CN116515728A - 无弹状病毒的Sf9-PT细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一株无弹状病毒的Sf9‑PT细胞及其应用。该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202334。本申请筛选的Sf9‑PT细胞株未被弹状病毒污染、能够实现高密度培养、病毒增殖水平更高且病毒包装稳定性更持久；该细胞株能够作为改良的替代宿主，用于生物制品及疫苗的的开发和商业化生产，能够更加安全地规避Sf‑RV病毒污染造成的潜在危险。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一株无弹状病毒的Sf9-PT细胞及其应用。
背景技术
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是重组蛋白表达的强大平台，已用于开发各种研究性生物制品和生产病毒疫苗。降低生物制品污染风险的综合策略仍然适用于产品安全，这包括产品制造中涉及的细胞系和细胞培养试剂等起始材料。由于昆虫在系统发育上与人类相距甚远，因此研究人员通常认为与使用哺乳动物细胞相比，使用昆虫来源的细胞系生产生物制品能更好地避免一些与外源病毒相关的安全问题。
Sf9细胞具有蛋白表达高、易于操作等优点，已成为真核蛋白表达应用最广泛的昆虫细胞系之一。然而，近年来美国生物制剂研究与评价中心发现，所有测试的Sf细胞均被一种新的外来病毒污染，即Sf-弹状病毒(Spodoptera frugiperda rhabdovirus，Sf-RV)。这一发现引起了人们对昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产的生物制剂安全性的担忧。虽然目前没有证据表明Sf-RV病毒对人类或动物构成威胁，但是在生物制品制备过程中一旦发现任何外源病毒污染，都必须采取一切办法去除，保证生物制品的安全性。本实验室对Gibco来源的Sf9细胞进行了Sf-RV病毒检测，结果表明也污染了这种病毒。
目前，中国发明专利申请CN110423726A提供了一株无弹状病毒污染的Sf9-ZY细胞；中国发明专利申请CN114807009A涉及一株不依赖血清的无弹状病毒污染的Sf9-RF细胞；现有的无弹状病毒污染的Sf9细胞在生长特性、增殖水平、杆状病毒扩增能力以及病毒包装稳定性等方面均与商品化Sf9细胞无明显差异。
发明内容
基于此，本申请提供了一株高密度培养、杆状病毒扩增能力更高、包装稳定性更持久的无弹状病毒污染的Sf9-PT细胞。
根据本申请的一个方面，提供了一株无弹状病毒的Sf9-PT细胞，该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202334。
本申请还提供一种上述保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞的应用，具体技术方案如下：
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在昆虫杆状病毒表达系统中的应用。
在其中一些实施例中，所述Sf9-PT细胞用于包装腺相关病毒。
在其中一些实施例中，所述Sf9-PT细胞用于表达重组蛋白。
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在研究杆状病毒基因组的结构与功能中的应用。
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在研究真核基因表达调控机制中的应用。
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在制备生物制品中的应用。
保藏编号为CCTCC NO:C202334的Sf9-PT细胞在制备重组病毒疫苗中的应用。
在其中一些实施例中，所述病毒疫苗包括重组新型冠状病毒疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和禽流感疫苗。
基于上述技术方案，本申请至少具有如下有益效果：
(1)本申请筛选的Sf9-PT细胞株未被弹状病毒污染，该细胞株能够作为改良的替代宿主，用于生物制品及疫苗的的开发和商业化生产，能够更加安全地规避Sf-RV病毒污染造成的潜在危险；
(2)具有高密度培养的特性，从而能够提高AAV的包装水平及外源蛋白表达量，降低成本；
(3)重组杆状病毒在Sf9-PT细胞株中具有更高的增殖水平；
(4)Sf9-PT细胞株包装AAV5病毒的能力能稳定到第30代。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中凝胶电泳检测图，(a)为使用引物对G1/G2进行检测，(b)为使用引物对Mono1/Mono2进行检测，(c)为使用引物对Mono1i/Mono2i进行检测；
图2为实施例2中细胞生长曲线图，(a)为细胞活率，(b)为细胞密度，(c)为细胞直径，(d)为细胞倍增时间；
图3为实施例3中重组杆状病毒在Sf9细胞和Sf9-PT细胞中增殖的感染滴度统计图；
