CN115466711A - 一种获得无病毒细胞系的方法及其所获得的无病毒细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法,还提供了根据上述方法建立的源自病毒污染的生物体或细胞群体的无病毒细胞系。示例性建立无病毒细胞系的方法包括从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞,清洗并重悬后分离成单个细胞或多个细胞,将分离所得到的单个细胞或多个细胞在包含利巴韦林的细胞培养基中培养扩增并形成单细胞克隆或多细胞克隆,检测所述细胞克隆或细胞培养基中是否存在病毒,将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的细胞培养基中继续培养扩增,从而获得无病毒细胞系。
Description
技术领域
本发明涉及用于获得无病毒细胞系的方法,以及应用所述方法获得的无病毒细胞系,所述无病毒细胞系源自被病毒污染的生物体或细胞群体。
背景技术
昆虫细胞广泛用于重组蛋白的表达,通常用作重组杆状病毒载体的宿主,也可用于质粒介导的瞬时转染或稳定的遗传转化。昆虫细胞可用于科研表达蛋白质,以及制造人用生物制品和兽医生物制品。杆状病毒-昆虫表达系统(BICS)是一类应用广泛的真核表达系统,是以杆状病毒为外源基因载体,昆虫细胞为受体的表达系统,具有安全、高效、容量大、表达量高、表达产物能够进行折叠和修饰等特点,已被生物医药领域广泛应用。最近发现几种用于重组蛋白表达的昆虫细胞系被持续感染外源病毒,这就对这些感染可能如何影响使用这些细胞系进行的研究提出了疑问。此外,这些发现引起了人们对使用这些细胞系生产的生物制品的安全性的密切关注。
Sf-弹状病毒(Sf-Rhabdovirus)是在同一时间由三个不同团队在不同的Sf(Spodoptera frugiperda)细胞系中独立发现的。Sf-弹状病毒是一种典型的弹状病毒,其单(-)链基因组的大小接近13.5kb,依次编码典型的弹状病毒核蛋白(N),磷蛋白(P),基质(M),糖蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)。G和L之间,有一个额外的可读框,命名为“X”并编码一种假定的病毒孢子素,感染的Sf细胞连续传代后,X基因可能丢失,而Sf-弹状病毒的体外感染不需要该基因。
新的不含外源病毒的昆虫细胞系已被分离出来作为改进的研究工具和更安全的生物制造平台使用。为了完全去除Sf9(Spodoptera frugiperda 9)细胞中的Sf-弹状病毒,格里科贝克公司采用核苷类药物处理由若干个细胞组成的起始培养物,进一步扩增培养获得了无Sf-弹状病毒的细胞系,其最终使用的药物为6-氮杂尿苷(专利申请号CN201680071306.3)。但该专利申请在实际筛选中尝试了施用多种药物共同抑制的方法,施用多种抗病毒药物会影响细胞代谢及生物合成过程,加重细胞损伤,影响筛选后细胞重组及表达病毒的能力。虽然另有其它的研究在不加入抗病毒药物的情况下通过筛选获得了生长特性相似,活力更优的细胞系(专利申请号CN201910317758.0),但由该种方法获得无病毒细胞系的效率很低。
因此,对于能够有效和稳定地从病毒污染的生物体或细胞群体中获得并建立无病毒细胞系的方法,以及不含污染病毒的细胞系,且该细胞系能够保持其原有的细胞生物学特性及功能,例如,细胞活率和表达外源重组蛋白或产生重组病毒的能力等,在本领域仍然存在需求。
发明内容
本发明是基于发明人的如下发现:从病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系时,所使用的抗病毒药物种类及其浓度、起始培养时的细胞数量对于建立无病毒细胞系的效率以及所建立的细胞系能否保持其细胞生物学特性和功能是至关重要的。
因此,本发明提供了一种能有效和稳定地从被病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法,以及应用该方法建立的细胞系,其中所述细胞系在缺乏病毒的同时仍能保持相关的细胞生物学特性及功能(例如细胞活率、产生重组病毒或表达重组蛋白的能力等)。
