胞选择过程,能够确保新开发细胞的同质性。这不同于之前对可悬浮培养的Vero细胞的研究。
例如,在96孔板中接种单细胞并培养它们并不容易。即使单个细胞附着于培养容器,细胞增殖也需要4周或更长的时间,或者细胞可能不容易生长并发生退化。因此,为了克服这个问题,使用悬浮培养基来制备适合进行单细胞克隆的培养基并培养单细胞。通过这个过程,选择具有相对较快的细胞增殖的单个个体。
步骤(d)
在步骤(d)中,将所述步骤(c)获得的细胞在转瓶中以40-90rpm搅拌的方式进行悬浮培养。具体地,将步骤(c)的细胞接种到无血清悬浮培养基中,接种浓度为1.0×105-9.0×105个细胞/mL,优选为5.0×105个细胞/mL。在维持40-90rpm、优选60rpm的搅拌速度和约6.5-7.5的pH的培养条件的同时,以3-4天的间隔传代培养细胞以适应悬浮培养。
步骤(e)
在步骤(e)中,将步骤(d)获得的细胞进行如步骤(c)的单细胞克隆,以选择具有细胞凝集力低和增殖能力优异的个体。此时,培养容器使用超低附着96孔板而不是一般的附着培养容器,从而诱导细胞在悬浮状态下增殖。通过两次选择单细胞的过程,可以建立与现有文献中的悬浮Vero相比显示优异性能的悬浮Vero细胞系,并将其命名为“sVERO 7C2”。另外,在转瓶中连续传代培养sVERO 7C2,以检查细胞系的长期稳定性和细胞增殖模式,并进行致瘤性试验等表征。
本发明的另一个方面提供一种使用根据本发明的sVERO 7C2细胞系增殖疫苗用病毒的方法。
可以使用本发明的sVERO 7C2细胞系增殖的病毒包括如黄热病毒、寨卡病毒、轮状病毒、登革热病毒、流感病毒、麻疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、HSV-1、HSV-2、狂犬病病毒、RS病毒、呼肠孤病毒3型、细小病毒、柯萨奇病毒、腺病毒1-47型、拉沙病毒、大疱性口炎病毒和牛痘病毒等。在这些病毒中,本发明的细胞系更适合黄热病毒和寨卡病毒的生产。
在下文中,将通过实施例更详细地描述本发明。然而,以下实施例仅用于说明本发明,并且本发明的范围不受实施例限制。提供本发明的实施例是为了向本领域的普通技术人员更完整地解释本发明。
<实施例1>无血清悬浮培养Vero细胞系的制备
1.1解冻贴壁Vero细胞
将低温保存的贴壁Vero细胞(WHO)解冻,并在37℃、5%CO2条件下,在T-75烧瓶中含有10%血清的EMEM培养基中培养。
1.2适应无血清细胞系的选择
将1.1获得的细胞以3至4天的间隔传代培养。每次传代时检查细胞数,如果细胞倍增时间为48小时或更短,则降低培养基中的血清比例并培养。将培养基中的血清比例降至10%、5%、2%和1%,并重复传代培养,直到最终实现无血清培养。在96孔板中对适应无血清细胞进行单细胞克隆。每周更换一次培养基,培养约3-4周,通过显微镜观察来选择细胞增殖相对较快的组。将具有快速细胞增殖的细胞组在T-烧瓶中扩增并培养。
1.3适应悬浮培养细胞系的选择
将1.2获得的细胞充分扩增后转移至转瓶中进行悬浮培养。搅拌速度为60rpm,在37℃的温度和5%的CO2条件下培养细胞。当培养基的pH降低或细胞生长到一定水平以上时,更换培养基或进行传代培养。适应悬浮培养2个月后,细胞浓度达到约1.5×106个细胞/mL。确认细胞存活率大于90%。在超低附着96孔板中进行单细胞克隆,从而在适应悬浮培养的细胞中确保细胞增殖速率快且细胞凝集力低的单一细胞。培养约3-4周后,通过显微镜观察选择细胞增殖相对较快的组。用超低附着T-烧瓶扩增细胞以选择增殖速率最快的一组,该组命名为“sVERO 7C2”。
<实施例2>细胞系的增殖能力和表征
2.1新型细胞系增殖能力评价
将sVERO 7C2细胞系在转瓶或5L生物反应器中悬浮培养以评价其增殖能力。VeroSky 7458细胞系用作对照组。
悬浮培养的起始细胞浓度为5.0×105个细胞/mL,转瓶的情况下,3-4天后回收细胞,在1200rpm下离心5分钟,并以5.0×105个细胞/mL进行传代培养。
与Vero Sky 7458细胞系相比,本发明制备的sVERO 7C2细胞系在转瓶中显示出约1.7倍的细胞增殖率,在生物反应器中显示出约2倍的细胞增殖率。
2.2新型细胞系的长期传代稳定性
将sVERO 7C2细胞系在转瓶中传代培养4个月,通过分析细胞增殖、细胞存活率和细胞代谢物来评价长期传代的稳定性。本发明的细胞系在4个月的培养期间显示出相同水平的细胞增殖率,并且可以确定90%或更高的细胞存活率。此外,可以确认细胞代谢物的浓度处于相似模式。
2.3新型细胞系的表征
对本发明的新型sVERO 7C2细胞系进行致瘤性试验。根据欧洲药典的致瘤性评价指南,在非临床评价中心的QuBEST BIO株式会社进行试验,并且临床病理学结果确认本发明的细胞系即使在高传代次数(220次传代)下也没有致瘤性。
另外,通过进行核型分析和物种鉴别试验(PCR),确认了本发明的细胞系是猴来源的细胞。
此外,通过进行无菌和支原体阴性试验,证明其没有被细菌污染。
<实施例3>病毒增殖能力比较
使用本发明的新型sVERO 7C2细胞系在悬浮培养条件下增殖病毒。使用VeroSky7458作为对照组来比较病毒增殖能力。本试验中使用的病毒是黄热病毒和寨卡病毒,培养条件如下。
细胞浓度:5.0×105个细胞/mL
培养规模:125mL转瓶
搅拌速度:60rpm
培养条件:37℃,5%CO2,湿润
培养期:4天(黄热病毒),6天(寨卡病毒)
在相同的起始细胞浓度和病毒接种浓度下进行病毒感染性试验,以比较两种细胞系之间的病毒增殖能力。接种后培养病毒,同时确认细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)和细胞存活率。黄热病毒培养4天,寨卡病毒培养6天,回收培养上清并测定病毒滴度。通过噬菌斑法(Plaque assay)测定两种病毒的滴度。结果显示,在本发明的新型细胞系中增殖的病毒滴度优于用作对照组的Vero Sky 7458。此外,发现sVERO 7C2具有比Vero Sky7458更高的细胞增殖能力,因此在病毒感染时待感染的细胞数很大,由此可以更有效地生产大容量的病毒。