图4为实施例4中Sf9细胞和Sf9-PT细胞包装AAV5的基因组滴度统计图；
图5为实施例5中不同代次的Sf9-PT细胞包装AAV5的基因组滴度统计图。
本申请提供了一株无弹状病毒的草地贪夜蛾Sf9细胞衍生系Sf9-PT细胞，该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202334。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本申请的一些实施方式提供了一株无弹状病毒的Sf9-PT细胞，该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202334。
该细胞株通过如下方法筛选得到：
(1)准备细胞悬液：使用培养3-4天处于对数生长期的商业化Sf9细胞，此时活细胞密度为5×106cells/ml-10×106cells/ml，细胞活率≥90％。
(2)稀释细胞悬液：使用含有20％ FBS(胎牛血清)的ExpiSfTM CD Medium将细胞悬液梯度稀释至100cells/ml并接种于96孔板中，0.1ml/孔，封口膜封口避免培养基挥发。
(3)将步骤(2)中的96孔板在27℃恒温培养箱中静置培养7天，观察细胞集落形成情况。
(4)培养20天后，向步骤(3)中含有细胞集落的孔中加入100μl ExpiSfTM CDMedium(含有20％ FBS)，移液器轻轻吹打混匀，然后将96孔板置于27℃恒温培养箱中继续静置培养。
(5)培养7天后将96孔板中的细胞转移至6孔板中继续培养(2ml含有20％ FBS的ExpiSfTM CD Medium)，轻轻晃动6孔板，使细胞均匀分散。
(6)将步骤(5)中的细胞培养7天，收集一定量的细胞沉淀进行弹状病毒基因检测。筛选到的无弹状病毒污染的细胞株即为Sf9-PT。
上述Sf9-PT细胞的传代培养方法包括如下步骤：
(7)将步骤(5)中的细胞培养7天后传代至T25方瓶中，置于摇床中培养。培养4天后将其传代至125ml摇瓶中，培养3天或4天传代一次，传代时活细胞密度为5.0×106cells/ml～10.0×106cells/ml，接种密度为0.6×106cells/ml或1.0×106cells/ml。
(8)将培养3天后的细胞取样计数，细胞活率＞90％，300g室温离心5min，使用预先准备好的细胞冻存液重悬细胞，1.0×107cells/ml，1.5ml/管，置于液氮罐中长期保存。
本发明还提供了上述Sf9-PT细胞株的应用，包括：(1)在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。(2)在昆虫杆状病毒表达系统中的应用；具体地，本申请的Sf9-PT细胞株能够用于包装腺相关病毒(AAV)、表达重组蛋白等。(3)在研究杆状病毒基因组的结构与功能中的应用。(4)在研究真核基因表达调控机制中的应用。(5)在制备生物制品中的应用；具体地，本申请的Sf9-PT细胞株能够用于制备重组病毒疫苗，包括重组新型冠状病毒疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和禽流感疫苗等；可以理解地，本申请的Sf9-PT细胞株也可以用于制备其他未列举的重组疫苗。
本申请提供的Sf9-PT细胞株未被弹状病毒污染，能够作为改良的替代宿主，用于生物制品及疫苗的的开发和商业化生产，更加安全地规避Sf-RV病毒污染造成的潜在危险；能够实现高密度培养，从而提高AAV的包装水平及外源蛋白表达量，降低成本；重组杆状病毒在本申请的Sf9-PT细胞株中具有更高的增殖水平；本申请的Sf9-PT细胞株包装AAV5病毒的能力能稳定到第30代。
下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
实施例1无弹状病毒高密度培养细胞株Sf9-PT的筛选
(1)准备细胞悬液并铺板
1.1使用培养3～4天处于对数生长期的商业化Sf9细胞(Gibco来源)，此时活细胞密度为5×106cells/ml～10×106cells/ml，细胞存活率≥90％。
1.2取步骤1.1中的细胞悬液，使用ExpiSfTM CD Medium(含有20％ FBS)将细胞悬液梯度稀释至100cells/ml，接种于96孔板中，0.1ml/孔，封口膜封口避免培养基挥发。
1.3将步骤1.2中的96孔板在27℃恒温培养箱中静置培养。
(2)单细胞传代培养
2.1每隔7天，观察步骤1中96孔板中细胞集落形成情况。
2.2培养20天后，向步骤2.1中含有细胞集落的孔中加入100μl含有20％FBS(胎牛血清)的ExpiSfTM CD Medium，移液器轻轻吹打混匀，然后将96孔板置于27℃恒温培养箱中继续静置培养。
2.3取步骤2.2中培养7天后的细胞转移至6孔板中继续培养(2ml含有20％FBS的ExpiSfTM CD Medium)，轻轻晃动6孔板，使细胞均匀分散，然后将6孔板置于27℃恒温培养箱中继续静置培养。
2.4将步骤2.3中的细胞培养7天，收集一定量的细胞悬液进行弹状病毒基因检测，记录弹状病毒阳性孔和阴性孔，并对弹状病毒阴性孔中的细胞株进行传代。
2.5将步骤2.4中的弹状病毒阴性细胞弃除培养基后，加入无血清ExpiSfTM CDMedium轻轻重悬细胞，传代至T25方瓶中，补加培养基至10ml，置于27℃，95rpm摇床中培养。
2.6将T25方瓶中弹状病毒阴性细胞培养4天后，传代至125ml摇瓶中，培养3天或4天传代一次，传代时活细胞密度为5.0×106cells/ml～10.0×106cells/ml，接种密度为0.6×106cells/ml或1.0×106cells/ml。5次稳定传代后，收集一定量的细胞进行弹状病毒基因检测。将筛选到的无弹状病毒高密度培养细胞株命名为Sf9-PT。该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C202334。
2.7无弹状病毒细胞库建立。将培养3天后的细胞取样计数，细胞活率＞90％，室温条件下300g离心5min，使用预先准备好的细胞冻存液重悬细胞，1.0×107cells/ml，1.5ml/管，置于液氮罐中长期保存。
(3)Sf9-PT细胞株的弹状病毒检测
对商业化Sf9细胞和上述筛选得到的Sf9-PT细胞株，进行弹状病毒检测，分别收集第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代的细胞和无细胞培养上清液，采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA和病毒基因组RNA。以RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板，加入PCR预混液和检测弹状病毒L蛋白和G蛋白的特异性引物(Mono1/2；G1/G2)。经过PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳鉴定是否存在弹状病毒污染。用于PCR扩增的引物序列信息如表1所示。
表1引物序列信息
弹状病毒的具体检测步骤如下：
3.1提取弹状病毒RNA：分别收集第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代的Sf9-PT细胞和无细胞培养上清液，根据试剂盒说明书提取细胞总RNA和病毒基因组RNA。
3.2反转录cDNA：根据TIANScript II RT Kit试剂盒的产品说明书合成cDNA。
3.3PCR扩增：使用1μl cDNA与10μl Q5 Hot Start High-Fidelity DNA-PolMaster Mix混合，上下游引物(分别为Mono1和Mono2)各取1μl，加入Nuclease-free water补至20μl，混合均匀。将混合后的PCR反应体系放入PCR仪进行扩增。PCR反应程序为：98℃预变性30s；循环30次：98℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。初级PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
3.4巢式PCR：以嵌套引物Mono 1i和Mono 2i为引物，以步骤3.3中合成的初级PCR产物为模板，在相同条件下进行巢式PCR反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
3.5判定标准：引物对Mono1/2和Mono1i/2i均用于检测弹状病毒的L蛋白，目的条带大小分别为792bp和500bp，引物对G1/2用于检测弹状病毒的G蛋白，目的条带大小为722bp。在琼脂糖凝胶上依据2000bp DNA Ladder所指示的条带大小判断，如果PCR产物大小分布符合以上结果，则判定Sf9细胞被弹状病毒污染。
凝胶电泳结果如图1所示，Sf9细胞和无细胞培养上清液应用引物对G1/G2(凝胶电泳结果如图1a所示)均检测出目的条带，Sf9-PT的第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代细胞和无细胞培养上清液应用引物对G1/G2均未检测出目的条带。Sf9细胞和无细胞培养上清液应用引物对Mono1/Mono2(凝胶电泳结果如图1b所示)均检测出目的条带，Sf9-PT第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代细胞和无细胞培养上清液均未检测出目的条带。Sf9细胞和无细胞培养上清液应用引物对Mono1i/Mono2i(凝胶电泳结果如图1c所示)均检测出目的条带，Sf9-PT第5代、第10代、第15代、第20代、第25代、第30代、第35代细胞和无细胞培养上清液均未检测出目的条带。筛选出的Sf9-PT细胞和无细胞培养上清液应用三对引物均未检测出目的条带，表明本申请筛选得到的Sf9-PT细胞株未被弹状病毒污染。
实施例2Sf9-PT细胞的增殖特性
分别培养Sf9-PT细胞和商业化Sf9细胞，各取30ml细胞密度为0.6×106cells/ml的细胞悬液接种于125ml摇瓶中，放置于95rpm恒温摇床上，培养温度27℃，每24h取样一次，直至细胞衰亡。利用细胞计数仪检测活细胞数、细胞活率和细胞直径。
结果如图2所示，Sf9-PT细胞株和Sf9细胞的生长周期基本一致，细胞倍增时间均在26h～37h之间，细胞直径均为15μm～17μm。但是Sf9-PT的最高细胞密度优于Sf9：培养至第7天时，Sf9细胞密度达到峰值(约20×106cells/ml)随后进入下降期；而Sf9-PT的细胞密度仍呈上升趋势，最大细胞密度可达到20×106cells/ml～25×106cells/ml。此外，在培养第7天后Sf9的细胞活力明显下降，而Sf9-PT的细胞活力下降趋势相对缓慢。上述结果表明Sf9-PT细胞可以高密度培养，且在培养7天后细胞活性明显优于商业化Sf9细胞。
实施例3杆状病毒在Sf9-PT细胞株中的增殖水平
(1)重组供体质粒构建：合成序列GFP克隆至供体质粒pFastBac Dual，命名为pFastBac-GFP；合成序列Rep、Cap克隆至供体质粒pFastBac Dual，命名为pFastBac-RepCap。
(2)取步骤(1)中所得的pFastBac-GFP和pFastBac-RepCap质粒1ng加入DH10Bac感受态细胞中，轻轻混匀。冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min后加入800μl LB液体培养基(无抗生素)，37℃，220rpm摇床振荡4h。取100μl菌液涂布在含有kanamycin/gentamicin/tetracycline/IPTG的LB固体平板上。37℃培养箱正置30min待菌液被培养基吸收后再倒置培养24h～48h。可观察到明显的蓝白斑时，挑选白斑进行PCR鉴定，鉴定引物为M13-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG)和M13-R(核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示：AGCGGATAACAATTTCACACAGG)。PCR扩增条件为：98℃预变性30s；循环30次：98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸3min；72℃延伸5min。将阳性重组杆状病毒穿梭质粒(Bacmid)分别命名为Bacmid-Rep2Cap5和Bacmid-ITR-GOI-ITR，并转染Sf9-PT细胞得到无弹状病毒污染的重组杆状病毒，分别命名为Bac-Rep2Cap5和Bac-ITR-GOI-ITR。
(3)用步骤(2)中所得的重组杆状病毒(Bac-Rep2Cap5和Bac-ITR-GOI-ITR)按照MOI0.05分别接种于Sf9-PT细胞和Sf9细胞细胞密度为5×106cells/ml，接种置于27℃、95rpm摇床中培养96h，收集培养基上清液，采用流式细胞仪检测重组杆状病毒的感染滴度，步骤如下：
(a)调整细胞密度为1.25×106cells/ml，取800μl(即1×106个细胞)接种于24孔细胞培养板中；
(b)24孔细胞培养板中分别加入100μl四个梯度的病毒稀释液(1E-02、5E-03、2.5E-03、1.25E-03)，同时加入空白对照组(无病毒的ExpiSfTM CD培养基)；
(c)将24孔板置于27℃培养箱过夜培养，转速设置为95rpm。
(d)制备Wash buffer：制备含2％FBS的PBS缓冲液。
(e)重组杆状病毒感染细胞16±2h后，取出24孔细胞培养板，将细胞培养液转移至EP管，于300g离心5min，弃上清。
(f)洗涤细胞：每管加入1ml Wash buffer，混匀细胞，室温300g离心5min，弃上清；
(g)抗体孵育：用100μl已稀释的APC-gp64抗体重悬细胞，室温避光孵育30min，室温300g离心5min，弃上清；
(h)洗涤细胞：每管加入1ml Wash buffer，混匀细胞，室温300g离心5min，弃上清，用200μl Wash buffer重悬细胞；
(i)使用流式细胞仪创建实验，输入样品名，设置流速，收集目标细胞数，设置停止条件，设置相关的圈门策略，创建图形和门控，画出相关的峰图或散点图，并采集数据。
病毒颗粒滴度计算：选择阳性率介于1％～30％之间的组别用于滴度计算。
滴度计算公式：Titer(ivp/ml)＝重组杆状病毒感染前细胞数目×细胞阳性率×稀释倍数/每孔重组杆状病毒稀释液体积。
病毒颗粒滴度统计结果如图3所示，重组杆状病毒在Sf9细胞中增殖的感染滴度仅为5×108ivp/ml左右；而重组杆状病毒在Sf9-PT细胞中增殖的感染滴度均能达到9×108ivp/ml～10×108ivp/ml。上述结果表明，与Sf9细胞相比，重组杆状病毒在Sf9-PT细胞中的增殖水平明显提高；感染能力更强。
实施例4Sf9-PT细胞株包装AAV5水平
取P0代重组杆状病毒Bac-Rep2Cap5和Bac-ITR-GOI-ITR，按照MOI2：2接种至Sf9-PT和Sf9细胞悬液中，细胞密度5×106cells/ml，培养体积为25ml，将125ml摇瓶置于27℃，95rpm摇床中培养72h。收集细胞悬液，通过qPCR检测AAV5基因组滴度。用于qPCR的引物序列信息如表2所示。
表2qPCR引物序列信息
| 引物名称 | 引物编号 | 序列信息(5'-3') |
| ITR-F | SEQ ID NO.9 | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR-R | SEQ ID NO.10 | CGGCCTCAGTGAGCGA |
结果如图4所示，Sf9-PT和Sf9细胞在相同条件下包装AAV5的基因组滴度均在5×1010vg/ml～6×1010vg/ml。上述结果表明Sf9-PT细胞株和商业化Sf9细胞在包装AAV5病毒的能力方面无明显差异。
实施例5不同代次Sf9-PT细胞株包装AAV5的稳定性试验
取P0代重组杆状病毒Bac-Rep2Cap5和Bac-ITR-GOI-ITR，按照MOI2：2接种于第5代、第10代、第15代和第30代Sf9-PT细胞悬液中，细胞密度为5×106cells/ml，培养体积为25ml，将125ml摇瓶置于27℃、95rpm摇床中培养72h。收集细胞悬液，通过qPCR检测AAV5基因组滴度。
结果如图5所示，P0-Bac感染不同代次Sf9-PT细胞得到AAV样品的基因组滴度均在4.5×1010vg/ml～7×1010vg/ml之间。上述结果说明，Sf9-PT细胞株包装AAV5病毒的能力能稳定到第30代。
综上所述，相比于商业化Sf9细胞，Sf9-PT细胞株的增殖特性与病毒包装能力更优异，并且具有高密度培养特性，同时还规避了使用商业化Sf9细胞或其他Sf细胞系带有外源弹状病毒的风险，消除了生物制品潜在的安全隐患。所以，本申请筛选的Sf9-PT细胞株具有作为Sf9或其他Sf细胞系替代宿主的潜力，用于昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产生物制品，保证生物制品的安全性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一株无弹状病毒的Sf9-PT细胞，该细胞已于2023年03月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:C202334。
2.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在构建毒理学、生理学、分子遗传学或发育生物学的生物研究模型中的应用。
3.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在昆虫杆状病毒表达系统中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Sf9-PT细胞用于包装腺相关病毒。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Sf9-PT细胞用于表达重组蛋白。
6.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在研究杆状病毒基因组的结构与功能中的应用。
7.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在研究真核基因表达调控机制中的应用。
8.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在制备生物制品中的应用。
9.如权利要求1所述的无弹状病毒的Sf9-PT细胞在制备重组病毒疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒疫苗包括重组新型冠状病毒疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和禽流感疫苗。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117050928A (zh) * | 2023-10-12 | 2023-11-14 | 简达生物医药(南京)有限公司 | 无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法 |
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2023
- 2023-03-29 CN CN202310323427.4A patent/CN116515728A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117050928A (zh) * | 2023-10-12 | 2023-11-14 | 简达生物医药(南京)有限公司 | 无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法 |
| CN117050928B (zh) * | 2023-10-12 | 2024-03-05 | 简达生物医药(南京)有限公司 | 无弹状病毒污染的Sf9细胞株及其高效筛选方法 |
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