本发明一方面提供了一种从病毒污染的生物体或细胞群体中获得和建立无病毒细胞系的方法,包括如下步骤:从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞,清洗并重悬上述细胞后,将其分离成单个细胞或多个细胞,将上述单个细胞或多个细胞置于含有一定浓度利巴韦林的细胞培养基中培养一段时间,形成单细胞克隆或多细胞克隆。从上述细胞克隆中取出部分细胞及上清培养基,检测病毒是否存在,将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的培养基中继续培养扩增,获得无病毒细胞系。
在另一方面,本发明中所述的污染生物体或细胞群体的病毒是Sf-弹状病毒。在另一方面,本发明中所述的病毒污染的生物体是昆虫,优选草地贪夜蛾;病毒污染的细胞群体是已建立的细胞系或细胞株,例如商购或市售的细胞系,优选昆虫细胞系,更优选Sf细胞系(例如Sf9细胞系,Sf21细胞系等)。
因此,本发明的所述细胞系可以直接或间接来源于草地贪夜蛾,或者可以来源于商购或市售的Sf9细胞系(在本发明中可以用SF-Rha表示,意为含有Sf-弹状病毒的Sf9细胞系)。
进一步地,本发明在另一方面提供了一种无病毒的Sf细胞系(在本发明中称之为SF-RVN细胞系),所述细胞系来源于商购或市售的Sf9细胞系,并由以上方法建立。与含有Sf-弹状病毒的原始Sf9细胞系相比,本发明建立的细胞系缺乏Sf-弹状病毒,并且具有与原始Sf9细胞相同或基本相同的细胞活率、细胞直径、细胞结团率及细胞倍增时间,并且与Sf9细胞具有相同或基本相同,甚至更优的杆状病毒传代稳定性和重组AAV产量。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明,并非对本发明的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何等同替换,均属于本专利的保护范围。
附图说明
图1.细胞活率比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
图2.细胞直径比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
图3.细胞结团率比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
图4.细胞倍增时间比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
图5.杆状病毒的传代稳定性(目标基因组滴度与杆状病毒基因组滴度的比值)比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
图6.重组AAV病毒产量比较,其中SF-RVN表示筛选出的无Sf-弹状病毒的Sf9细胞,SF-Rha表示有Sf-弹状病毒污染的Sf9细胞。
具体实施方式
为了便于理解本发明内容的各个实施方案,特定术语的含义如下所示。
细胞系:是指由一个或几个共同祖先细胞扩增得到的细胞群体,包括但不限于由单个分离细胞扩增得到的细胞群体。
建立的细胞系:是指在合适条件下进行培养时具有无限期增殖潜力的细胞系。与生物体中天然存在的细胞相比,此类细胞系已在体外经历了变化(例如转化等)。通过从第一细胞系分离单细胞,然后扩增所分离的细胞以获得的第二细胞系有时被称为第一细胞系的亚克隆。
源自生物体:是指直接或间接地从生物体获得。细胞可以直接来源于生物体,例如从生物体获得组织或器官,然后裂解该组织或器官以获得原代细胞。细胞还可以间接来源于生物体,例如从源自生物体的细胞系中分离出单细胞,然后扩增分离的单细胞以建立并获得细胞系。
本发明中所述的生物体可以是昆虫,特别是鳞翅目昆虫。鳞翅目昆虫是指包括蝴蝶、蛾等在内的鳞翅目昆虫的任何成员,其成虫具有四个宽或披针形的翅膀,通常覆盖有微小重叠和颜色鲜艳的鳞片,其幼虫为毛虫。鳞翅目昆虫包括但不限于,草地贪夜蛾、粉纹夜蛾或家蚕。
单细胞克隆,是指由单个细胞培养扩增后形成的细胞群体。多细胞克隆,是指多个细胞培养扩增后形成的细胞群体。
“包含”或“包括”同义,是开放性术语,不排除其它未列举的组分、要素、步骤等的存在。例如,“包含”组分A、B和C的组合物可以由组分A、B和C组成;或者组合物不仅可以包含组分A、B和C,还可以包含一种或多种其它组分。