[保藏编号]
保藏单位的名称:韩国细胞系研究基金会(KCLRF)
保藏编号:KCLRF-BP-00470
保藏日期:2019年9月9日
PCT/RO/134表
Claims (9)
1.一种Vero细胞系sVERO 7C2(保藏编号:KCLRF-BP-00470)。
2.根据权利要求1所述的Vero细胞系,其特征在于,所述细胞系来源于WHO分发的Vero细胞,所述细胞系不需要血清来用于细胞生长,且无需附着用载体,可以悬浮培养。
3.根据权利要求1所述的Vero细胞系,其特征在于,所述细胞系增殖病毒。
4.一种使用权利要求1所述的细胞系制备疫苗用病毒的方法。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述病毒选自黄热病毒、寨卡病毒、轮状病毒、登革热病毒、流感病毒、麻疹病毒、日本脑炎病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、HSV-1、HSV-2、狂犬病病毒、RS病毒、呼肠孤病毒3型、细小病毒、柯萨奇病毒、腺病毒1至47型、拉沙病毒、大疱性口炎病毒和牛痘病毒组成的组。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述病毒为黄热病毒或寨卡病毒。
7.权利要求1所述细胞系的制备方法,其特征在于,所述细胞系不需要血清来用于细胞生长,并且无需附着用载体,可以悬浮培养,该方法包括:
(a)准备从WHO获得的Vero细胞;
(b)使所述Vero细胞适应在无血清培养基中生长;以及
(c)使步骤(b)中选出的贴壁Vero细胞在没有附着用载体的悬浮状态下生长。
8.一种生产疫苗用病毒的方法,其特征在于,该方法包括:
(a)将权利要求1的Vero细胞以1×105-9×105个细胞/mL的浓度接种到无血清细胞培养基中;
(b)在转瓶中使Vero细胞增殖到5.0×105-4.7×106个细胞/mL的细胞密度,其中包括在维持搅拌速度为40-90rpm且pH为6.5-7.5的培养条件下培养所述细胞的步骤;
(c)用黄热病毒或寨卡病毒感染增殖的Vero细胞;
(d)培养被感染的增殖的Vero细胞;以及
(e)从细胞培养组合物中分离黄热病毒或寨卡病毒。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,在所述步骤(b)期间,将新鲜培养基添加到细胞培养物中,或者去除部分培养基并用新鲜培养基替换。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2019-0154749 | 2019-11-27 | ||
KR1020190154749A KR20210065697A (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규한 Vero 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 신규 세포주를 이용한 백신용 바이러스 제조 방법 |
PCT/KR2020/016866 WO2021107612A1 (ko) | 2019-11-27 | 2020-11-25 | 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규한 vero 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 신규 세포주를 이용한 백신용 바이러스 제조 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115768872A true CN115768872A (zh) | 2023-03-07 |
Family
ID=76128860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080082143.5A Pending CN115768872A (zh) | 2019-11-27 | 2020-11-25 | 可在无血清培养基中悬浮培养的新型Vero细胞系及其制备方法以及使用新型细胞系制备疫苗用病毒的方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220411760A1 (zh) |
EP (1) | EP4067480A4 (zh) |
JP (1) | JP2023505101A (zh) |
KR (1) | KR20210065697A (zh) |
CN (1) | CN115768872A (zh) |
WO (1) | WO2021107612A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114774372B (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-30 | 北京民海生物科技有限公司 | 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070111309A1 (en) * | 2005-10-04 | 2007-05-17 | Daelli Marcelo G | Vero cell line adapted to grow in suspension |
MA41506A (fr) * | 2015-02-13 | 2017-12-19 | Takeda Vaccines Inc | Procédés de production de virus pour produire des vaccins |
KR101831284B1 (ko) | 2017-06-26 | 2018-02-22 | 에스케이케미칼 주식회사 | 무혈청 배지에서 부유배양 되는 Vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 |