术语“基本相同”或“基本相当”是指相对于特定条件或参数在百分之十范围内的变化或者没有统计学上的显著差异。例如,但不限于,由本发明的方法建立获得的细胞系与原始的细胞或细胞系(例如Sf9细胞系)在相同条件下繁殖并用相同的方法测定细胞活率时,基于统计学分析,所建立的细胞系的活率在原始细胞活率的90%至110%之间的范围内,或者二者没有统计学差异;或者当所建立的细胞系和原始细胞或细胞系在相同条件下繁殖并用相同的方法测定平均细胞直径时,基于统计学分析,所建立的细胞系的平均直径在原始细胞平均直径的90%至110%之间的范围内,或者二者没有统计学差异。
术语“检测病毒的存在”、“检测Sf-弹状病毒的存在”以及相关术语在本说明书中被广泛使用。本领域技术人员应当理解,本领域中存在许多已知的检测技术可以用于本发明。用于检测病毒的示例性技术包括,聚合酶链式反应(PCR)、逆转录反应(RT)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、与巢式PCR联合的RT-PCR、定量PCR(Q-PCR),与定量PCR联合的RT-PCR(定量RT-PCR或RT-QPCR),多种探针杂交技术、电子显微技术以及本领域已知的多种基于抗体的检测技术,例如ELISA测定。检测技术还包括但不限于噬斑测定和细胞病变效应(CPE)观察,以及BLAST检索等生物信息学技术等。
在本发明的示例性实施方案中,获得缺乏病毒的细胞系的方法包括:从被病毒污染的生物体或细胞群体(包括但不限于细胞系或细胞株)中获得细胞,将上述细胞清洗并重悬后,分离成单个细胞或多个细胞,将上述单个细胞或多个细胞置于含有一定浓度的利巴韦林的细胞培养基中培养一段时间后形成单细胞克隆或多细胞克隆,从上述细胞克隆中取出部分细胞或培养基检测病毒是否存在,将检测后不存在病毒的细胞克隆接种至不含利巴韦林的培养基中继续培养扩增,最终获得无病毒污染的细胞系。
在某些实施方案中,本发明中所述的污染生物体或细胞群体的病毒是Sf-弹状病毒。在一些实施方案中,本发明中所述的病毒污染的生物体是昆虫,优选草地贪夜蛾;病毒污染的细胞群体是已建立的细胞系或细胞株,例如商购或市售的细胞系,优选昆虫细胞系,更优选Sf9或Sf21细胞系。
在某些实施方案中,单个细胞是指仅有1个细胞;多个细胞是指含有若干个细胞,包括但不限于,2-20个细胞,优选3-10个细胞,优选4-6个细胞,更优选为5个细胞。
在某些实施方案中,分离成单个细胞或多个细胞的方法包括但不限于:有限稀释克隆(连续稀释的克隆)、在软琼脂中克隆细胞并随后挑取细胞集落、细胞分选、激光捕获显微切割(LCM)、使用微量移液管手动捕获、微流体或使用显微操作器。
在某些实施方案中,在含有利巴韦林的细胞培养基中,利巴韦林的浓度为10μg/ml,20μg/ml,50μg/ml或100μg/ml,优选为50μg/ml。
在某些实施方案中,检测病毒(包括但不限于Sf-弹状病毒)是否存在的方法是本领域熟知的,包括但不限于RT-PCR、巢氏PCR、RT-PCR联合巢氏PCR或RT-QPCR。
在某些实施方案中,将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含利巴韦林的培养基中扩增培养一段时间后,取扩增培养的部分细胞及上清培养液再次验证病毒是否被彻底清除。
在某些实施方案中,建立的无病毒的细胞系源自被病毒(包括但不限于Sf-弹状病毒)污染的原代细胞。在某些实施方案中,被病毒污染的原代细胞来自于被病毒污染的生物体(包括但不限于草地贪夜蛾)。
在另一些实施方案中,建立的无病毒的细胞系源自被病毒(包括但不限于Sf-弹状病毒)污染的细胞群体(包括但不限于市售或商购的细胞系)。在某些实施方案中,被病毒污染的细胞群体是被Sf-弹状病毒污染的Sf细胞系,包括但不限于Sf9或Sf21细胞系。
在某些实施方案中,根据本发明的方法建立的无病毒细胞系(在本发明中称之为SF-RVN细胞系)具有如下优点:当在相同条件下培养和孵育时(如本说明书实施例中描述),无病毒细胞系与病毒污染的原始细胞或细胞群体相比,具有相同或基本相同的细胞活率、倍增时间、平均细胞直径、细胞结团率。在某些实施方案中,当在相同条件下(如本说明书实施例中描述)进行杆状病毒传代稳定性检测、及重组腺相关病毒(AAV)产量比较时,根据本发明的方法建立的无病毒细胞系和病毒污染原始细胞或细胞群体具有基本相当或更优的效果。
本领域技术人员可以理解,适于特定细胞类型生长和孵育的材料和条件是本领域已知的,其获取来源也是本领域技术人员已知的。所述来源包括但不限于细胞培养手册、商业细胞库或培养基供应商。使用本领域已知的方法也可以容易地确定合适的细胞培养条件。
下面的实施例仅仅是说明性的,而非意在限制本发明。
以下实施例中所使用的技术,除非特别说明,均为本领域内技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备、试剂等,除非是本说明书特别注明,本领域技术人员均可以通过公共途径获得。
实施例1被病毒污染的原始昆虫细胞系的复苏与培养
取一支冻存的Sf9细胞(Life Technologies公司),37℃水浴中快速融化,在125ml摇瓶中加入15ml ESF AF培养基(Expression systems,99-300-01),将冻存管中的细胞转移到摇瓶中,轻轻摇动混匀,将摇瓶置于27℃-29℃,110rpm-150rpm的摇床上培养。之后在ESF AF培养基中维持常规培养。
实施例2获得缺乏Sf-弹状病毒的Sf细胞系(SF-RVN)的方法
1、细胞稀释:
对实施例1中培养的Sf9细胞进行计数,如表1:
表1
取细胞悬液离心后清洗细胞,用培养基重悬,计数,记录细胞密度与细胞活率。取重悬后的细胞,加入培养基进行20倍稀释。
2、利巴韦林(Ribavirin)抑制培养
将上述细胞通过有限稀释分离成多个细胞(5个细胞/孔)或单个细胞(1个细胞/孔),分别用不同浓度的利巴韦林(厂家:sigma,货号:R9644)进行病毒抑制培养。具体分组及方法如下:
A:终浓度5个细胞/孔,病毒抑制剂:利巴韦林(终浓度10μg/ml);
B:终浓度5个细胞/孔,病毒抑制剂:利巴韦林(终浓度50μg/ml);
C:终浓度1个细胞/孔,病毒抑制剂:利巴韦林(终浓度10μg/ml);
D:终浓度1个细胞/孔,病毒抑制剂:利巴韦林(终浓度20μg/ml);
E:终浓度1个细胞/孔,病毒抑制剂:利巴韦林(终浓度50μg/ml)。
将多个细胞或单个细胞经不同浓度的利巴韦林处理约一个月,期间进行换液及细胞扩增,分别形成多细胞克隆或单细胞克隆,取样进行Sf-弹状病毒检测,检测方法如实施例3所述。
检测结果如表2所示:在1个细胞/孔,利巴韦林终浓度为10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的筛选条件下均未筛选到不含Sf-弹状病毒的细胞株;在5个细胞/孔,利巴韦林终浓度为10μg/ml的条件下也未筛选到不含Sf-弹状病毒的细胞株;最后在5个细胞/孔,利巴韦林终浓度为50μg/ml的条件下筛选到了2株无Sf-弹状病毒细胞株。将此两株细胞转移至利巴韦林缺乏的培养基中,在扩大培养至T25方瓶时,命名为SF-RVN P0代细胞,并且在P2代对贴壁细胞进行悬浮驯化培养,同时进行去血清驯化培养,并随后维持在Sf900ⅡSFM培养基中培养。
表2
每孔细胞个数 | 利巴韦林终浓度(μg/ml) | Sf-弹状病毒阴性细胞(株) |
5 | 10 | 0 |
5 | 50 | 2 |
1 | 10 | 0 |
1 | 20 | 0 |
1 | 50 | 0 |
实施例3Sf-弹状病毒检测方法
为了验证SF-RVN细胞系中是否存在Sf-弹状病毒,从不同传代水平的SF-RVN细胞及上清中提取RNA,并采用RT-PCR对Sf-弹状病毒进行了检测(参见:Ma等,J.Virol.88:6576-85,2014)。
为了更加准确和精确地检测Sf-弹状病毒的存在,基于Sf-弹状病毒L序列(Genbank:KF947078.1)设计了(Primer Premier 6.25)一组引物和探针,采用一步法定量RT-PCR(RT-QPCR)方法定量检测Sf-弹状病毒的含量。首先分别提取细胞及培养上清中的RNA,然后采用TaqMan RNA-to CT 1-Step试剂盒(ABI/Thermo,4392938),根据试剂盒的操作说明进行一步法RT-QPCR检测Sf-弹状病毒。
实施例4SF-RVN细胞系缺乏Sf-弹状病毒
分别从不同传代水平的SF-RVN细胞及上清中提取RNA,采用上述方法检测Sf-弹状病毒是否存在。当采用RT-PCR检测时,在所筛选出的SF-RVN细胞中并未检测出Sf-弹状病毒(结果未显示)。
采用RT-QPCR检测时,检测结果如表3所示。由上述结果可知,用利巴韦林筛选到的SF-RVN细胞在利巴韦林缺乏的培养基中经过40代连续传代培养,期间每传代5次时,取部分SF-RVN细胞及上清分别提取RNA,并进行Sf-弹状病毒检测,均未检测到Sf-弹状病毒,而作为阳性对照的原始Sf9细胞中均检测到了Sf-弹状病毒。
以上结果表明,SF-RVN细胞在利巴韦林缺乏的培养基中经过40代的传代培养,其细胞及上清培养基中,均未检测到Sf-弹状病毒,表明SF-RVN细胞是无Sf-弹状病毒的,且Sf-弹状病毒不会随细胞传代和扩增而出现。
表3
实施例5支原体检测
采用PCR法检测SF-RVN细胞及培养上清中的支原体,所用支原体检测试剂盒为EZ-PCR-Mycoplasma-Test-Kit(Biological Industries,20-700-20),具体方法步骤参照试剂盒说明书。结果表明,筛选到的SF-RVN细胞均未检测到支原体污染。
实施例6细胞生长状态、形态学与细胞直径
SF-RVN细胞或SF-Rha细胞(表示含有Sf-弹状病毒的Sf9细胞)每次传代固定起始密度为1.5×106cells/ml,体积为80ml,110rpm-150rpm,27℃-29℃培养。每次传代时,检测细胞活率、细胞直径、细胞结团率、并比较细胞倍增时间。
检测结果显示:在细胞培养期间SF-RVN细胞和SF-Rha的细胞活率(图1)、细胞直径(图2)、细胞结团率(图3)以及细胞倍增时间(图4)均无显著性差异。这些结果表明,筛选到的SF-RVN细胞与Sf9细胞的一般特性是保持一致的。
实施例7杆状病毒扩增传代稳定性
调整SF-RVN细胞及SF-Rha细胞(表示含有Sf-弹状病毒的Sf9细胞)至一定密度,取适量细胞加入到六孔板中,27-30℃培养细胞至贴壁,然后加入携带EGFP外源基因的bacmid进行细胞转染,转染一定时间后,收获P0代杆状病毒毒种。P0代毒种按一定比例扩传至P1、P2、P3、P4代,检测每一代毒种的目标序列(EGFP)基因组滴度和杆状病毒基因组滴度。
具体方法:针对目标序列EGFP设计特异性引物探针,通过Q-PCR技术检测目标序列EGFP基因组滴度。另外,针对杆状病毒本身保守序列设计引物探针,通过Q-PCR技术检测杆状病毒基因组滴度。然后计算目标序列(EGFP)基因组滴度与杆状病毒基因组滴度的比值,并进行比较(比值越高表示传代越稳定)。
检测结果如图5所示,筛选到的SF-RVN细胞与SF-Rha细胞具有基本相当,甚至更优的杆状病毒传代稳定性。
实施例8重组AAV病毒产量
将SF-RVN细胞和SF-Rha细胞(表示含有Sf-弹状病毒的Sf9细胞)培养到一定细胞密度时,分别加入一定体积的杆状病毒毒种(携带AAV-Rep/AAV-Cap/EGFP外源基因),110rpm-150rpm,27℃-29℃培养72h-120h,收获AAV病毒。检测AAV病毒的基因组滴度,并进行比较。
具体方法:取适量纯化AAV样品进行DNase I失活后,稀释适当倍数,然后进行Q-PCR反应,所用引物为针对EGFP的特异性引物探针。
检测结果如图6所示,筛选出的SF-RVN细胞与SF-Rha细胞在重组AAV病毒产量方面基本相当,甚至更优。由此可见,筛选获得的去除Sf-弹状病毒的SF-RVN细胞生产重组AAV病毒的能力并未受到任何影响。
实施例9转录组及蛋白质组检测
利用高通量测序方法(北京市计算中心)检测SF-RVN细胞的转录组,并利用质谱法(北京欧米科斯生物技术有限公司)检测SF-RVN细胞的蛋白质组。
结果显示,在SF-RVN细胞中未检测到Sf-弹状病毒mRNA(表4),也未检测到Sf-弹状病毒的蛋白(表5)。
表4
样本名称 | SF-Rha细胞 | SF-RVN细胞 |
匹配Reads条目 | 894699 | 0 |
表5
S9 | Rha-N | Rha-P | Rha-G | Rha-M | Rha-L | |
SF-RVN细胞 | + | - | - | - | - | - |
SF-Rha细胞 | + | + | + | + | + | + |
总之,利用利巴韦林筛选到了无Sf-弹状病毒的细胞系(SF-RVN细胞),此结论是基于高灵敏度的RT-PCR和RT-QPCR的结果,使用上述方法证明了,至少经40代传代培养的SF-RVN细胞及上清培养基中不具有可检测的Sf-弹状病毒。另外,经高通量测序细胞中Sf-弹状病毒mRNA的水平以及经质谱法检测细胞中Sf-弹状病毒蛋白的水平,进一步证实了此结论。
对筛选出的SF-RVN细胞进行功能研究,发现SF-RVN与原始的Sf9细胞在细胞活率、细胞直径、细胞结团率、细胞倍增时间等细胞基本生长特性上保持一致,并且均未被支原体污染。SF-RVN细胞与原始的Sf9细胞在杆状病毒传代稳定性、重组AAV病毒产量等方面均基本相当,甚至更优,表明本发明的方法并未影响Sf9细胞的活性。
通过以上结果表明,筛选出的SF-RVN细胞完全能够取代Sf9细胞,成为安全的蛋白、病毒、疫苗的生产细胞。
Claims (24)
1.一种从源自病毒污染的生物体或细胞群体中建立无病毒细胞系的方法,包括:
从病毒污染的生物体或细胞群体中获得细胞,清洗并重悬后分离成单个细胞或多个细胞;
将分离得到的单个细胞或多个细胞在包含利巴韦林的细胞培养基中培养扩增,并形成单细胞克隆或多细胞克隆;
取出所述细胞克隆或所述细胞培养基的一部分以检测病毒是否存在;
将检测病毒不存在的细胞克隆接种于不含有利巴韦林的细胞培养基中继续培养扩增,从而获得无病毒细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述病毒包括Sf-弹状病毒。
3.根据权利要求1或2中所述的方法,其中所述生物体是昆虫,所述细胞群体是昆虫细胞系。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述昆虫包括鳞翅目昆虫。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粉纹夜蛾或家蚕。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞系源自病毒污染的原代细胞。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞系源自病毒污染的Sf细胞系。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述病毒污染的Sf细胞系包括Sf21细胞或Sf9细胞,并且其中所述病毒包括Sf-弹状病毒。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述检测方法包括:(a)RT-PCR;(b)RT-PCR和巢式PCR;(c)定量RT-PCR;或(d)基于抗体的检测技术。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中分离成单个细胞或多个细胞的方法包括:有限稀释克隆、在软琼脂中克隆细胞并随后挑取细胞集落、细胞分选、激光捕获显微切割(LCM)、使用微量移液管手动捕获、微流体或使用显微操作器,优选为有限稀释克隆。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述多个细胞为2-20个细胞,优选3-10个细胞,优选4-6个细胞,更优选为5个细胞。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述利巴韦林浓度选自10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述多个细胞为5个细胞,利巴韦林浓度为50μg/ml。
14.一种源自病毒污染的生物体或细胞群体的无病毒细胞系,所述细胞系由权利要求1-13中任一项所述方法获得。
15.根据权利要求14所述的细胞系,其中所述细胞系源自污染病毒的昆虫。
16.根据权利要求15所述的细胞系,其中所述细胞系源自鳞翅目昆虫。
17.根据权利要求16所述的细胞系,其中所述鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾、粉纹夜蛾或家蚕。
18.根据权利要求17所述的细胞系,其中所述细胞系源自草地贪夜蛾细胞系。
19.根据权利要求18所述的细胞系,其特征在于缺乏Sf-弹状病毒。
20.根据权利要求19所述的细胞系,其特征还在于当所述细胞系与被病毒污染的原始细胞或细胞群体在相同条件下繁殖时,与所述被病毒污染的原始细胞或细胞群体具有相同或基本相同的细胞活率、平均细胞直径、细胞结团率和倍增时间。
21.根据权利要求19所述的细胞系,其特征还在于,当在相同条件下进行杆状病毒感染时,所述细胞系与被病毒污染的原始细胞或细胞群体相比,具有相同或基本相同,甚至更优的病毒传代稳定性。
22.根据权利要求19所述的细胞系,其特征还在于,当在相同条件下进行重组AAV包装时,所述细胞系与被病毒污染的原始细胞或细胞群体相比,具有相同或基本相同,甚至更优的重组AAV产量。
23.权利要求14-22任一项中所述的无病毒细胞系在杆状病毒-昆虫表达系统中的应用。
24.权利要求14-22任一项中所述的无病毒细胞系在表达外源重组蛋白或生产重组病毒中的应用。
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