CN107267443B (zh) * | 2017-07-27 | 2020-06-05 | 郑州爱科生物科技有限公司 | 一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株及其应用 |
-
2019
- 2019-11-27 KR KR1020190154749A patent/KR20210065697A/ko active IP Right Grant
-
2020
- 2020-11-25 WO PCT/KR2020/016866 patent/WO2021107612A1/ko unknown
- 2020-11-25 EP EP20893843.1A patent/EP4067480A4/en active Pending
- 2020-11-25 US US17/780,093 patent/US20220411760A1/en active Pending
- 2020-11-25 JP JP2022531606A patent/JP2023505101A/ja active Pending
- 2020-11-25 CN CN202080082143.5A patent/CN115768872A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4067480A1 (en) | 2022-10-05 |
WO2021107612A1 (ko) | 2021-06-03 |
US20220411760A1 (en) | 2022-12-29 |
JP2023505101A (ja) | 2023-02-08 |
EP4067480A4 (en) | 2024-01-03 |
KR20210065697A (ko) | 2021-06-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4698112B2 (ja) | 無血清培養かつ浮遊培養可能な細胞及び当該細胞を用いたワクチン用ウイルスの製造法 | |
US9447383B2 (en) | MDCK-derived cell lines adapted to serum-free culture and suspension culture and method for preparing vaccine virus using the cells | |
JP3754088B2 (ja) | ウィルス増殖のための不死化細胞系 | |
KR101831284B1 (ko) | 무혈청 배지에서 부유배양 되는 Vero 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 | |
CN105950544B (zh) | 全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法 | |
US11629338B2 (en) | Method for acclimating and suspending Vero and second order production process for virus | |
CN107460156B (zh) | 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用 | |
CN113528453B (zh) | 一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用 | |
JPWO2006095431A1 (ja) | 動物由来の成分なしで培養可能である細胞株及びその作出方法、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法 | |
CN115768872A (zh) | 可在无血清培养基中悬浮培养的新型Vero细胞系及其制备方法以及使用新型细胞系制备疫苗用病毒的方法 | |
KR20040012739A (ko) | Hcv 감염에 유용한 조성물 및 방법 | |
CN114774351A (zh) | 牙鲆卵原干细胞培养液及牙鲆卵原干细胞体外培养方法及应用 | |
CN110669722A (zh) | 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法 | |
JP2015083008A (ja) | イヌ腎細胞の浮遊培養物においてウイルスを複製する方法 | |
JP6971994B2 (ja) | ワクチン生産のための無血清合成培地中のmdck浮遊細胞株 | |
KR101753596B1 (ko) | 바이러스 대량 생산용 신규 세포주 및 이의 제작 방법 | |
Ahamed et al. | Adaptation of Newcastle disease virus (NDV) on Vero cell line | |
JP6933643B2 (ja) | Mdck細胞の培養方法 | |
CN116515728A (zh) | 无弹状病毒的Sf9-PT细胞及其应用 | |
Lawal et al. | Propagation and molecular characterization of bioreactor adapted very virulent infectious bursal disease virus isolates of Malaysia | |
CN117402813B (zh) | 一种猫肾crfk贴壁细胞系的建立及悬浮驯化与应用 | |
KR20190019776A (ko) | 무혈청배지 부유배양에 적응된 광견병 바이러스 생산 세포주 | |
JP6609110B2 (ja) | 繊維材質支持体を用いたウイルス培養法 | |
CN117821401A (zh) | 一种使用鸡胚原代细胞生产病毒的方法 | |
CN115322955A (zh) | 一种全悬浮无血清型pk-15细胞的驯化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |